Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En metode for å teste effekten av håndvask for fjerning av nye smittsomme patogener

Published: June 7, 2017 doi: 10.3791/55604

Summary

Håndvask anbefales på det sterkeste for å forhindre overføring av smittsomme sykdommer. Det er imidlertid lite bevis på hvilke håndvaskmetoder som er mest effektive for å fjerne smittsomme sykdomspatogener. Vi utviklet en metode for å vurdere effekten av håndvask-metoder ved fjerning av mikroorganismer.

Abstract

Håndvask anbefales på det sterkeste for å forhindre overføring av smittsomme sykdommer. Imidlertid eksisterer det lite sammenlignbare bevis på effekten av håndvaskmetoder generelt. I tillegg finnes det lite bevis som sammenligner håndvaskmetoder for å bestemme hvilke som er mest effektive for å fjerne smittsomme patogener. Forskning er nødvendig for å gi bevis for de ulike tilnærmingene til håndvask som kan brukes under infeksjonssykdomsutbrudd. Her beskrives en laboratoriemetode for å vurdere effekten av håndvaskmetoder ved fjerning av mikroorganismer fra hender og deres persistens i skyllvann. Frivilliges hender blir først spiket med testorganismen og deretter vasket med hver håndvask-metode av interesse. Vanligvis brukes surrogatmikroorganismer for å beskytte mennesker mot sykdom. Antall organismer som gjenstår på frivilliges hender etter vask, testes ved hjelp av en modifisert "hanske juice" metode: hendene er plassert i hansker med en eluOg skrubbes for å suspendere mikroorganismer og gjøre dem tilgjengelige for analyse ved membranfiltrering (bakterier) eller plaqueanalyse (virus / bakteriofager). Skyll vann som er produsert fra håndvask, samles inn direkte for analyse. Håndvaskeffektivitet kvantifiseres ved å sammenligne loggreduksjonsverdien mellom prøver tatt etter håndvasking til prøver uten håndvasking. Skyll vannbestandighet kvantifiseres ved å sammenligne skyllvannsprøver fra forskjellige håndvaskmetoder til prøver samlet etter håndvask med bare vann. Selv om denne metoden er begrenset av behovet for å bruke surrogatorganismer for å bevare sikkerheten til humane frivillige, inntar det aspekter av håndvask som er vanskelige å replikere i en in vitro- studie og fyller forskningsgap på håndvaskingseffekt og persistensen av smittsomme organismer i skylling vann.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Håndvask anbefales på det sterkeste for å forhindre spredning av sykdom, særlig de som overføres av fekal-orale eller luftbårne ruter, inkludert diarre- og respiratoriske sykdommer 1 . Overraskende er det lite sammenlignbare bevis på effekten av håndvaskmetoder, for eksempel håndvask med såpe og vann (HWWS) og med alkoholbasert håndvern (ABHS), på fjerning av organismer fra hendene. Initial forskning har funnet ut at den mekaniske virkningen av håndvask, i motsetning til håndvaskmetoden, kan utgjøre mest organismefjerning 2 , 3 . I tillegg er det lite sammenlignende bevis på hvilken håndvaskmetode som er mest effektiv. I en uformell litteraturvurdering ble 14 studier som sammenlignet effektiviteten av såpe og håndrensemiddel på fjerning av organismer, identifisert. Av disse studiene fant fem ABHS å være mer effektive 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 7 fant HWWS å være mer effektive 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 og to fant ingen signifikant forskjell mellom metodene 16 , 17 . Disse funnene er inkonsekvente og tar ikke hensyn til den pågående sykdomsrisikoen fra vedvarende organismer i skyllvannet etter håndvask. Samlet sett er bevis på den komparative effekten av håndvask-metoder for fjerning av smittsomme sykdomsfremkallende patogener begrenset.

Dette begrensede beviset har ført til usikkerhet om hvilke metoder som er mest hensiktsmessige i utbruddsinnstillinger. For eksempel, I løpet av Ebola Virus Disease (EVD) utbrudd i Vest-Afrika fra 2013 til 2016, ga flere store internasjonale respondenter motstridende anbefalinger for HWWS, ABHS eller 0,05% klorløsninger. Médecins Sans Frontières (MSF) anbefaler bruk av 0,05% klorløsning for håndvask, mens Verdens helseorganisasjon (WHO) anbefaler HWWS eller ABHS (hvis hendene ikke er synlig skitne). WHO går så langt som å anføre at klor ikke skal brukes med mindre det ikke finnes andre muligheter fordi det er mindre effektivt enn andre metoder på grunn av klor etterspørsel utført av huden 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . I tillegg produseres kloroppløsninger vanligvis fra fire forskjellige klorforbindelser, inkludert høyt testhypokloritt (HTH), lokalt generert og stabilisert natriumhypokloritt (NaOCl), og sodIum dikloroisocyanurat (NaDCC). En systematisk gjennomgang på vegne av WHO som svar på EVD-utbruddet i Vest-Afrika fant nylig bare fire studier som undersøker den komparative effekten av håndvask med klor 23 . Disse studiene ga også motstridende resultater, og ingen av disse studiene brukte den anbefalte klorkonsentrasjonen på 0,05% for håndvask eller undersøkt mikroorganismer som ligner på Ebola-viruset 10 , 24 , 25 , 26 , 27 . Anbefalingene ble således ikke funnet å være bevisbaserte, og det var uklart hvilke anbefalinger som var mest effektive.

