Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een methode om de werkzaamheid van handwashing te testen voor de verwijdering van opkomende infectieuze pathogenen

Published: June 7, 2017 doi: 10.3791/55604

Summary

Handwashing wordt algemeen aanbevolen om infectieziekte overdracht te voorkomen. Er is echter weinig bewijs aan welke handwasmethoden het meest effectief zijn bij het verwijderen van infectieuze ziektepatogenen. Wij ontwikkelden een methode om de werkzaamheid van handwasmethoden bij het verwijderen van micro-organismen te beoordelen.

Abstract

Handwashing wordt algemeen aanbevolen om infectieziekte overdracht te voorkomen. Er bestaat echter weinig vergelijkbaar bewijs over de werkzaamheid van handwasmethoden in het algemeen. Bovendien bestaat er weinig bewijsmateriaal om handwasmethoden te vergelijken om te bepalen welke effecten het meest effectief zijn bij het verwijderen van infectieuze pathogenen. Onderzoek is nodig om bewijs te leveren voor de verschillende aanpakken van handwashing die gebruikt kunnen worden bij infectieuze ziekte-uitbraken. Hier wordt een laboratoriummethode beschreven om de werkzaamheid van handwasmethoden te beoordelen bij het verwijderen van micro-organismen uit handen en hun persistentie in spoelwater. De handen van vrijwilligers worden eerst getest met het testorganisme en vervolgens gewassen met elke handwasmethode van belang. In het algemeen worden surrogaatmicro-organismen gebruikt om mensen van ziekte te beschermen. Het aantal organismen die op vrijwilligers handen achter het wassen overblijven, wordt getest met behulp van een gemodificeerde handschoen sapmethode: de handen worden in een handschoen met een eluEnt en worden geschrobd om de micro-organismen op te schorten en ze beschikbaar te stellen voor analyse door membraanfiltrering (bacteriën) of plaque assay (virussen / bacteriofagen). Spoelwater uit de handwassing wordt direct verzameld voor analyse. Handwashing efficacy wordt gekwantificeerd door de log reductie waarde te vergelijken tussen monsters die zijn genomen na handwashing naar monsters zonder handwashing. Spoelwaterpersistentie wordt gekwantificeerd door het vergelijken van spoelwatermonsters van verschillende handwasmethoden naar monsters die zijn verzameld na handwas met gewoon water. Hoewel deze methode wordt beperkt door de noodzaak om surrogaatorganismen te gebruiken om de veiligheid van menselijke vrijwilligers te behouden, worden de aspecten van handwashing gedetecteerd die moeilijk in een in vitro studie kunnen repliceren en onderzoeksgaten op de handwaswerking en de volharding van besmettelijke organismen in de spoel vullen water.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Handwashing wordt op grote schaal aanbevolen om de verspreiding van ziekte te voorkomen, met name die die door de fecale orale of luchtweg worden overgedragen, waaronder diarree- en ademhalingsziekten 1 . Verrassend is er weinig vergelijkbaar bewijs over de werkzaamheid van handwasmethoden, zoals handwashing met zeep en water (HWWS) en met alcoholgerelateerde handverzorgingsmiddelen (ABHS), op het verwijderen van organismen uit de handen. Aanvankelijk onderzoek heeft gevonden dat de mechanische werking van handwashing, in tegenstelling tot de handwasmethode, de meeste organismeverwijdering 2 , 3 kan uitmaken. Bovendien zijn er weinig vergelijkende bewijzen op welke handwasmethode het meest effectief is. In een informele literatuurstudie werden 14 studies die de werkzaamheid van zeep en handverzorgingsmiddel vergeleken met de verwijdering van organismen geïdentificeerd. Van deze studies vonden vijf ABHS meer efficiënt 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 7 vonden HWWS meer effectief 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 en twee vonden geen significant verschil tussen de methoden 16 , 17 . Deze bevindingen zijn inconsistent en geven geen aanleiding tot het voortdurende risico op ziekte door de persistentie van organismen in het spoelwater na handwas. In het algemeen is het bewijs van de vergelijkende werkzaamheid van handwasmethoden voor het verwijderen van infectieziekt veroorzakende pathogenen beperkt.

Dit beperkte bewijs heeft geleid tot onzekerheid over welke methoden het meest geschikt zijn bij uitbraken. Bijvoorbeeld, Tijdens de Ebola Virus Disease (EVD) uitbraak in West-Afrika van 2013 tot 2016, leverden verschillende grote internationale responders tegenstrijdige aanbevelingen voor HWWS, ABHS of 0,05% chlooroplossingen. Médecins Sans Frontières (MSF) beveelt aan het gebruik van 0,05% chlooroplossing voor handwas, terwijl de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) HWWS of ABHS adviseert (als de handen niet zichtbaar zijn). De WHO gaat zo ver dat staat dat chloor niet mag worden gebruikt, tenzij er andere opties beschikbaar zijn, omdat het minder effectief is dan andere methoden door de chloorbehoefte die door de huid 18 , 19 , 20 , 21 , 22 wordt uitgeoefend. Daarnaast worden de chlooroplossingen meestal geproduceerd uit vier verschillende chloorverbindingen, waaronder hypothloride (HTH), lokaal gegenereerde en gestabiliseerde natriumhypochloriet (NaOCl) en sodaIum dichloorisocyanuraat (NaDCC). Een systematisch onderzoek dat de WHO in opdracht van het EVD-uitbraak in West-Afrika heeft ingediend, heeft onlangs slechts vier studies gevonden die de vergelijkende werkzaamheid van handwas met chloor 23 onderzoeken. Deze studies hebben ook tegenstrijdige resultaten opgedaan, en geen van deze studies gebruikte de aanbevolen chloorconcentratie van 0,05% voor handwas- of onderzochte micro-organismen die vergelijkbaar zijn met het Ebola-virus 10 , 24 , 25 , 26 , 27 . Zo werden de aanbevelingen niet gebleken op evidence-based, en het was onduidelijk welke aanbevelingen het meest effectief waren.

Aanvullend onderzoek is nodig om handwashing benaderingen te vergelijken om de verspreiding van besmettelijke pathogenen te voorkomen, aangezien handwashing interventies een belangrijk instrument zijn om epidemische ziekteoverdracht te voorkomen. Deze hAndwashing aanbevelingen moeten gebaseerd zijn op bewijs. Zo werd een methode ontwikkeld voor het testen van handwaswerking en spoelwater-persistentie, uitgevoerd met surrogaten of niet-infectieuze pathogenen, 2 , 28 , 29 ontwikkeld. Voorbeelden van resultaten, waarbij Phi6 wordt gebruikt als een surrogaat voor het Ebola-virus en het gebruik van Escherichia coli als een gemeenschappelijk indicator organisme, worden hier voorgesteld. In dit protocol worden hand-wash-efficiëntie- en spoelwater-persistentie-tests gepresenteerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etiekverklaring: Het hier beschreven onderzoek (op Phi6 en E. coli als surrogaten voor Ebola) werd goedgekeurd door de Institutional Review Board bij Tufts Medical Center en Tufts University Health Sciences Campus (# 12018); Harvard University ceded recensie aan de Tufts Institutionele Review Board.

OPMERKING: Voordat u dit protocol begint, moeten twee stappen worden ingevuld. Ten eerste moet een Biosafety Level 1 (BSL-1) surrogaat of niet-infectieuze versie van het te onderzoeken pathogeen dat veilig is om te gebruiken bij mensen, worden geïdentificeerd en geselecteerd 30 . Voor dit protocol is een BSL-1-surrogaat of een niet-infectieus pathogeen nodig, omdat het organisme gebruikt wordt om de blote handen van menselijke vrijwilligers te inoculeren. Ten tweede moet goedkeuring van de lokale Institutional Review Board om onderzoek te doen met menselijke vakken worden verkregen alvorens willekeurig vrijwilligers aan te trekken of het experiment te starten. Veel aspecten van dit protocol kunnen worden aangepast om te voldoen aan thE specifieke behoeften van de onderzoeksvragen van belangstelling

1. Werkt in aanmerking voor menselijke onderwerpen

  1. Werf vrijwilligers door papieren folders te plaatsen op publieke kennisgevingsborden en het versturen van e-mails naar groepen met leden die geïnteresseerd zijn in deelname. Deze aankondigingen moeten het studiedoel, contactgegevens en subsidiabiliteitscriteria bevatten.
  2. Ontmoet de vrijwilligers om de geschiktheid te beoordelen. Bevestig dat de vrijwilligers gezond zijn tussen 18 en 65 jaar en momenteel niet zwanger zijn of antibiotica gebruiken en dat ze geen huidschade of -stoornissen hebben, bekende allergieën voor handwasmiddelen of geschiedenis van geestelijke gezondheidsproblemen in verband met hygiëne.
  3. In aanmerking komende vrijwilligers lezen toestemmingsformulieren. Beantwoord eventuele vragen die ze vormen en de vrijwilliger en de onderzoeker ondertekenen twee kopieën van het formulier. Behoud één formulier en geef één aan de vrijwilliger.
  4. Beheer een basisonderzoek, inclusief vragen over demografische informatie, persoonAl geschiedenis van de huidomstandigheden en informatie over recent handwasgedrag. Ondersoek handen voor tekenen van dermatitis, huidletsels of afwijkingen op basis van de huid 31 .
  5. Plan de vrijwilligers voor twee test sessies voor elk organisme van belang (een voor het testen met bodembelasting en een voor het testen zonder). Geef de vrijwilligers aan om antimicrobiële producten voor een periode van zeven dagen voorafgaand aan het testen te vermijden, om te voorkomen dat er sprake is van persoonlijke productgebruik.
    1. Zorg voor vrijwilligers met antimicrobiële producten (shampoo, conditioner en zeep) om te gebruiken in plaats van hun gebruikelijke producten. Zorg voor zware vinylhandschoenen en instructeer de onderwerpen om ze te dragen bij gebruik van producten zoals huisreinigingsproducten.

2. Bereid handwasoplossingen voor die vaak worden gebruikt in noodreactie (zeep, ABHS, 0,05% HTH, NaDCC en NaOCl oplossingen)

OPMERKING: Chlooroplossingen kunnen worden voorbereid 12 uur vóór het experiment opgewarmd, maar zal afbreken als opgeslagen> 12 uur.

  1. Kies en koop een zeep die relevant is voor de context waarvoor het testen wordt uitgevoerd.
    OPMERKING: in de meeste gevallen voor infectieziektesituaties in de ontwikkelingslanden zal dit een zeepbalk zijn.
  2. Kies en koop een ABHS-oplossing die relevant is voor de context waarvoor het testen wordt uitgevoerd.
    OPMERKING: De gekozen ABHS moet een ethylalcoholcontext hebben die groter is dan of gelijk is aan 70% om de werkzaamheid te waarborgen.
  3. Bereid een 0,05% calciumhypochloriet (Ca (ClO) 2 ) -oplossing door granulair Ca (ClO) 2 poeder toe te voegen aan ultrauw water. Bepaal de hoeveelheid oplossing die nodig is op basis van het aantal te testen onderwerpen.
    1. Gebruik de volgende vergelijking en bepaal de hoeveelheid poeder die nodig is om de gewenste hoeveelheid oplossing in een bepaald volume water te bereiden met een gegeven percentage van de beschikbare chloor:
      /files/ftp_upload/55604/55604eq1.jpg "/>
      OPMERKING: Ca (ClO) 2 poeder heeft meestal 60-80% verkrijgbaar chloor.
  4. Bereid een 0,05% natriumdichloorisocyanuraatoplossing (NaDCC) op door een korrelig NaDCC poeder toe te voegen aan ultrapure water.
    1. Gebruik de volgende vergelijking en bepaal de hoeveelheid poeder die nodig is om de gewenste hoeveelheid oplossing in een bepaald volume water te bereiden met een gegeven percentage van de beschikbare chloor:
      Vergelijking
      OPMERKING: NaDCC poeder heeft over het algemeen ongeveer 50% beschikbaar chloor.
  5. Bereid een gestabiliseerde 0,05% NaOCl oplossing door de natriumhypochlorietoplossing van de voorraad aan ultraherwaterig water toe te voegen.
    1. Bevestig de concentratie van de NaOCl-voorraadoplossing (waarschijnlijk 5-8%) met behulp van een titratietestmethode volgens de instructies van de fabrikant ( bijv. Iodometrische titratie; zie de lijst van materialen voor de suGestuit kit).
    2. Met behulp van de resultaten van de testmethode, bereken de hoeveelheid oplossing die u aan water toevoegt aan de hand van de volgende vergelijking:
      Vergelijking
  6. Bereid gestabiliseerde 0,05% NaOCl-oplossing door natriumhypochlorietoplossing op te bouwen met behulp van een elektrochlorinator, ultrauw water en natriumchloridechloride (NaCl) in laboratoriumgraad naar ultracure water.
    1. Bereid een 1% chlooroplossing met ultrauw water en NaCl, met behulp van een elektrochlorinator volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Gebruik een titratietestmethode ( bijv. Iodometrische titratie) om de concentratie van de NaOCl-voorraadoplossing 32 te bevestigen.
    3. Met behulp van de resultaten van de test, bereken de hoeveelheid oplossing die u aan water toevoegt aan de hand van de volgende vergelijking:
      Vergelijking
  7. Bevestig de cConcentratie van elk van de chloor handwasoplossingen met behulp van een titreringsmethode ( bijv. Iodometrische titratie) en pas de oplossingen aan door water of chloorpoederpoeder / oplossing toe te voegen totdat ze binnen een 10% fout van de doelconcentratie (0,045-0,055%) liggen.

3. Organismes en bodemlading voorbereiden en combineren om de inoculatie te produceren

OPMERKING: In de volgende onderafdelingen worden E. coli en Phi6 gebruikt als monsterbacteriële en virale organismen voor de methodebeschrijvingen.

  1. Bereid het organisme voor om te testen bij een concentratie groter dan 10 x 10 8 CFU / ml voor bacteriën en meer dan 10 x 10 7 PFU / ml voor virussen.
    1. Om E. coli te bereiden, streep een nonpathogene stam van E. coli op Luria-Bertani (LB) agarplaten en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C om enkele kolonies te verkrijgen. Bewaren bij 4 ° C.
      OPMERKING: dit kan gedaan wordenAl dagen voor experimenten.
      1. Eén dag voor het begin van het experiment, kies een enkele kolonie uit de plaat en 10 ml LB bouillon inoculeren met een steriele lus. Incubeer overnacht bij 37 ° C met schudden.
      2. Op de ochtend van het experiment start u een verse cultuur door 1 ml van de nachtcultuur toe te voegen aan 20 ml verse LB bouillon. Incubeer gedurende ongeveer 2,5 uur om een ​​celdichtheid groter dan 10 8 CFU / ml te bereiken.
      3. Gebruik een spectrofotometer om de concentratie van de cultuur te schatten.
        OPMERKING: Gebruik een eerder geconstateerde omzettingsfactor van een standaardkurve voor de gebruikte E. coli- stam, waardoor een concentratie groter dan 10 8 CFU / mL 33 wordt gewaarborgd. Als de celdichtheid niet hoog genoeg is, moet u de cultuur terugzetten naar de incubator en opnieuw testen tot het klaar is.
    2. Bevestig de concentratie met membraanfiltratie 34 .
      OPMERKING: Voer seriële verdunningen uitF de cultuur in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), zodat de gefilterde oplossing een getelbaar aantal kolonies op de plaat zal produceren (het exacte aantal zal afhangen van het gebruikte medium).
      1. Stel een vlam en een filtratie manifold op met steriele filtraten en een vacuümverbinding. Steriliseer tang door ze te vlammen met ethanol. Gebruik ze om een ​​0,45-μm filter op het filtreerpaneel te plaatsen, met het raster naar boven gericht. Nat het filter met een kleine hoeveelheid steriele PBS.
      2. Plaats de trechter op de basis en voeg de monsteroplossing toe door te pipetteren of direct op het filter te gieten. Breng het vacuüm aan tot het gehele monster door het membraan is doorgegaan. Spoel de zijkanten van de trechter met steriele PBS af en sluit het vacuüm weer in.
        OPMERKING: Monsters dienen ten minste 100 μL en maximaal 100 ml te zijn. Als een monster minder dan 10 ml bedraagt, voeg ongeveer 20 ml PBS toe aan de filtreertrechter voorafgaand aan het filteren om de uniforme filtratie van het samp te waarborgenle.
      3. Verwijder de trechter, vlamsteriliseer de tang en hef het filter uit de basis. Plaats het filter voorzichtig op de LB-agar in een Petri-schotel, met het rooster naar boven om ervoor te zorgen dat het filter tegen het oppervlak ligt. Omkeer de platen en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C.
      4. Verwijder na 24 uur de platen uit de incubator en tel de E. coli kolonies. Gebruik deze gegevens en de bekende verdunningsfactor en het volume van de oplossing om de concentratie van de gefiltreerde oplossing in CFU / mL te berekenen.
    3. Propagate Phi6 in Pseudomonas syringae gastheer met behulp van de dubbele agar overlay methode 35 .
      1. Voeg 100 μl Phi6 voorraad suspensie en 100 μL P. syringae overnight cultuur direct toe aan 6 ml zachte agar (NBY) Nutrient Broth Yeast (0,3%). Giet het op platen met NBY harde agar (1,5%) en incubeer overnacht bij 26 ° C. Bereid genoeg platen om genoeg inoculum voor de proef te producerenSchatting van een opbrengst van ongeveer 4 ml virale suspensie per plaat.
      2. Voeg de volgende dag 5 ml PBS op de zachte agarlaag toe. Laat het 4 uur bij kamertemperatuur, haal het met een pipet en filter het met een 0,45 μm filter. Bewaren bij 4 ° C.
        OPMERKING: Deze oplossing zal dienen als de virale inoculatie.
    4. Gebruik een plaque assay om te bevestigen dat de concentratie groter is dan 10 7 PFU / mL 35 . Voer seriële verdunningen van de virale suspensie in PBS uit, zodat 100 μL een tellen aantal plaques op de plaat produceert.
      1. Pipet 100 μl van een geschikt verdund monster en 100 μl van de gastheerkweek van de nacht direct in een buis die 6 ml NBY zachte agar bevat. Giet zachte agar over NBY harde agar en incubeer bij 26 ° C gedurende 24 uur.
      2. De volgende dag, verwijder de platen uit de incubators en tel het aantal plaatjes per bord. Gebruik deze gegevens en de bekende verdunning faCtor en volume van de oplossing om de concentratie van de gefiltreerde oplossing in PFU / ml te berekenen.
  2. Bereid de tripartiete bodemlading, die bedoeld is om menselijk serum na te bootsen.
    1. Combineer 7,80 mg / ml runder serumalbumine, 10,92 mg / ml trypton en 2,52 mg / ml rundermucine om het benodigde volume grondlaag te produceren. Na het mengen van de bodembelasting, filter het door een 0,22 μm filter om te steriliseren. Bewaar het bij 4 ° C tot gebruik. Hitte niet steriliseren, aangezien de eiwitten zullen denatureren.
  3. Bereid een 0,9% NaCl oplossing voor het mengen van de inocule voor omstandigheden zonder bodembelasting.
  4. Onmiddellijk voorafgaand aan het testen bereiden u een inoculum op, bestaande uit 68% bacteriële of virale suspensie en 32% grondbelasting. Gebruik bijvoorbeeld 1,02 ml bacteriële of virale suspensie uit stappen 3.1.1.2 of 3.1.3.2 en 0.48 ml van beide grondbelasting (stap 3.2.1) of 0,9% NaCl oplossing (stap 3.3). Wervel of vortex zachtjes te mengen.
    OPMERKING: 1,5 ml hiervanInoculum wordt voor elke vrijwilliger onder elke conditie gebruikt, dus zorg ervoor dat het totale volume van het bereide inoculum voldoende is voor het beoogde aantal tests.

4. Voorbereiding van vrijwilligers voor het experiment

OPMERKING: Bepaal het organisme en de bodemladingstoestand die op die dag moet worden getest. Dergelijke vrijwilligers kunnen gebruikt worden voor het testen van meerdere voorwaarden, maar elke vrijwilliger mag slechts een ronde testen ondergaan in een periode van 48 uur.

  1. Voordat u begint te testen, bevestig dat de vrijwilligers in aanmerking komen door mondeling te verifiëren dat ze zich houden aan de 7-daagse antimicrobiële uitwasperiode en door visueel te bevestigen dat ze geen pauzes of afwijkingen op hun huid hebben ontwikkeld.
  2. Met behulp van een willekeurige cijfergenerator, geef elke vrijwilliger aan om hun rechter- of linkerhand te gebruiken om op deze testdag te proeven. Een opdracht toewijzen waarin de handwasvoorwaarden zullen worden uitgevoerd.
    OPMERKING: VoorBijvoorbeeld, ABHS kan worden toegewezen # 3 en zal derde worden uitgevoerd.
  3. Doe een "reinigingswas" eens bij het begin van het testen om de huid van vuil en oliën te verwijderen, zodat elke volgende test onder gelijke omstandigheden wordt uitgevoerd.
    1. Om een ​​reinigingswas te doen, loop door elke stap van het experiment (sectie 5 hieronder) met een blanco inoculaat (alleen LB-bouillon of PBS) en neem een ​​monster zonder handwas.

5. Experimentele procedure

  1. Om de pH van de huid van elke vrijwilliger te testen (om te controleren op variatie), plaatst u een platte getekende pH-sonde op de palmar oppervlak en de webruimte tussen de aanwijzer en de middelste vingers. Zorg ervoor dat de elektrode plat tegen de huid ligt. Noteer de pH-aflezing.
  2. Spike de handen.
    1. Zet de vrijwilligersbeker beide handen bij elkaar. Spik de handen met 1,5 ml van het inoculeren door langzaam 750 μL langzaam in elke palm te pipetteren.
    2. Laat de vrijwilligers hun handen zachtjes wrijven totdat alle oppervlakken van de hand met het inoculaat zijn bedekt, terwijl de handen zo weinig wrijving mogelijk maken.
    3. Laat de vrijwilligers hun handen nog steeds en nog eens 30 seconden van hun lichaam houden om de inenting te laten drogen. Het inoculaat mag niet volledig drogen.
  3. Was de handen.
    1. Voor alle volgende wasstappen trekt u het spoelwater van de handen in een grote monsternemingszak. Voeg 4,5 ml van een 12% natriumthiosulfaatoplossing toe aan de zak om het chloor op contact te neutraliseren en binnen 2 uur te verwerken.
      OPMERKING: Natriumthiosulfaat moet aan alle monsters (zelfs die zonder chloor) worden toegevoegd om te controleren welke impact het op het organisme kan hebben.
    2. Na inenting (sectie 5.2), was de handen met de volgende methode in de aangewezen volgorde.
      1. Voor Control A, voer geen handwasstap uit en ga direct naar stap5.5.
      2. Voor Control B, was de handen met alleen ultracure water bij kamertemperatuur (ongeveer 21 ° C) door een trechter met een bekende stromingssnelheid.
        OPMERKING: hier werd een stromingssnelheid van 1,5 L / m en 500 ml water gebruikt.
      3. Voor handwas met zeep, bevochtig de handen met 10 ml ultra-water. Laat de vrijwilligers hun handen met zeep schudden en wrijf dan hun handen voor nog eens 20 seconden. Spoel hun handen door 500 ml ultraperout water te gieten bij kamertemperatuur door een trechter met een stromingssnelheid van 1,5 L / m.
      4. Voor alle chlooroplossingen ( bijv. ABHS, HTH, NaDCC en NaOCl), giet 200 ml chlooroplossing door een trechter met een stroomsnelheid van 1,5 L / m en laat de vrijwilliger hun handen grondig wrijven.
  4. Hand spoelen met een gewijzigde handschoen sap procedure.
    1. Na handwassing plaats de hand van elke vrijwilliger onmiddellijk ( dwz de hand (rechts of links) geselecteerd voor testiNg in stap 4.2) in een monsterzak die 75 ml eluent ( bijv. PBS) tot aan de pols bevat. Houd de bovenkant van de zak strak om de pols vast.
      OPMERKING: Gebruik een elutiemiddel voor monsterneming die voldoende natriumthiosulfaat bevat om chloor te neutraliseren die gebruikt wordt voor handwas. PBS is een veelgebruikte eluent die geschikt is voor veel organismen.
    2. Laat de vrijwilligers hun hand zachtjes wrijven in de oplossing gedurende 30 s, zorg ervoor dat ze tussen de vingers en onder de nagels komen. Masseer de hand van buiten de zak voorzichtig gedurende 30 s om ervoor te zorgen dat de gehele hand grondig in het eluent wordt gespoeld, helemaal tot aan de pols.
    3. Verzegel de zak en verwerk het volgens de juiste test, beschreven in sectie 6, binnen 2 uur.
  5. Decontaminatie.
    1. Alvorens het proces te herhalen met elke handwasmethode, wassen de vrijwilligers hun handen grondig in een gootsteen met zeep en warm water. Spuit de vrijwilliger uitRs 'handen met 70% ethanol totdat ze aan beide zijden zijn bekleed. Laat ze drogen.
    2. Herhaal alle stappen in sectie 5 voor elke handwasvoorwaarde, alleen met de hand die willekeurig geselecteerd is in stap 4.2 ( figuur 1 ).

6. Kwantificering

  1. Voer analyses uit die geschikt zijn voor het gekozen organisme ( bijv. Membraanfiltrering voor bacteriën of plaque-analyse voor virussen, hierboven beschreven in respectievelijk secties 3.1.2 en 3.1.4).
  2. Na het tellen van de platen moet u de geschatte CFU / mL of PFU / mL voor elke test voor de analyses opnemen (secties 3.1.2 en 3.1.4).

7. Analyse

  1. Met behulp van de resultaten uit stap 6.2, bereken de log reductiewaarde van organismen op de handen, voor elk organisme en de grondbelastingsstatus en voor elk onderwerp en handwasmethode.
    1. Voor de handwaswerking, vergelijkt u de concentratie van bacteriën / virus in elk Handwasproef om A te controleren (geen handwas). Voor het afspoelen van spoelwater moet u elk spoelwatermonster vergelijken om B te controleren (alleen met water wassen). Gebruik de volgende standaardformule:
      Log Reduction (handwashing ) = VergelijkingVergelijking
      Log Reduction (spoelwater ) = VergelijkingVergelijking
      OPMERKING: Logreductie kan ook uitgedrukt worden als log 10 (zonder handwas) - log 10 (met handwas)
  2. Gebruik een one-way repeat analysis of variance (ANOVA) om de significante verschillen in de berekende logreductiewaarden tussen handwasmethoden te evalueren en een HSH-test van Tukey na te hoc voor significante modellen om significant verschillen te beoordelen (p <0,05)Ef "> 36.
    1. Voordat u de ANOVA uitvoert, beoordeelt u elke dataset voor sfericiteit ( bijv. Bartlett's test). Pas een correctie toe ( bv. De Greenhouse-Geisser-correctie) wanneer de test aangeeft dat de bolvormigheid is geschonden 37 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier werd het protocol ( figuur 1 ) voltooid met 18 vrijwilligers, die elk getest werden met behulp van zowel E. coli als Phi6. Er werden significante verschillen gevonden tussen handwasresultaten met E. coli, zowel met als zonder grondbelasting en Phi6 met bodembelasting ( Figuur 2 en Figuur 3 ). Voor E. coli zonder bodembelasting leidde handwassen met HTH, NaDCC en gestabiliseerde NaOCl alles in aanzienlijke grotere logreducties dan handwas met water alleen (F (6.102) = 2,72, p = 0,034). Met grondlading resulteerde HTH in een significant grotere logreductie van E. coli dan alleen water, HWWS en ABHS (F (6.102) = 3,94, p <0,001). Er was geen significant verschil tussen methoden voor Phi6 zonder grondbelasting (F (6,66) = 2,04, p = 0,073). Voor Phi6 met grondbelasting (F (6.102) = 7.01, p <0.001) leidde het water alleen tot een greepAter log reductie dan ABHS of gestabiliseerde NaOCl en HWWS in een grotere log reductie dan ABHS, gestabiliseerde NaOCl en gegenereerde NaOCl. HTH had ook een grotere log reductie dan ABHS en gestabiliseerde NaOCl, en NaDCC resulteerde in een grotere log reductie dan gestabiliseerde NaOCl en ABHS. Terwijl HTH het meest consequent goed over de omstandigheden heeft uitgevoerd, zouden we voorzichtig zijn tegen oververtolking van significante resultaten, waarbij veel vertrouwenintervallen groot waren, variërend van minder dan 0,5 log tot meer dan 1,5 logreductie in veel gevallen.

In het spoelwater resulteerde chloor in een aanzienlijk grotere logreductie van E. coli die in het spoelwater bleef dan HWWS (zonder bodemlading, F (4,68) = 331,7, p <0,001, met waterlading F (4,68) ) = 162,44, p <0,001) ( Figuur 4 ). Ditzelfde patroon werd gevonden in Phi6 zonder grondbelasting ((F (4,43) = 8,95, P <0,001), waarbij alle chlooroplossingen resulteren inNegatief grotere reductie van Phi6 in spoelwater dan HWWS. Er waren geen significante verschillen in persistentie in spoelwater met Phi6 en bodembelasting ((F, 4,67) = 3,35, p = 0,071) ( Figuur 5 ).

Figuur 1
Figuur 1: Experiment overzicht. De vijf stappen die voor elke ronde handwassing worden ondernomen, zijn onder meer: ​​1) pH-test, 2) Inoculeren van de handen, 3) Handwashing, 4) Hand spoelen en 5) De handen ontregelen voor elk van de acht geteste condities. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: E. coli handwashing res ULT's. Vergeleken met geen handwas, resulteerde in de geteste handwasmethoden een gemiddelde log reductie in E. coli van 1,94-3,01 zonder bodemlading en 2,18-3,34 met bodembelasting. Handwashing met water vertoonde de minste reductie in E. coli in beide omstandigheden (1,94 en 2,18 log). Handwashing met NaDCC resulteerde in de grootste reductie zonder grondbelasting (3,01) en HTH resulteerde in de grootste reductie met grondbelasting (3,34). In de diagrammen staat de lijn voor de procentuele reductie in organismen, en de foutbalken staan ​​voor de standaardfout van logreductie. Ctrl B, controle B; HWWS, handwas met zeep; ABHS, alcohol-based handverzorgingsmiddel; HTH, high-test hypochloriet; NaDCC, natrium dichloorisocyanuraat; St NaOCl, gestabiliseerde natriumhypochloriet; Gen NaOCl, genereerde natriumhypochloriet. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ve_content "voor: keep-together.within-page =" 1 "> Figuur 3
Figuur 3: Phi6 handwasresultaten. Vergeleken met geen handwas, resulteerde de handwasmethoden in een gemiddelde log reductie in Phi6 van 2.44-3.06 zonder bodemlading en 2,71-3,69 met bodembelasting. Handwashing met zeep demonstreerde de minste reductie in Phi6 zonder bodemlading (2,44) en handwas met gestabiliseerde NaOCl resulteerde in de kleinste reductie met grondlading (2,71). Handwashing met gegenereerde NaOCl resulteerde in de grootste reductie zonder grondbelasting (3,06), en handwas met zeep resulteerde in de grootste reductie met bodemlast (3,69). In de diagrammen staat de lijn voor de procentuele reductie in organismen, en de foutbalken staan ​​voor de standaardfout van logreductie. Ctrl B, controle B; HWWS, handwas met zeep; ABHS, alcohol-based handverzorgingsmiddel; HTH, high-test hypochloriet; NaDCC, natrium dichloorisocyanuraat;St NaOCl, gestabiliseerde natriumhypochloriet; Gen NaOCl, genereerde natriumhypochloriet. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Handschoenresultaat van E. coli . In vergelijking met handwas met water alleen, was de gemiddelde log reductie van E. coli die in het spoelwater bleef 0,28-4,77 zonder bodembelasting en 0,21-4,49 met bodembelasting. Zowel met als zonder grondbelasting werd de kleinste reductie gevonden in handwas met zeep (0,28 en 0,21). De grootste reducties werden waargenomen bij gestabiliseerde en gegenereerde NaOCl zonder bodemlading (zowel 4,77) en met HTH en gegenereerde NaOCl met bodembelasting. In de diagrammen vertegenwoordigt de lijn het percentage vermindering in organismen, en de foutbalken staan ​​voor de sTandard fout van log reductie. HWWS, handwas met zeep; ABHS, alcohol-based handverzorgingsmiddel; HTH, high-test hypochloriet; NaDCC, natrium dichloorisocyanuraat; St NaOCl, gestabiliseerde natriumhypochloriet; Gen NaOCl, genereerde natriumhypochloriet. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5: Phi6 handspoelresultaten. In vergelijking met handwas met water alleen, was de gemiddelde log reductie van Phi6 die in het spoelwater bleef, 1,26-2,02 zonder bodemlading en 1,30-2,20 met bodembelasting. Met grondbelasting werd de kleinste reductie gevonden in handwas met zeep (1.26). Zonder grondlading leidde HTH tot de kleinste reductie (2.02). De grootste reducties werden waargenomen met en zonder bodemlading met NaDCC(2.02 en 2.20). In de diagrammen staat de lijn voor de procentuele reductie in organismen, en de foutbalken staan ​​voor de standaardfout van logreductie. HWWS, handwas met zeep; ABHS, alcohol-based handverzorgingsmiddel; HTH, high-test hypochloriet; NaDCC, natrium dichloorisocyanuraat; St NaOCl, gestabiliseerde natriumhypochloriet; Gen NaOCl, genereerde natriumhypochloriet. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het Bureau van de Verenigde Staten voor Internationale Ontwikkeling, Bureau van Buitenlandse Ramphulp (AID-OFDA-A-15-00026). Marlene Wolfe werd ondersteund door de National Science Foundation (subsidie ​​0966093).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soap bar Dove White Beauty Bar soap
Alcohol-based hand sanitizer Purell Advanced Instant Hand Sanitizer with 70% Ethyl Alcohol
HTH Powder Acros Organics 300340010
NaDCC Powder Medentech Klorsept granules
NaOCl Solution Acros Organics 419550010
Electrochlorinator AquaChlor
Iodometric titrator Hach 1690001
Bovine serum albumin MP Biomedicals NC0117242
Tryptone Fisher BP1421-100
Bovine Mucin EMD Milipore 49-964-3500MG
0.22 µm Filter EMD Milipore GVWP04700
NaCl Fisher BP358-1
Skin pH probe Hanna Instruments H199181
Large Whirlpak Sample Bag Nasco B01447WA
Small Whirlpak Sample Bag Nasco B01323WA
Funnel bottle Thermo Scientific 3120850001 You may drill an appropriately sized hole in the lid of a bottle to form a funnel that will dispense water at the appropriate flow rate
Ethanol ThermoScientific 615090010 Mix with water to produce 70% ethanol
Spray bottle Qorpak PLC06934
E. coli ATCC 25922
LB Broth Fisher BioReagents BP1426-2
LB Agar Fisher BioReagents BP1425-500
Sterile loop Globe Scientific 22-170-204
Phi6 HER 102
Nutrient broth BD Difco BD 247110
GeneQuant 100 Spectrophotometer General Electric 28-9182-04
Sodium thiosulfate Fisher Chemical S445-3
Membrane filter (47 mm, 0.45 µm) EMD Millipore HAWP04700
m-ColiBlue24 broth media EMD Millipore M00PMCB24
Petri dish with pad (47 mm) Fisherbrand 09-720-500
Vacuum Manifold Thermo Scientific/Nalgene 09-752-5
Filter funnels Thermo Scientific/Nalgene 09-747
Pseudomonas syringae HER 1102
Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific 10010031 Solution may also be mixed from source compounds according to any basic recipe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kampf, G., Kramer, A. Epidemiologic Background of Hand Hygiene and Evaluation of the Most Important Agents for Scrubs and Rubs. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 863-893 (2004).
  2. Miller, T., Patrick, D., Ormrod, D. Hand decontamination: influence of common variables on hand-washing efficiency. Healthc Infect. 16, (1), 18 (2013).
  3. Jensen, D. A., Danyluk, M. D., Harris, L. J., Schaffner, D. W. Quantifying the effect of hand wash duration, soap use, ground beef debris, and drying methods on the removal of Enterobacter aerogenes on hands. J Food Prot. 78, (4), 685-690 (2015).
  4. Girou, E., Loyeau, S., Legrand, P., Oppein, F., Brun-Buisson, C. Efficacy of handrubbing with alcohol based solution versus standard handwashing with antiseptic soap: randomised clinical trial. BMJ. 325, (7360), 362 (2002).
  5. Kac, G., Podglajen, I., Gueneret, M., Vaupré, S., Bissery, A., Meyer, G. Microbiological evaluation of two hand hygiene procedures achieved by healthcare workers during routine patient care: a randomized study. J Hosp Infect. 60, (1), 32-39 (2005).
  6. Lages, S. L. S., Ramakrishnan, M. A., Goyal, S. M. In-vivo efficacy of hand sanitisers against feline calicivirus: a surrogate for norovirus. J Hosp Infect. 68, (2), 159-163 (2008).
  7. Holton, R. H., Huber, M. A., Terezhalmy, G. T. Antimicrobial efficacy of soap and water hand washing versus an alcohol-based hand cleanser. Tex Dent J. 126, (12), Retrieved from: http://www.tda.org/Publications/Texas-Dental-Journal 1175-1180 (2009).
  8. Salmon, S., Truong, A. T., Nguyen, V. H., Pittet, D., McLaws, M. -L. Health care workers' hand contamination levels and antibacterial efficacy of different hand hygiene methods used in a Vietnamese hospital. Am J Infect Control. 42, (2), 178-181 (2014).
  9. Steinmann, J., Nehrkorn, R., Meyer, A., Becker, K. Two in-vivo protocols for testing virucidal efficacy of handwashing and hand disinfection. Int J Hyg Environ Health. 196, (5), Retrieved from: https://www.journals.elsevier.com/international-journal-of-hygiene-and-environmental-health 425-436 (1995).
  10. Weber, D. J., Sickbert-Bennett, E., Gergen, M. F., Rutala, W. A. Efficacy of selected hand hygiene agents used to remove Bacillus atrophaeus (a surrogate of Bacillus anthracis) from contaminated hands. JAMA. 289, (10), 1274-1277 (2003).
  11. Grayson, M. L., Melvani, S., et al. Efficacy of Soap and Water and Alcohol-Based Hand-Rub Preparations against Live H1N1 Influenza Virus on the Hands of Human Volunteers. Clin Infect Dis. 48, (3), 285-291 (2009).
  12. Oughton, M. T., Loo, V. G., Dendukuri, N., Fenn, S., Libman, M. D. Hand hygiene with soap and water is superior to alcohol rub and antiseptic wipes for removal of Clostridium difficile. Infect Control Hosp Epidemiol. 30, (10), 939-944 (2009).
  13. Liu, P., Yuen, Y., Hsiao, H. -M., Jaykus, L. -A., Moe, C. Effectiveness of liquid soap and hand sanitizer against Norwalk virus on contaminated hands. Appl Environ Micro. 76, (2), 394-399 (2010).
  14. Savolainen-Kopra, C., Korpela, T., et al. Single treatment with ethanol hand rub is ineffective against human rhinovirus--hand washing with soap and water removes the virus efficiently. J Med Virol. 84, (3), 543-547 (2012).
  15. Tuladhar, E., Hazeleger, W. C., Koopmans, M., Zwietering, M. H., Duizer, E., Beumer, R. R. Reducing viral contamination from finger pads: handwashing is more effective than alcohol-based hand disinfectants. J Hosp Infect. 90, (3), 226-234 (2015).
  16. Steinmann, J., Paulmann, D., Becker, B., Bischoff, B., Steinmann, E., Steinmann, J. Comparison of virucidal activity of alcohol-based hand sanitizers versus antimicrobial hand soaps in vitro and in vivo. J Hosp Infect. 82, (4), 277-280 (2012).
  17. de Aceituno, A. F., Bartz, F. E., et al. Ability of Hand Hygiene Interventions Using Alcohol-Based Hand Sanitizers and Soap To Reduce Microbial Load on Farmworker Hands Soiled during Harvest. J Food Protect. 78, (11), 2024-2032 (2015).
  18. Sterk, E. Médecins Sans Frontières - Filovirus Haemorrhagic Fever Guideline. Available from: http://jid.oxfordjournals.org/content/204/suppl_3/S791.full (2008).
  19. World Health Organization. WHO Report. Ebola Virus Disease ( EVD ) Key questions and answers concerning water, sanitation and hygiene. Available from: http://www.who.int/water_sanitation_health/WASH_and_Ebola.pdf 1-5 (2014).
  20. World Health Organization. Guidelines on Hand Hygiene in Health Care. First Global Patient Safety Challenge, Clean Care is Safer Care. Available from: http://whqlibdoc.who.int/publications/2009/9789241597906_eng.pdf (2009).
  21. Boyce, J. M., Pittet, D. Guideline for Hand Hygiene in Health-Care Settings Recommendations of the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee and the HICPAC/SHEA/APIC/IDSA Hand Hygiene Task Force. Infect Control Hosp Epidemiol. 23, (12 Suppl), Society for Healthcare Epidemiology of America. S3-S40 (2002).
  22. Emmanuel, J., Ndoye, B. UNDP Medical Waste Experts Assessment and Recommendations Regarding Management of Ebola-Contaminated Waste. United Nations Development Programme. Available from: https://noharm-global.org/sites/default/files/documents-files/3127/Report%20to%20WHO%20WASH%20and%20Geneva%20on%20Ebola%20final.pdf (2015).
  23. Hopman, J., Kubilay, Z., Allen, T., Edrees, H., Pittet, D., Allegranzi, B. Efficacy of chlorine solutions used for hand hygiene and gloves disinfection in Ebola settings: a systematic review. Antimicrob Resist Infect Control. 4, (1), 1 (2015).
  24. Lowbury, E. J. L., Lilly, H. A., Bull, J. P. Disinfection of hands: removal of transient organisms. BMJ. 2, (5403), 230-233 (1964).
  25. Edmonds, S. L., Zapka, C., et al. Effectiveness of Hand Hygiene for Removal of Clostridium difficile Spores from Hands. Infect Control Hosp Epidemiol. 34, (3), 302-305 (2013).
  26. Rotter, M. L. 150 years of hand disinfection-Semmelweis' heritage. Hyg Med. (22), 332-339 (1997).
  27. Hitomi, S., Baba, S., Yano, H., Morisawa, Y., Kimura, S. Antimicrobial effects of electrolytic products of sodium chloride--comparative evaluation with sodium hypochlorite solution and efficacy in handwashing. Kansenshōgaku Zasshi. 72, (11), 1176-1181 (1998).
  28. ASTM International. Standard E1174-13. Standard Test Method for Evaluation of the Effectiveness of Health Care Personnel Handwash Formulations. Available from: https://www.astm.org/ (2013).
  29. Casanova, L. M., Weaver, S. R. Evaluation of eluents for the recovery of an enveloped virus from hands by whole-hand sampling. J Appl Microbiol. 118, (5), 1210-1216 (2015).
  30. Sinclair, R. G., Rose, J. B., Hashsham, S. A., Gerba, C. P., Haas, C. N. Criteria for Selection of Surrogates Used To Study the Fate and Control of Pathogens in the Environment. Appl Environ Microbiol. 78, (6), 1969-1977 (2012).
  31. Held, E., Skoet, R., Johansen, J. D., Agner, T. The hand eczema severity index (HECSI): A scoring system for clinical assessment of hand eczema. A study of inter- and intraobserver reliability. Br J Dermatol. 152, (2), 302-307 (2005).
  32. Chlorine Total, Iodometric Method Using Sodium Thiosulfate, Method 8209 Digital Titrator. Available from: http://www.hach.com/asset-get.download-en.jsa?id=7639983937 (2016).
  33. GeneQuant 100 User Manual. Available from: http://biochromspectros.com/media/wysiwyg/support_page/support-genequant-100/Genequant-100-UM.pdf (2016).
  34. United States Environmental Protection Agency. Method 1604: Total Coliforms and Escherichia coli in Water by Membrane Filtration Using a Simultaneous Detection Technique (MI Medium). Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-08/documents/method_1604_2002.pdf (2002).
  35. Adams, M. H., Anderson, E. S. Bacteriophages. Interscience Publishers. New York. (1959).
  36. Kao, L. S., Green, C. E. Analysis of Variance: Is There a Difference in Means and What Does It Mean? The Journal of surgical research. 144, (1), 158-170 (2008).
  37. Schutz, R. W., Gessaroli, M. E. The Analysis of Repeated Measures Designs Involving Multiple Dependent Variables. Research Quarterly for Exercise and Sport. 58, (2), 132-149 (1987).
  38. Woolwine, J. D., Gerberding, J. L. Effect of testing method on apparent activities of antiviral disinfectants and antiseptics. Antimicrob Agents Chemother. 39, (4), 921-923 (1995).
Een methode om de werkzaamheid van handwashing te testen voor de verwijdering van opkomende infectieuze pathogenen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).More

Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter