Summary
Här beskriver vi ett nytt tillvägagångssätt för att åstadkomma traumatisk hjärnskada i huvudet i Drosophila melanogaster . Vår metod har fördelen att direkt leverera repetitiva effekter med justerbar styrka till huvudet ensamt. Ytterligare undersökning av ryggradssystemet kommer att bidra till att belysa patogenesen av kronisk traumatisk encefalopati.
Abstract
Kronisk traumatisk encefalopati (CTE) är en etablerad neurodegenerativ sjukdom som är nära associerad med exponering för repetitiv mild traumatisk hjärnskada (mTBI). De mekanismer som är ansvariga för dess komplexa patologiska förändringar förblir i stor utsträckning missbildande trots en ny konsensus för att definiera de neuropatologiska kriterierna. Här beskriver vi en ny metod för att utveckla en modell av CTE i Drosophila melanogaster ( Drosophila ) i ett försök att identifiera nyckelgenerna och vägarna som leder till den karakteristiska hyperfosforylerade tauackumuleringen och neuronal död i hjärnan. Justerbar kraftpåverkan för att åstadkomma mild sluten skada levereras direkt till flyghuvudet och utsätter huvudet för snabb acceleration och retardation. Vår metod eliminerar potentiella problem som är förknippade med andra Drosophila mTBI-modeller ( t.ex. djurdöd kan orsakas av skador påAndra delar av kroppen eller till inre organ). Den mindre arbets- och kostnadskrävande djurvården, den korta livslängden och de omfattande genetiska verktygen gör fruktflugan idealisk för att studera CTE-patogenesen och göra det möjligt att utföra storskaliga genombredda fram-genetiska och farmakologiska skärmar. Vi förutser att den pågående karaktäriseringen av modellen kommer att skapa viktiga mekaniska insikter om förebyggande av sjukdomar och terapeutiska metoder.
Introduction
Kronisk traumatisk encefalopati (CTE) har nyligen erkänts som en distinkt neurodegenerativ sjukdom, separat från andra tauopatier såsom Alzheimers sjukdom 1 . Till skillnad från Alzheimers sjukdom och andra vanliga tauopatier - vars viktigaste riskfaktorer fördjupar ålder och familjemedlemshistoria av demens, innebär CTE, som indikeras av dess namn, en nära association med en historia av hjärntrauma som troligen ses hos kontaktsporter, Som boxare och fotbollsspelare, liksom i militära veteraner 2 , 3 , 4 , 5 . Det är tänkt att initieras av upprepade hjärnskakande och subkoncussiva slag mot huvudet. Patienter kan presentera symtom och tecken som kognitiva underskott, förändringar i humör och beteende och rörelsedysfunktion, som överlappar signifikant med Alzheimers sjukdom, frontotemporalDemens, Lewy kropps demens och Parkinsons sjukdom 6 . Däremot avslöjar post mortem undersökningar av hjärnvävnad ett distinkt mönster av hyperfosforylerad tau-ackumulation som omger små blodkärl vid djupet av kortikala sulci, en patognomonisk egenskap som inte observeras i de andra degenerativa tillstånden 7 . Hittills är dock väldigt lite känt om patogenesen som leder till sjukdoms manifestation. Detta beror till stor del på bristen på en trogen djurmodell - bara nyligen har gnagare modeller genererats 5 , 8 . Dessa modellorganismer har nackdelarna med kostnadsintensiv vård och en relativt lång livslängd, som inte är väl lämpade för neurodegenerativa sjukdomsstudier.
Jämfört med däggdjurs motsvarigheter är ryggradslösa djur som Drosophila ett utmärkt alternativ, med kostnadseffektivt underhåll,Omfattande verktyg för dissektering av genetiska determinanter och relativt kort livslängd 9 . Anmärkningsvärt delar flyga och mänskliga hjärnor evolutionärt konserverade molekylära och cellulära vägar, såväl som anatomiska likheter 10 , 11 , 12 . Två geniala Drosophila- modeller för att studera traumatisk hjärnskada har tidigare rapporterats 13 , 14 . Den första "High Impact Trauma" (HIT) -enheten som designats av Katzenberger och kollegor innehöll flyktiga flugor i en plastflaska som var bunden till den fria änden av en metallfjäder 13 , 15 . När plastflaskan lutades upprätt och släpptes slogs den på en polyuretanplatta och gav trauma till flugorna när de studsade till flaskans vägg och återstod. Däremot designade Barekat och kollegor en annan leveransmetod ossIng i Omni Bead Ruptor-24-homogeniseringsplattformen 14 . Fluor var oförmögna med CO2 och placerades i ett 2 ml skruvkapsrör som fästes på homogenisatorn och utsattes för förprogrammerade skakningsbetingelser. En fördel med att använda vävnadshomogenisatorsystemet är att försökspersonen kunde modulera intensiteten av skada, skadans varaktighet och antal skador. Båda regimerna har emellertid samma nackdel: Primär skador på huvudet är slumpmässigt tillförda när det gäller slagplats och styrka. Dessutom resulterade båda metoderna i betydande dödlighet, orsakad av oundviklig säkerhetsskada på andra delar av kroppen och inre organ. Här beskriver vi en ny metod för att framkalla mTBI i fruktflugor. Vår apparat består av en gasdriven ballistisk slagverk. Jämfört med befintliga Drosophila- modellerna 14 , 15 har vår metod den unika fördelen att leverera mätningHållbar påverkan, som endast riktas mot det fria flyghuvudet, vilket möjliggör en noggrann kontroll av olika faktorer, såsom slaghinder, tidsintervallet mellan påverkan och det totala antalet påverkningar som uppstår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering av strejkanordningen ( figur 1 )
- Ta bort kolven från en 1 ml tuberkulinspruta. Klipp fatet på 1 ml märket.
- Ta bort en aerosolbarriär (3 mm höjd x 4 mm diameter) från en 200 μl pipettspets och använd den som en stötfångare. Placera provkroppen inuti sprutkolven. Tryck försiktigt på fatet för att flytta stötfångaren till spetsänden, med den platta sidan som täcker munstycksöppningen.
- Fäst tappänden på plaströret som är ansluten till koldioxid (CO 2 ) flödesregulatorn på en Drosophila anestesi station.
- Håll tunnan vertikalt och kläm fast den till ett standardklämhållarstativ så att stötfångaren stannar i botten av tunnan.
- Ändra en 200 μL pipettspets för att göra flyghållaren.
- Klipp 4 mm från spetsen för att göra en öppning på 0,8 mm, vilket gör det möjligt att bara flyhuvudet exponeras.
OBS: ThoRax och alla andra delar av flygkroppen kommer att ligga inom pipettspetsen.
- Klipp 4 mm från spetsen för att göra en öppning på 0,8 mm, vilket gör det möjligt att bara flyhuvudet exponeras.
- Ändra en 1000 μL pipettspets och en 1 ml sprutnålkåpa för att göra kontakten.
- Klipp av 44 mm från spetsens öppning. Ta en 6 mm längd av en 1 ml sprutnållock och tryck den ordentligt i det återstående segmentet av 1000 l pipettspetsen.
2. Strike-enhetens funktion
- Bedöva en enda 2-dagig vuxen kvinnlig fluga med hjälp av CO2 på en flygplatta.
- Överför det försiktigt till flyghållaren med en fin borste. Tryck lätt på hållaren så att flughuvudet ses utanför spetsänden. Om flodproblemet exponeras utanför spetsen, klistra det försiktigt inuti spetsen med en sprutad 1 ml sprutnål.
OBSERVERA: Se till att flyga proboscis inne i hållaren. Annars kan flugan dö av en sugproblemsskada. - Dra åt flygelenLängs till sprutkolven med kontaktdonet så att huvudet är vänd nedåt.
- Ställ gastrycket vid 100 kPa. Justera flödeshastigheten enligt experimentdesignen.
- Snabbt vrid flödesregulatorns växelströmbrytare på och av så att slagaren träffar flyghuvudet en gång.
- Lyft flyghållaren och flytta den över en flygplatta. Vänd flyghållaren och tryck försiktigt på sidan för att låta flyga ut. Lämna flygen i en tom flaska för att återhämta sig.
3. Videostödd rörelsespårning
- Fyll en petriskål med 6 cm diameter med transparent kiselelastomer för att göra spårningsarenan. Lämna ett 3 mm utrymme mellan kisel och skålen så att flugorna kan gå fritt men inte flyga.
- Bedöda fyra flugor från antingen skam eller behandlad grupp varje gång och placera dem i arenan. Lämna flugorna vid 22 ° C i 1 h.
- Placera en laddningskopplad enhet (CCD) -kamera över arenorna och spela in i 5 minuter.
- Analysera de inspelade rörelsebanorna med hjälp av Ctrax-programvaran (fritt tillgänglig från Caltech) 16 . Exportera spårdata i ett programmeringsspråk (t.ex. Matlab) -kompatibelt format och analysera data baserat på avstånd som reste per ram 17 . Beräkna medelavståndet för varje flygning och kombinera det med alla andra inspelade flugor / grupp för att få en genomsnittlig kumulativ avstånd som reste av populationen av filer i samma grupp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att upprätta en CTE-modell med vuxen Drosophila bestämde vi effektiviteten hos vår enhet vid åstadkommande av en enda skada på huvudet. För att eliminera variationer relaterade till genotyp, kön eller ålder brukade vi använda 2-dagars Canton-S WT kvinnliga flugor i experimentet. Vi kunde enkelt styra slagarens styrka genom att reglera flödeshastigheten för CO 2 vid ett konstant gastryck på 100 kPa. Fluor utsatta för en enda strejk vid högsta flödeshastighet (15 l / min) uppvisade minimala externa defekter ( Figur 2 ). Både de yttre ögonen och munstycket verkade intakta. Ändå fann vi att en flödeshastighet på 15 L / min var akut dödlig, vilket resulterade i mindre än en 10% överlevnadshastighet inom 24 timmar ( Figur 3A ). Däremot resulterade exponering för en strejk på 10 eller 7,5 l / minut i 61,1% respektive 96,3% överlevnad, medan överflödena överlevde alla flygningar vid 5,0 och 2,5 l / min flödenDär 24 h ( figur 3A ). Därför standardiserade vi våra framtida studier till 5,0 L / min CO 2 flödeshastigheten. Efter en strejk på 5,0 l / min flyger flygningar gradvis sin rörlighet inom 4 minuter ( Figur 3B ). Under de närmaste 2 d återställs deras lokomotivfunktion, mätt med gångförmåga, långsamt till normalt ( Figur 3C ). Som en preliminär bedömning påminner dessa fenotyper om de som presenteras av personer som har upplevt hjärnskakning eller milda nivåer av trauma 18 . Patienter som lider av traumatisk hjärnskada uppvisar ofta en progressiv försämring av muskelrörelser och för tidig död.
För att utvärdera de långsiktiga effekterna av flera hjärnskador, tillämpade vi ett mTBI-protokoll av fem på varandra följande strejk vid 5,0 L / min flödeshastighet, med 24 h återhämtningsperioder mellan varje strejk. Att undersöka E mTBI: s inverkan på rörelsefunktionen använde vi ett videostödd rörelsespårningssystem för att analysera flygmotorns beteende. Efter åldring av flugorna 20 d efter behandling uppvisade den mTBI-behandlade gruppen minskad gångaktivitet och avståndet reste jämfört med sham-gruppen ( Figur 4 A & B ; sham-grupp: 6,49 ± 0,72, n = 28 mot behandlad grupp: 4,3 ± 0,47, n = 32; p <0,05). För att undersöka om upprepade hjärnskador har några kroniska effekter på överlevnad bestämde vi livslängden för flugor som utlöste mTBI-protokollet. Behandlade flugor (n = 100) visade i Figur 4C , jämfört med sham-gruppen (n = 129), en väsentligt reducerad median livslängd (36,9 ± 2,7 Vs 26,3 ± 0,9 d) och signifikant minskad livslängd (49,3 ± 2,4 Vs 34,7 ± 1,4 d).
1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55602 / 55602fig1.jpg "/>
Figur 1 . Diagram över strejkenheten. Enheten använde material som är lättillgängliga i ett Drosophila- lab: 1) 200 μL pipettspets, 2) 1 ml tuberkulinspruta, 3) stötfångare, 4) anslutningsrör anslutet till en Drosophila anestesi station och 5) kontakt för att dra åt spetsen På sprutan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 . Mild avslutad huvud traumatisk skada. En enda strejk vid det högsta gasflödet led inte till uppenbar yttre skada på huvudet, kroppen eller bilagorna. ( A &B ) Strike-inflicted flyga. ( C & D ) Sham flyga. Sham-flugorna genomgick exakt samma procedurer som den behandlade gruppen, inklusive överföringar på och utanför flyghållaren, förutom att inga slaginstrument placerades i sprutkolven när CO 2 -flödet applicerades. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 . Effekten av en enda strejk. ( A ) Överlevnadsindex vid 24 h (SI 24 ), definierat av procent av flugor som överlevde inom 24 h efter en strejk, är grafad mot gasflödeshastigheten. Fluor som har slagits en gång med 5,0 L / min gasflödet återställd rörelseaktivitet medPå 4 min ( B ), och deras rörlighet återställdes långsamt till normala över en 2 d period ( C) . Felstång, Standardfel av medelvärdet (SEM). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 . Utveckling av mTBI-modellen i Drosophila . Upprepade strejk över fem dagar resulterade i väsentligt nedsatt rörelseaktivitet ( A & B ) och minskad livslängd ( C ). Representativa vandringsleder registrerade över 5 min för 4 sham och behandlade flugor visas i A. Felstänger, SEM. * P <0,05, Mann-Whitney U-test med en Bonferroni-korrektion. Totalt antal flugor: behandlad grupp n = 100, skamgruppN = 129. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Djurmodeller som trogen modellerar CTE-funktioner, inklusive neurofysiologiska förändringar, neuropatologiska kännetecken och neurobehavioralunderskott, är viktiga för att avslöja sjukdomsmekanismer och för att utveckla diagnostiska och terapeutiska mål. Det är förståeligt att ingen djurmodell av en mänsklig sjukdom är perfekt för att efterlikna alla kliniskt relevanta ändpunkter. Vi tror emellertid att en robust CTE-modell borde uppfylla följande tre krav: (1) Effekten måste tillämpas direkt på ett huvud som har intakt hårbotten och skalleskydd. (2) huvudet bör inte immobiliseras vid stötdämpning så att snabb accelerations-retardation och rotations- och linjära huvudrörelser tillåts Och (3) den experimentella designen bör innefatta både enkla och repetitive regimer, och konsekvenserna av konsekvenserna bör vara milda av naturen, utan att påverka synlig skada, såsom vävnadsödem, kontusion eller fritt blödning.
ouR fruktflygmodell skiljer sig från andra metoder som orsakar traumatisk hjärnskada i flugor 13 , 14 , 15 . Både pärlrobotmodellen och HIT-enheten medför skada med slumpmässig slagplats och styrka. I båda metoderna, varierar antalet flyger som finns i antingen en vanlig plastflaska eller ett 2 ml skruvkapsrör, kontakt behållarens vägg och rebound flera gånger under varje strejk eller skada. Eftersom flugorna är fritt rörliga inuti behållaren är de primärskador som åsamkats väsentligt olika för enskilda flugor, eftersom olika delar av deras kroppar och / eller huvuden skadas med olika krafter. Således är det inte överraskande att flugorna drabbades av tarmbarriär dysfunktion med hjälp av dessa modeller. Detta var direkt korrelerat med dödligheten i båda regimer 13 , 14 , vilket starkt indikerar att nPå-neuronala förändringar var ansvariga för traumainducerad död i båda systemen. Däremot är vår metod i stånd att upprepade gånger leverera direkt huvudpåverkan till samma plats. Kroppen är skyddad från någon direkt exponering, vilket eliminerar de potentiella tillvägagångssätten att döden kan orsakas av skador på andra delar av kroppen eller till inre organ. Dessutom kan flödeshastigheten för den CO 2 -gas som används för att driva vikten regleras för att uppnå kontrollerad, justerbar styrka. Viktigast är att flyghuvudet inte är begränsat vid strejkpunkten, vilket möjliggör en mycket snabb accelerations-retardationsprocess som efterliknar den vanligaste formen av mTBI som uppträder i den mänskliga befolkningen 19 .
Även om det skulle vara idealiskt att installera en automatisk på / av-brytare för att styra CO 2- flödesregulatorn, verkar den nuvarande manöveromkopplaren inte påverka reporternas reproducerbarhet eftersom konstruktionen av vår enhet allaOws kraften att utövas snabbt när slagaren träffar huvudet.
Sammanfattningsvis ger vårt system en ny regim som bättre efterliknar mTBI, introducerar en ny plattform för modell CTE. Liksom andra Drosophila- modeller som har visat sig vara värdefulla för att dechiffrera mänskliga neurodegenerativa störningar 9 , 20 , förväntas den pågående detaljerade karaktäriseringen av modellen när det gäller neuronförlust, tau-hyperfosforylering, TDP-43 proteinopati och neuroinflammatorisk respons på den påförda mTBI Generera viktiga mekaniska insikter i CTE-sjukdomsprocesser och hjälper till att svara på några av de kritiska frågorna inom området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöddes av Johns Hopkins University School of Medicine fakultets startfonder till LC
Acknowledgments
Författarna har ingenting att avslöja.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerosol Barrier | USA Scientific | 1120-8810 | Used as an impactor |
| 200 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1111-0706 | Used as a fly head holder |
| 1000 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1122-1830 | Used as a connector |
| 1 mL Tuberculin Syringe | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | Used as a tracking arenas |
| Flow Regulator | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Holder/stand | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Fine Brush | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
References
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
- Martland, H. S. Punch drunk. JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).
- Millspaugh, J. A. Dementia pugilistica. US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).
- Omalu, B. I., et al. Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II. Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).
- Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Sci Transl Med. 4 (134), (2012).
- Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going? Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407 (2013).
- McKee, A. C., et al. The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy. Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
- Littleton, J. T., Ganetzky, B. Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).
- Appel, L. F., et al. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).
- Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster. Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Barekat, A., et al. Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 25252 (2016).
- Katzenberger, R. J., et al. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J Vis Exp. (e52905), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Theadom, A., et al. Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample. J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).
- Drobysheva, D., et al. An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster. J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).