Ytterligere undersøkelser er nødvendig for å sammenligne håndvaskende tilnærminger for å forhindre spredning av smittsomme patogener, da håndvaskingstiltak er et viktig verktøy for å forebygge epidemisk sykdomsoverføring. Disse hAndwashing anbefalinger må være basert på bevis. Således ble en metode for å teste håndvask effektivitet og skyllende vann persistens utført med surrogater eller ikke-smittsomme patogener, utviklet 2 , 28 , 29 . Prøveresultater, ved bruk av Phi6 som en surrogat for Ebola-viruset og bruk av Escherichia coli som en felles indikatororganisme, presenteres her. I denne protokollen presenteres håndvasking av effektivitet og skylling av vannholdighetstest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etikkerklæring: Studien som er beskrevet her (på Phi6 og E. coli som surrogater for Ebola) ble godkjent av Institutional Review Board ved Tufts Medical Center og Tufts University Health Sciences Campus (# 12018); Harvard University ceded anmeldelse til Tufts Institutional Review Board.

MERK: Før du begynner denne protokollen, må to trinn utføres. For det første må en Biosafety Level 1 (BSL-1) surrogat eller ikke-smittsom versjon av patogenet som skal studeres, som er trygt å bruke på mennesker, identifiseres og velges 30 . En BSL-1-surrogat eller ikke-infeksiøst patogen er nødvendig for denne protokollen, da organismen vil bli brukt til å inokulere de bare hendene til menneskelige frivillige. For det andre må godkjenning fra det lokale institusjonelle gjennomgangsstyret for å gjennomføre forskning med menneskelige emner innhentes før rekrutteringen av frivillige eller påbegynnelsen av forsøket. Mange aspekter av denne protokollen kan justeres for å møte thE spesifikke behov for forskningsprosjekter av interesse.

1. Rekruttere kvalifiserte menneskelige emner

  1. Rekruttere frivillige ved å legge inn papirfly på offentlige oppslagstavler og sende e-post til grupper med medlemmer som kan være interessert i å delta. Disse kunngjøringene bør inneholde studieformål, kontaktinformasjon og kvalifikasjonskriterier.
  2. Møt med frivillige å vurdere berettigelse. Bekreft at frivillige er sunne, mellom 18 og 65 år, og ikke for øyeblikket gravid eller tar antibiotika, og at de ikke har hudskader / forstyrrelser, kjente allergier mot håndvaskemidler eller historie om psykiske helsemessige problemer knyttet til hygiene.
  3. Få kvalifiserte frivillige til å lese samtykkeskjemaer. Svar på eventuelle spørsmål de stiller og få frivillig og etterforsker signere to eksemplarer av skjemaet. Behold ett skjema og gi en til frivillig.
  4. Administrer en grunnlinjeundersøkelse, inkludert spørsmål om demografisk informasjon, personAl historie av hudforhold, og informasjon om nylig håndvasking. Undersøk hender for tegn på dermatitt, hudskader eller abnormiteter i grunnlinjen 31 .
  5. Planlegg frivillige for to testmøter for hver organisme av interesse (en for testing med jordbelastning og en for testing uten). Oppgi frivillige for å unngå antimikrobielle produkter i en syv-dagers utvaskingsperiode før testing for å unngå forstyrrelser fra personlig produktbruk.
    1. Gi frivillige med antimikrobielle produkter (sjampo, balsam og såpe) å bruke i stedet for deres vanlige produkter. Gi kraftige vinylhansker og instruer fagene til å bruke dem når du bruker produkter som husrengjøringsprodukter.

2. Forbered håndvaskløsninger som vanligvis brukes i nødrespons (såpe, ABHS, 0,05% HTH, NaDCC og NaOCl-løsninger)

MERK: Klorløsninger kan prep Arer opp til 12 timer før forsøket, men vil nedbrytes hvis det er lagret> 12 timer.

  1. Velg og kjøp en såpe som er relevant for konteksten som testen utføres for.
    MERK: I de fleste tilfeller vil det være en såpe for infeksjonssykdommer i utviklingslandene.
  2. Velg og kjøp en ABHS-løsning som er relevant for konteksten som testen utføres for.
    MERK: Den valgte ABHS skal ha en etylalkohol-kontekst som er større enn eller lik 70% for å sikre effekt.
  3. Klargjør en 0,05% kalsiumhypokloritt (Ca (ClO) 2 ) løsning ved å tilsette granulært Ca (ClO) 2 pulver til ultrapure vann. Bestem mengden løsning som trengs, basert på antall emner som skal testes.
    1. Ved hjelp av følgende ligning, bestemme mengden pulver som trengs for å tilberede ønsket mengde oppløsning i et gitt volum vann ved å bruke en gitt prosent av ledig klor:
      /files/ftp_upload/55604/55604eq1.jpg "/>
      MERK: Ca (ClO) 2 pulver har typisk 60-80% tilgjengelig klor.
  4. Klargjør en 0,05% natriumdiklorisocyanurat-løsning (NaDCC) ved å tilsette et granulært NaDCC-pulver til ultrapure vann.
    1. Ved hjelp av følgende ligning, bestemme mengden pulver som trengs for å tilberede ønsket mengde oppløsning i et gitt volum vann ved å bruke en gitt prosent av ledig klor:
      ligningen
      MERK: NaDCC pulver har vanligvis ca. 50% tilgjengelig klor.
  5. Forbered stabilisert 0,05% NaOCl oppløsning ved å tilsette natriumhypokloritt-oppløsning til ultrapure vann.
    1. Bekreft konsentrasjonen av NaOCl-stamopløsningen (sannsynligvis 5-8%) ved hjelp av en titreringsprøve metode i henhold til produsentens instruksjoner ( f.eks. Iodometrisk titrering, se materiallisten for suGgested kit).
    2. Bruk resultatene av testmetoden, beregne mengden løsning som skal tilsettes til vann ved å bruke følgende ligning:
      ligningen
  6. Forbered stabilisert 0,05% NaOCl-løsning ved å tilsette natriumhypoklorittoppløsning produsert ved hjelp av en elektroklorator, ultralitt vann og natriumklorid i laboratoriumklorid (NaCl) til ultralitt vann.
    1. Klargjør en 1% kloroppløsning med ultrapure vann og NaCl, ved hjelp av en elektroklorator i henhold til produsentens anvisninger.
    2. Bruk en titreringstestmetode ( f.eks. Iodometrisk titrering) for å bekrefte konsentrasjonen av NaOCl stamløsning 32 .
    3. Bruk resultatene av testen, beregne mengden løsning som skal tilsettes til vann ved å bruke følgende ligning:
      ligningen
  7. Bekreft cKonsentrasjon av hver av klorhåndvaskmiddelene ved hjelp av en titreringsmetode ( f.eks. Iodometrisk titrering) og juster løsningene ved å legge til vann eller klor kildepulver / løsning til de ligger innenfor en 10% feil av målkonsentrasjonen (0,045-0,055%).

3. Forbered organismer og jordbelastning og kombinere for å produsere inokulatoren

MERK: I følgende underavsnitt brukes E. coli og Phi6 som prøve bakterielle og virale organismer for metodebeskrivelsen.

  1. Forbered organismen som skal brukes til testing ved en konsentrasjon på over 10 x 10 8 CFU / ml for bakterier og større enn 10 x 107 PFU / ml for virus.
    1. For å forberede E. coli , strek en nonpatogen stamme av E. coli på Luria-Bertani (LB) agarplater og inkuber ved 37 ° C i 24 timer for å oppnå enkle kolonier. Oppbevares ved 4 ° C.
      MERK: Dette kan gjøres avskåretAl dager før eksperimentering.
      1. En dag før forsøkets start, velg en enkelt koloni fra platen og inokuler 10 ml LB-buljong ved hjelp av en steril sløyfe. Inkuber natten over ved 37 ° C med risting.
      2. På morgenen for forsøket, start en fersk kultur ved å tilsette 1 ml av over natten kulturen til 20 ml frisk LB buljong. Inkubér i ca. 2,5 timer for å oppnå en celletetthet større enn 10 8 CFU / mL.
      3. Bruk et spektrofotometer til å estimere konsentrasjonen av kulturen.
        MERK: Bruk en tidligere etablert konverteringsfaktor fra en standardkurve for den anvendte E. coli- stammen, noe som sikrer en konsentrasjon på over 10 8 CFU / mL 33 . Hvis celletettheten ikke er høy nok, returner kulturen til inkubatoren og test igjen til klar.
    2. Bekreft konsentrasjonen ved hjelp av membranfiltrering 34 .
      MERK: Utfør serielle fortynninger oF kulturen i fosfatbuffert saltvann (PBS) slik at løsningen filtrert vil gi et antall antall kolonier på tallerkenen (det nøyaktige tallet vil avhenge av det anvendte mediet).
      1. Sett opp en flamme og et filtreringsmanifold med sterile filtreringstanker og en vakuumforbindelse. Steriliser tangen ved å flamme dem med etanol. Bruk dem til å plassere et 0,45 μm filter på filtreringsgrenrøret, med rutenettet vendt oppover. Våt filteret med en liten mengde steril PBS.
      2. Plasser trakten på basen og tilsett prøveoppløsningen som skal behandles ved pipettering eller hell direkte på filteret. Engasj vakuumet inntil hele prøven har passert gjennom membranen. Skyll sidene av trakten med sterilt PBS og ta igjen vakuumet igjen.
        MERK: Prøver skal være minst 100 μl og opptil 100 ml. Hvis en prøve er mindre enn 10 ml, tilsett ca. 20 ml PBS til filtrertratten før filtrering for å sikre ensartet filtrering av sampetle.
      3. Fjern trakten, flamme-steriliser tangen og løft filteret fra basen. Plasser filteret forsiktig på LB-agaret i en Petri-tallerken, med rutenettet vendt opp, slik at filteret ligger flush mot overflaten. Inverter platene og inkuber i 24 timer ved 37 ° C.
      4. Etter 24 timer, fjern platene fra inkubatoren og telle E. coli koloniene. Bruk disse dataene og den kjente fortynningsfaktoren og volumet av løsningen for å beregne konsentrasjonen av den filtrerte løsningen i CFU / mL.
    3. Propagere Phi6 i Pseudomonas syringae- vert ved bruk av dobbelt agaroverleggingsmetoden 35 .
      1. Tilsett 100 μl Phi6-stamcelsuspensjon og 100 μl P. syringae over nattkultur direkte til 6 ml næringsstoffbuljong gjær (NBY) myk agar (0,3%). Hell den på platene med NBY hard agar (1,5%) og inkuber natten over ved 26 ° C. Forbered nok plater til å produsere nok inokulum til ekspertenEstimering av et utbytte på ca. 4 ml viral suspensjon per plate.
      2. Neste dag, tilsett 5 ml PBS på toppen av det myke agarlaget. La det stå ved romtemperatur i 4 timer, hent det med en pipette, og filtrer det med et 0,45 μm filter. Oppbevares ved 4 ° C.
        MERK: Denne løsningen vil tjene som viral inokulering.
    4. Bruk en plaqueanalyse for å bekrefte at konsentrasjonen er større enn 10 7 PFU / mL 35 . Utfør serielle fortynninger av den virale suspensjonen i PBS slik at 100 μl produserer et tallbart antall plakk på platen.
      1. Pipetter 100 μl av en passende fortynnet prøve og 100 μl av vertskapskultur over natten direkte inn i et rør inneholdende 6 ml NBY myk agar. Hell soft agar over NBY hard agar og inkuber ved 26 ° C i 24 timer.
      2. Neste dag, fjern platene fra inkubatorene og teller antall plaketter per plate. Bruk disse dataene og den kjente fortynningsfasenCtor og volum av løsningen for å beregne konsentrasjonen av den filtrerte løsningen i PFU / mL.
  2. Forbered tredelt jordbelastning, beregnet på å etterligne humant serum.
    1. Kombiner 7,80 mg / ml bovint serumalbumin, 10,92 mg / ml trypton og 2,52 mg / ml bovint mucin for å produsere det nødvendige volumet av jordbelastning. Etter å ha blandet jordbelastningen, filtrer den gjennom et 0,22 μm filter for å sterilisere. Oppbevar det ved 4 ° C til bruk. Ikke varm steriliser, da proteiner vil denaturere.
  3. Klargjør en 0,9% NaCl løsning for å blande inokulatet for forhold uten jordbelastning.
  4. Umiddelbart før testingen, lag et inokulum sammensatt av 68% bakteriell eller viral suspensjon og 32% jordbelastning. For eksempel, bruk 1,02 ml bakteriell eller viral suspensjon fra trinn 3.1.1.2 eller 3.1.3.2 og 0.48 ml av enten jordbelastning (trinn 3.2.1) eller 0,9% NaCl-oppløsning (trinn 3.3). Vri eller virvel for å blande.
    MERK: 1,5 ml av detteInokulum vil bli brukt for hver frivillig under hver tilstand, så sørg for at det totale volumet av det preparerte inokulum er tilstrekkelig for det tiltenkte antall test.

4. Forberede frivillige til forsøket

MERK: Bestem organismen og jordbelastningsforholdet som skal testes den dagen. De samme frivillige kan brukes til å teste flere forhold, men hver frivillig skal bare underkastes en runde av testing i løpet av 48 timer.

  1. Før du begynner å teste, bekreft at frivillige forblir kvalifisert ved å verifisere at de fulgte den 7 dagers antimikrobielle utvaskingsperioden og visuelt bekrefter at de ikke har utviklet noen brudd eller abnormiteter på huden.
  2. Bruk en tilfeldig talgenerator, tilordne hver frivillig til å bruke enten høyre eller venstre hånd for prøvetaking på denne testdagen. Tilordne en ordre der håndvaskforholdene skal utføres.
    MERK: ForEksempel, ABHS kan tildeles # 3 og vil bli utført tredje.
  3. Utfør en "rensende vask" en gang i starten av testingen for å fjerne huden av smuss og oljer, slik at hver etterfølgende test utføres under tilsvarende betingelser.
    1. For å gjøre en rensende vask, løp gjennom hvert trinn i forsøket (seksjon 5 nedenfor), ved hjelp av en tomt inokuler (kun LB-buljong eller PBS) og ta en prøve uten håndvask.

5. Eksperimentell prosedyre

  1. For å teste pH i huden på hver frivillig (for å kontrollere for variasjon), plasser en flat-tipped hud-pH-sonde på palmar overflatehuden og webområdet mellom pekeren og midterfingrene. Sørg for at elektroden er flatt mot huden. Ta opp pH-lesingen.
  2. Spike hendene.
    1. Ha frivillige koppen begge hender sammen. Spike hendene med 1,5 ml av inokulatoren ved å forsiktig pipette 750 μL sakte inn i hver håndflate.
    2. Frivillig forsiktig gni hendene sammen til alle overflater av hånden er belagt med inokulatoren mens du underkaster hendene så lite friksjon som mulig.
    3. Få frivillige til å holde hendene stille og vekk fra kroppen i ytterligere 30 s for å tillate at inokulatoren tørker. Inokulatet kan ikke tørke helt.
  3. Vask hendene.
    1. For alle følgende vaske trinn, fange skyllvannet fra hendene i en stor prøveoppsamlingspose. Tilsett 4,5 ml av en 12% natriumtiosulfatløsning til posen for å nøytralisere kloret ved kontakt og prosess innen 2 timer.
      MERK: Natriumtiosulfat bør tilsettes til alle prøver (selv de som ikke er klor) for å kontrollere for eventuelle virkninger det kan ha på organismen.
    2. Etter inokulering (avsnitt 5.2), vask hendene med neste metode i den angitte rekkefølgen.
      1. For kontroll A, ikke utfør et håndvaskstrinn og gå direkte til trinn5.5.
      2. For kontroll B må du vaske hendene med kun ultralitt vann ved romtemperatur (ca. 21 ° C) gjennom en trakt med kjent strømningshastighet.
        MERK: Her ble en strømningshastighet på 1,5 L / m og 500 ml vann anvendt.
      3. Ved håndvask med såpe, må du vaske hendene med 10 ml ultralitt vann. Få frivillige til å skumme hendene med såpe og gni deretter hendene sammen for ytterligere 20 s. Skyll hendene ved å hente 500 ml ultralitt vann ved romtemperatur gjennom en trakt med en strømningshastighet på 1,5 l / m.
      4. For alle kloroppløsninger ( f.eks. ABHS, HTH, NaDCC og NaOCl), hell 200 ml kloroppløsning gjennom en trakt med en strømningshastighet på 1,5 l / m og frivillig gni hendene grundig.
  4. Håndskyll med en modifisert hanskesaftprosedyre.
    1. Etter håndvask, plasser umiddelbart hver frivilliges hånd ( dvs. hånden (høyre eller venstre) valgt for testiNg i trinn 4.2) i en prøvepose som inneholder 75 ml elueringsmiddel ( f.eks. PBS) opp til håndleddet. Hold toppen av posen tett rundt håndleddet.
      MERK: Bruk et elueringsmiddel for prøvetaking som inneholder tilstrekkelig natriumtiosulfat til å nøytralisere klor som brukes til håndvask. PBS er en vanlig elueringsmiddel som passer for mange organismer.
    2. Frivillig forsiktig gni hånden i løsningen i 30 s, pass på å nå mellom fingrene og under neglene. Masser hånden ut av posen forsiktig i 30 s for å sikre at hele hånden skylles grundig i eluenten helt opp til håndleddet.
    3. Tørk posen og behandle den i henhold til riktig analyse, beskrevet i seksjon 6, innen 2 timer.
  5. Dekontaminering.
    1. Før du gjentar prosessen med hver håndvask, må frivillige vaske hendene grundig i en vask med såpe og varmt vann. Spray frivilligeRs 'hender med 70% etanol til de er belagt på begge sider. La dem tørke.
    2. Gjenta alle trinnene i avsnitt 5 for hver håndvask, bare ved å bruke hånden tilfeldig valgt i trinn 4.2 ( figur 1 ).

6. Kvantifisering

  1. Utfør analyser som er passende for den valgte organismen ( f.eks. Membranfiltrering for bakterier eller plaqueanalyse for virus, beskrevet ovenfor i henholdsvis avsnitt 3.1.2 og 3.1.4).
  2. Etter å ha telt platene, registrer du estimert CFU / mL eller PFU / mL for hver test for analysene (avsnitt 3.1.2 og 3.1.4).

7. Analyse

  1. Bruk resultatene fra trinn 6.2, beregne loggreduksjonsverdien av organismer på hendene, for hver organisme og jordbelastningsstatus og for hvert emne og håndvaskmetode.
    1. For håndvask effektivitet, sammenlign konsentrasjonen av bakterier / virus i hver Håndvaskeprøve for å kontrollere A (ingen håndvask). For skyllvannstendighet, sammenlign hver skyllvannsprøve for å kontrollere B (vask kun med vann). Bruk følgende standardformel:
      Logreduksjon (håndvask ) = ligningenligningen
      Log Reduksjon (skyll vann ) = ligningenligningen
      MERK: Logreduksjon kan også uttrykkes som logg 10 (uten håndvask) - log 10 (med håndvask)
  2. Bruk en enveis gjentatt måleanalys av varians (ANOVA) for å vurdere de betydelige forskjellene i de beregnede loggreduksjonsverdiene mellom håndvaskmetoder og en post-hoc Tukey's HSD-test for signifikante modeller for å parvis vurdere betydelige forskjeller (p <0,05)Ef "> 36.
    1. Før du kjører ANOVA, vurder hvert datasett for sfærisme ( f.eks. Ved bruk av Bartlett's test). Bruk en korreksjon ( f.eks . Greenhouse-Geisser-korreksjonen) når testen indikerer at sfæriskheten ble krenket 37 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her ble protokollen ( figur 1 ) fullført med 18 frivillige, som ble testet ved bruk av både E. coli og Phi6. Det ble funnet signifikante forskjeller mellom håndvaskresultatene med E. coli både med og uten jordbelastning og Phi6 med jordbelastning ( Figur 2 og Figur 3 ). For E. coli uten jordbelastning ga håndvask med HTH, NaDCC og stabilisert NaOCl alle signifikant større loggreduksjoner enn håndvask med vann bare (F (6,102) = 2,72, p = 0,034). Med jordbelastning resulterte HTH i en signifikant større loggreduksjon av E. coli enn bare vann, HWWS og ABHS (F (6.102) = 3,94, p <0,001). Det var ingen signifikant forskjell mellom metoder for Phi6 uten jordbelastning (F (6,66) = 2,04, p = 0,073). For Phi6 med jordbelastning (F (6,102) = 7,01, p <0,001) resulterte imidlertid vann alene i en grepAter log reduksjon enn ABHS eller stabilisert NaOCl og HWWS i en større log reduksjon enn ABHS, stabilisert NaOCl og generert NaOCl. HTH hadde også en større loggreduksjon enn ABHS og stabilisert NaOCl, og NaDCC resulterte i en større logreduksjon enn stabilisert NaOCl og ABHS. Mens HTH utførte mest konsekvent godt på tvers av forholdene, ville vi være forsiktige mot overfortolkning av signifikante resultater, da mange konfidensintervaller var store, varierende fra mindre enn 0,5 logg til mer enn 1,5 logreduksjon i mange tilfeller.

I skyll vann resulterte klor i en signifikant større loggreduksjon av E. coli som vedvarer i skyllvannet enn HWWS (uten jordbelastning, F (4,68) = 331,7, p <0,001, med jordbelastning, F (4,68) ) = 162,44, p <0,001) ( figur 4 ). Dette samme mønster ble funnet i Phi6 uten jordbelastning ((F (4,43) = 8,95, P <0,001), med alle kloroppløsninger som resulterte iAntennelig større reduksjon av Phi6 i skyllvann enn HWWS. Det var ingen signifikante forskjeller i utholdenhet i skyllvann med Phi6 og jordbelastning ((F (4,67) = 3,35, p = 0,071) ( Figur 5 ).

Figur 1
Figur 1: Eksperimentoversikt. De fem trinnene som gjennomføres for hver håndrullsrunde inkluderer: 1) pH-test, 2) Inokulere hendene, 3) Håndvask, 4) Skyll hendene, og 5) Dekontaminere hendene for hver av de 8 testede forholdene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: E. coli håndvask res ults. Sammenlignet med ikke håndvask, resulterte de håndholdte metoden i en gjennomsnittlig logreduksjon i E. coli på 1,94-3,01 uten jordbelastning og 2,18-3,34 med jordbelastning. Håndvask med vann viste minst reduksjon i E. coli under begge forhold (1,94 og 2,18 logg). Håndvask med NaDCC resulterte i den største reduksjonen uten jordbelastning (3,01), og HTH resulterte i størst reduksjon med jordbelastning (3,34). I diagrammene representerer linjen prosentvis reduksjon i organismer, og feillinjene representerer standardfeilen for loggreduksjon. Ctrl B, kontroll B; HWWS, håndvask med såpe; ABHS, alkoholbasert håndrensemiddel; HTH, høyt test hypokloritt; NaDCC, natriumdiklorisocyanurat; St NaOCl, stabilisert natriumhypokloritt; Gen NaOCl, generert natriumhypokloritt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 3
Figur 3: Phi6 håndvask resultater. Sammenlignet med ikke håndvask, resulterte de håndholdte metoder som ble testet, i en gjennomsnittlig loggreduksjon i Phi6 på 2,44-3,06 uten jordbelastning og 2,71-3,69 med jordbelastning. Håndvask med såpe viste minst reduksjon i Phi6 uten jordbelastning (2,44), og håndvask med stabilisert NaOCl resulterte i den minste reduksjonen med jordbelastning (2,71). Håndvask med generert NaOCl resulterte i den største reduksjonen uten jordbelastning (3,06), og håndvask med såpe resulterte i den største reduksjonen med jordbelastning (3,69). I diagrammene representerer linjen prosentvis reduksjon i organismer, og feillinjene representerer standardfeilen for loggreduksjon. Ctrl B, kontroll B; HWWS, håndvask med såpe; ABHS, alkoholbasert håndrensemiddel; HTH, høyt test hypokloritt; NaDCC, natriumdiklorisocyanurat;St NaOCl, stabilisert natriumhypokloritt; Gen NaOCl, generert natriumhypokloritt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: E. coli håndskyllingsresultater. Sammenlignet med håndvask med bare vann var gjennomsnittlig loggreduksjon av E. coli som var igjen i skyllvannet 0,28-4,77 uten jordbelastning og 0,21-4,49 med jordbelastning. Både med og uten jordbelastning ble den minste reduksjonen funnet i håndvask med såpe (0,28 og 0,21). De største reduksjonene ble observert med stabilisert og generert NaOCl uten jordbelastning (både 4,77) og med HTH og generert NaOCl med jordbelastning. I diagrammene representerer linjen prosentvis reduksjon i organismer, og feilstavene representerer sTandard feil med log reduksjon. HWWS, håndvask med såpe; ABHS, alkoholbasert håndrensemiddel; HTH, høyt test hypokloritt; NaDCC, natriumdiklorisocyanurat; St NaOCl, stabilisert natriumhypokloritt; Gen NaOCl, generert natriumhypokloritt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: Phi6 håndskyllingsresultater. Sammenlignet med håndvask kun med vann var den gjennomsnittlige loggreduksjonen av Phi6 som var igjen i skyllvannet 1,26-2,02 uten jordbelastning og 1,30-2,20 med jordbelastning. Ved jordbelastning ble den minste reduksjonen funnet i håndvask med såpe (1,26). Uten jordbelastning resulterte HTH i den minste reduksjonen (2.02). De største reduksjonene ble observert både med og uten jordbelastning med NaDCC(2,02 og 2,20). I diagrammene representerer linjen prosentvis reduksjon i organismer, og feillinjene representerer standardfeilen for loggreduksjon. HWWS, håndvask med såpe; ABHS, alkoholbasert håndrensemiddel; HTH, høyt test hypokloritt; NaDCC, natriumdiklorisocyanurat; St NaOCl, stabilisert natriumhypokloritt; Gen NaOCl, generert natriumhypokloritt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av United States Agency for International Development, Office of Foreign Disaster Assistance (AID-OFDA-A-15-00026). Marlene Wolfe ble støttet av National Science Foundation (stipend 0966093).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soap bar Dove White Beauty Bar soap
Alcohol-based hand sanitizer Purell Advanced Instant Hand Sanitizer with 70% Ethyl Alcohol
HTH Powder Acros Organics 300340010
NaDCC Powder Medentech Klorsept granules
NaOCl Solution Acros Organics 419550010
Electrochlorinator AquaChlor
Iodometric titrator Hach 1690001
Bovine serum albumin MP Biomedicals NC0117242
Tryptone Fisher BP1421-100
Bovine Mucin EMD Milipore 49-964-3500MG
0.22 µm Filter EMD Milipore GVWP04700
NaCl Fisher BP358-1
Skin pH probe Hanna Instruments H199181
Large Whirlpak Sample Bag Nasco B01447WA
Small Whirlpak Sample Bag Nasco B01323WA
Funnel bottle Thermo Scientific 3120850001 You may drill an appropriately sized hole in the lid of a bottle to form a funnel that will dispense water at the appropriate flow rate
Ethanol ThermoScientific 615090010 Mix with water to produce 70% ethanol
Spray bottle Qorpak PLC06934
E. coli ATCC 25922
LB Broth Fisher BioReagents BP1426-2
LB Agar Fisher BioReagents BP1425-500
Sterile loop Globe Scientific 22-170-204
Phi6 HER 102
Nutrient broth BD Difco BD 247110
GeneQuant 100 Spectrophotometer General Electric 28-9182-04
Sodium thiosulfate Fisher Chemical S445-3
Membrane filter (47 mm, 0.45 µm) EMD Millipore HAWP04700
m-ColiBlue24 broth media EMD Millipore M00PMCB24
Petri dish with pad (47 mm) Fisherbrand 09-720-500
Vacuum Manifold Thermo Scientific/Nalgene 09-752-5
Filter funnels Thermo Scientific/Nalgene 09-747
Pseudomonas syringae HER 1102
Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific 10010031 Solution may also be mixed from source compounds according to any basic recipe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kampf, G., Kramer, A. Epidemiologic Background of Hand Hygiene and Evaluation of the Most Important Agents for Scrubs and Rubs. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 863-893 (2004).
  2. Miller, T., Patrick, D., Ormrod, D. Hand decontamination: influence of common variables on hand-washing efficiency. Healthc Infect. 16, (1), 18 (2013).
  3. Jensen, D. A., Danyluk, M. D., Harris, L. J., Schaffner, D. W. Quantifying the effect of hand wash duration, soap use, ground beef debris, and drying methods on the removal of Enterobacter aerogenes on hands. J Food Prot. 78, (4), 685-690 (2015).
  4. Girou, E., Loyeau, S., Legrand, P., Oppein, F., Brun-Buisson, C. Efficacy of handrubbing with alcohol based solution versus standard handwashing with antiseptic soap: randomised clinical trial. BMJ. 325, (7360), 362 (2002).
  5. Kac, G., Podglajen, I., Gueneret, M., Vaupré, S., Bissery, A., Meyer, G. Microbiological evaluation of two hand hygiene procedures achieved by healthcare workers during routine patient care: a randomized study. J Hosp Infect. 60, (1), 32-39 (2005).
  6. Lages, S. L. S., Ramakrishnan, M. A., Goyal, S. M. In-vivo efficacy of hand sanitisers against feline calicivirus: a surrogate for norovirus. J Hosp Infect. 68, (2), 159-163 (2008).
  7. Holton, R. H., Huber, M. A., Terezhalmy, G. T. Antimicrobial efficacy of soap and water hand washing versus an alcohol-based hand cleanser. Tex Dent J. 126, (12), Retrieved from: http://www.tda.org/Publications/Texas-Dental-Journal 1175-1180 (2009).
  8. Salmon, S., Truong, A. T., Nguyen, V. H., Pittet, D., McLaws, M. -L. Health care workers' hand contamination levels and antibacterial efficacy of different hand hygiene methods used in a Vietnamese hospital. Am J Infect Control. 42, (2), 178-181 (2014).
  9. Steinmann, J., Nehrkorn, R., Meyer, A., Becker, K. Two in-vivo protocols for testing virucidal efficacy of handwashing and hand disinfection. Int J Hyg Environ Health. 196, (5), Retrieved from: https://www.journals.elsevier.com/international-journal-of-hygiene-and-environmental-health 425-436 (1995).
  10. Weber, D. J., Sickbert-Bennett, E., Gergen, M. F., Rutala, W. A. Efficacy of selected hand hygiene agents used to remove Bacillus atrophaeus (a surrogate of Bacillus anthracis) from contaminated hands. JAMA. 289, (10), 1274-1277 (2003).
  11. Grayson, M. L., Melvani, S., et al. Efficacy of Soap and Water and Alcohol-Based Hand-Rub Preparations against Live H1N1 Influenza Virus on the Hands of Human Volunteers. Clin Infect Dis. 48, (3), 285-291 (2009).
  12. Oughton, M. T., Loo, V. G., Dendukuri, N., Fenn, S., Libman, M. D. Hand hygiene with soap and water is superior to alcohol rub and antiseptic wipes for removal of Clostridium difficile. Infect Control Hosp Epidemiol. 30, (10), 939-944 (2009).
  13. Liu, P., Yuen, Y., Hsiao, H. -M., Jaykus, L. -A., Moe, C. Effectiveness of liquid soap and hand sanitizer against Norwalk virus on contaminated hands. Appl Environ Micro. 76, (2), 394-399 (2010).
  14. Savolainen-Kopra, C., Korpela, T., et al. Single treatment with ethanol hand rub is ineffective against human rhinovirus--hand washing with soap and water removes the virus efficiently. J Med Virol. 84, (3), 543-547 (2012).
  15. Tuladhar, E., Hazeleger, W. C., Koopmans, M., Zwietering, M. H., Duizer, E., Beumer, R. R. Reducing viral contamination from finger pads: handwashing is more effective than alcohol-based hand disinfectants. J Hosp Infect. 90, (3), 226-234 (2015).
  16. Steinmann, J., Paulmann, D., Becker, B., Bischoff, B., Steinmann, E., Steinmann, J. Comparison of virucidal activity of alcohol-based hand sanitizers versus antimicrobial hand soaps in vitro and in vivo. J Hosp Infect. 82, (4), 277-280 (2012).
  17. de Aceituno, A. F., Bartz, F. E., et al. Ability of Hand Hygiene Interventions Using Alcohol-Based Hand Sanitizers and Soap To Reduce Microbial Load on Farmworker Hands Soiled during Harvest. J Food Protect. 78, (11), 2024-2032 (2015).
  18. Sterk, E. Médecins Sans Frontières - Filovirus Haemorrhagic Fever Guideline. Available from: http://jid.oxfordjournals.org/content/204/suppl_3/S791.full (2008).
  19. World Health Organization. WHO Report. Ebola Virus Disease ( EVD ) Key questions and answers concerning water, sanitation and hygiene. Available from: http://www.who.int/water_sanitation_health/WASH_and_Ebola.pdf 1-5 (2014).
  20. World Health Organization. Guidelines on Hand Hygiene in Health Care. First Global Patient Safety Challenge, Clean Care is Safer Care. Available from: http://whqlibdoc.who.int/publications/2009/9789241597906_eng.pdf (2009).
  21. Boyce, J. M., Pittet, D. Guideline for Hand Hygiene in Health-Care Settings Recommendations of the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee and the HICPAC/SHEA/APIC/IDSA Hand Hygiene Task Force. Infect Control Hosp Epidemiol. 23, (12 Suppl), Society for Healthcare Epidemiology of America. S3-S40 (2002).
  22. Emmanuel, J., Ndoye, B. UNDP Medical Waste Experts Assessment and Recommendations Regarding Management of Ebola-Contaminated Waste. United Nations Development Programme. Available from: https://noharm-global.org/sites/default/files/documents-files/3127/Report%20to%20WHO%20WASH%20and%20Geneva%20on%20Ebola%20final.pdf (2015).
  23. Hopman, J., Kubilay, Z., Allen, T., Edrees, H., Pittet, D., Allegranzi, B. Efficacy of chlorine solutions used for hand hygiene and gloves disinfection in Ebola settings: a systematic review. Antimicrob Resist Infect Control. 4, (1), 1 (2015).
  24. Lowbury, E. J. L., Lilly, H. A., Bull, J. P. Disinfection of hands: removal of transient organisms. BMJ. 2, (5403), 230-233 (1964).
  25. Edmonds, S. L., Zapka, C., et al. Effectiveness of Hand Hygiene for Removal of Clostridium difficile Spores from Hands. Infect Control Hosp Epidemiol. 34, (3), 302-305 (2013).
  26. Rotter, M. L. 150 years of hand disinfection-Semmelweis' heritage. Hyg Med. (22), 332-339 (1997).
  27. Hitomi, S., Baba, S., Yano, H., Morisawa, Y., Kimura, S. Antimicrobial effects of electrolytic products of sodium chloride--comparative evaluation with sodium hypochlorite solution and efficacy in handwashing. Kansenshōgaku Zasshi. 72, (11), 1176-1181 (1998).
  28. ASTM International. Standard E1174-13. Standard Test Method for Evaluation of the Effectiveness of Health Care Personnel Handwash Formulations. Available from: https://www.astm.org/ (2013).
  29. Casanova, L. M., Weaver, S. R. Evaluation of eluents for the recovery of an enveloped virus from hands by whole-hand sampling. J Appl Microbiol. 118, (5), 1210-1216 (2015).
  30. Sinclair, R. G., Rose, J. B., Hashsham, S. A., Gerba, C. P., Haas, C. N. Criteria for Selection of Surrogates Used To Study the Fate and Control of Pathogens in the Environment. Appl Environ Microbiol. 78, (6), 1969-1977 (2012).
  31. Held, E., Skoet, R., Johansen, J. D., Agner, T. The hand eczema severity index (HECSI): A scoring system for clinical assessment of hand eczema. A study of inter- and intraobserver reliability. Br J Dermatol. 152, (2), 302-307 (2005).
  32. Chlorine Total, Iodometric Method Using Sodium Thiosulfate, Method 8209 Digital Titrator. Available from: http://www.hach.com/asset-get.download-en.jsa?id=7639983937 (2016).
  33. GeneQuant 100 User Manual. Available from: http://biochromspectros.com/media/wysiwyg/support_page/support-genequant-100/Genequant-100-UM.pdf (2016).
  34. United States Environmental Protection Agency. Method 1604: Total Coliforms and Escherichia coli in Water by Membrane Filtration Using a Simultaneous Detection Technique (MI Medium). Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-08/documents/method_1604_2002.pdf (2002).
  35. Adams, M. H., Anderson, E. S. Bacteriophages. Interscience Publishers. New York. (1959).
  36. Kao, L. S., Green, C. E. Analysis of Variance: Is There a Difference in Means and What Does It Mean? The Journal of surgical research. 144, (1), 158-170 (2008).
  37. Schutz, R. W., Gessaroli, M. E. The Analysis of Repeated Measures Designs Involving Multiple Dependent Variables. Research Quarterly for Exercise and Sport. 58, (2), 132-149 (1987).
  38. Woolwine, J. D., Gerberding, J. L. Effect of testing method on apparent activities of antiviral disinfectants and antiseptics. Antimicrob Agents Chemother. 39, (4), 921-923 (1995).
En metode for å teste effekten av håndvask for fjerning av nye smittsomme patogener
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).More

Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter