Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Метод проверки эффективности мытья рук для удаления возникающих инфекционных патогенов

Published: June 7, 2017 doi: 10.3791/55604

Summary

Для предотвращения передачи инфекционных заболеваний рекомендуется использовать мытье рук. Однако мало доказательств того, что способы ручной стирки наиболее эффективны при удалении инфекционных патогенов. Мы разработали метод оценки эффективности методов ручного мытья при удалении микроорганизмов.

Abstract

Для предотвращения передачи инфекционных заболеваний рекомендуется использовать мытье рук. Тем не менее, существует мало сопоставимых доказательств эффективности методов ручного мытья в целом. Кроме того, имеется мало доказательств, сравнивающих способы ручного мытья, чтобы определить, какие из них наиболее эффективны при удалении инфекционных патогенов. Исследования необходимы, чтобы предоставить доказательства различных подходов к ручному мытью, которые могут быть использованы во время вспышек инфекционных заболеваний. Здесь описывается лабораторный метод оценки эффективности методов промывки рук при удалении микроорганизмов из рук и их стойкости в промывочной воде. Руки добровольцев сначала засыпают тестируемым организмом, а затем промывают с помощью каждого метода ручной стирки. Как правило, суррогатные микроорганизмы используются для защиты людей от болезней. Количество организмов, оставшихся на руках добровольцев после мытья, проверяется с использованием модифицированного метода «перчаточного сока»: руки помещаются в перчатки с элюсомИ вымываются, чтобы суспендировать микроорганизмы и сделать их доступными для анализа с помощью мембранной фильтрации (бактерий) или анализа бляшек (вирусы / бактериофаги). Промыть воду, полученную из мытья рук, собирают непосредственно для анализа. Эффективность промывки количественно оценивают путем сравнения величины уменьшения логарифма между образцами, взятыми после мытья рук, с образцами без ручного мытья. Прочность промывки воды количественно оценивается путем сравнения проб промывочной воды от различных методов ручной промывки с образцами, собранными после мытья рук с помощью только воды. Хотя этот метод ограничивается необходимостью использовать суррогатные организмы для сохранения безопасности добровольцев-людей, он фиксирует аспекты ручного мытья, которые трудно воспроизвести в исследовании in vitro, и заполняет пробелы в исследованиях эффективности рук и персистентности инфекционных организмов в полоскании воды.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Рекомендуется проводить промывку рук, чтобы предотвратить распространение болезни, особенно тех, которые передаются фекально-оральным или воздушным путем, включая диарейные и респираторные заболевания 1 . Удивительно, но практически нет сравнимых данных об эффективности способов ручного мытья, таких как мытье рук с мылом и водой (HWWS) и с дезинфицирующим средством для рук на основе спирта (ABHS), при удалении организмов из рук. Первоначальное исследование показало, что механическое воздействие ручной стирки, в отличие от метода ручной стирки, может объяснять удаление большинства организмов 2 , 3 . Кроме того, имеется мало сравнительных доказательств того, что метод ручной стирки наиболее эффективен. В обзоре неофициальной литературы было выявлено 14 исследований, в которых сравнивалась эффективность дезинфицирующего средства для мыла и рук при удалении организмов. Из этих исследований пять обнаружили, что ABHS является более эффективным 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , семь обнаружили, что HWWS более эффективны 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 и два не обнаружили существенной разницы между методами 16 , 17 . Эти данные несовместимы и не направлены на постоянный риск заболевания от сохранения организмов в промывочной воде после мытья рук. В целом, данные относительно сравнительной эффективности методов ручной стирки для удаления инфекционных болезнетворных патогенов ограничены.

Эти ограниченные данные привели к неопределенности в отношении того, какие методы наиболее подходят в условиях вспышки. Например, Во время вспышки вирусной болезни Эбола (EVD) в Западной Африке с 2013 по 2016 год несколько крупных международных респондентов представили противоречивые рекомендации для HWWS, ABHS или 0,05% растворов хлора. Médecins Sans Frontières (MSF) рекомендует использовать 0,05% раствор хлора для мытья рук, тогда как Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует HWWS или ABHS (если руки не будут заметно загрязнены). ВОЗ доходит до того, что заявляет, что хлор не следует использовать, если нет других вариантов, поскольку он менее эффективен, чем другие методы, из-за потребности хлора, оказываемого кожей 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Кроме того, растворы хлора обычно получают из четырех различных соединений хлора, включая высокотемпературный гипохлорит (HTH), локально генерируемый и стабилизированный гипохлорит натрия (NaOCl) и дернIum дихлоризоцианурат (NaDCC). В систематическом обзоре, проведенном ВОЗ в ответ на вспышку EVD в Западной Африке, недавно было найдено только четыре исследования, посвященные сравнительной эффективности мытья рук с хлором 23 . Эти исследования также дали противоречивые результаты, и ни одно из этих исследований не использовало рекомендуемую концентрацию хлора 0,05% для мытья рук или исследованных микроорганизмов, подобных вирусу Эбола 10 , 24 , 25 , 26 , 27 . Таким образом, рекомендации не были найдены на основе фактических данных, и неясно, какие рекомендации являются наиболее эффективными.

Необходимы дополнительные исследования для сопоставления подходов к ручному промыванию, чтобы предотвратить распространение инфекционных патогенов, поскольку вмешательства для мытья рук являются важным инструментом предотвращения распространения эпидемических заболеваний. Эти hИ рекомендации по вымыванию должны основываться на доказательствах. Таким образом, был разработан метод тестирования эффективности промывки и промывки воды, проведенный с суррогатами или неинфекционными патогенами, 2 , 28 , 29 . Здесь представлены примеры результатов с использованием Phi6 в качестве суррогата для вируса Эбола и использования Escherichia coli в качестве общего индикаторного организма. В этом протоколе представлены результаты анализа влажности рук и промывки водой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Заявление об этике: исследование, описанное здесь (на Phi6 и E. coli в качестве суррогатов для Эболы), было одобрено Советом по институциональному обзору в Медицинском центре Тафтса и кампусе Университета штата Тафтс (№ 12018); Гарвардский университет уступил пересмотр в Совет по институциональному обзору Тафтса.

ПРИМЕЧАНИЕ. Перед началом этого протокола необходимо выполнить два шага. Во-первых, необходимо идентифицировать и отобрать суррогатную или неинфекционную версию исследуемого патогена, который безопасен для использования на людях, уровень 1 (BSL-1) уровня биологической безопасности (BSL-1) 30 . Для этого протокола необходим суррогатный или неинфекционный патоген BSL-1, поскольку организм будет использоваться для инокуляции голых рук добровольцев-людей. Во-вторых, одобрение местного совета по институциональному обзору для проведения исследований с участием людей должно быть получено до того, как вербуете добровольцев или начните эксперимент. Многие аспекты этого протокола могут быть скорректированы для удовлетворенияОсобые потребности интересующих исследовательских вопросов.

1. Набирать подходящих людей

  1. Набирайте добровольцев, публикуя листовки на публичных досках объявлений и отправляя электронные письма группам с членами, которые могут быть заинтересованы в участии. Эти объявления должны включать цель исследования, контактную информацию и критерии приемлемости.
  2. Познакомьтесь с добровольцами, чтобы оценить право на участие. Подтвердите, что добровольцы здоровы, в возрасте от 18 до 65 лет, и в настоящее время не беременны или не принимают антибиотики, и что у них нет повреждений / расстройств кожи, известных аллергии на средства для мытья рук или истории проблем психического здоровья, связанных с гигиеной.
  3. Попросите добровольцев ознакомиться с формами согласия. Ответьте на любые поставленные им вопросы и попросите добровольца и следователя подписать две копии формы. Сохраните одну форму и предоставите ее добровольцу.
  4. Администрирование базового обследования, включая вопросы по демографической информации, человекаИсторию состояния кожи и информацию о недавнем поведении ручного мытья. Осмотрите руки на наличие признаков дерматита, кожных повреждений или исходных нарушений кожи 31 .
  5. Запланируйте добровольцев на два сеанса тестирования для каждого интересующего организма (один для тестирования с нагрузкой на грунт и один для тестирования без). Попросите добровольцев избегать антимикробных препаратов в течение семидневного периода вымывания перед тестированием, чтобы избежать путаницы с использованием личного продукта.
    1. Предоставляйте добровольцам антимикробные продукты (шампунь, кондиционер и мыло) для использования вместо обычных продуктов. Обеспечьте сверхпрочные виниловые перчатки и поручите испытуемым носить их при использовании таких продуктов, как продукты для уборки дома.

2. Подготовьте средства для мытья рук, обычно используемые для аварийного реагирования (мыло, ABHS, 0,05% HTH, NaDCC и NaOCl)

ПРИМЕЧАНИЕ. Хлористые растворы могут быть приготовлены До 12 ч до эксперимента, но будет деградировать, если сохранено> 12 ч.

  1. Выберите и купите мыло, соответствующее контексту, для которого выполняется тестирование.
    ПРИМЕЧАНИЕ. В большинстве случаев для чрезвычайных ситуаций с инфекционными заболеваниями в развивающемся мире это будет полоска мыла.
  2. Выберите и приобретите решение ABHS, соответствующее контексту, для которого выполняется тестирование.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для обеспечения эффективности выбранный ABHS должен иметь содержание этилового спирта, превышающее или равное 70%.
  3. Подготовьте 0,05% раствор гипохлорита кальция (Ca (ClO) 2 ) путем добавления гранулированного порошка Ca (ClO) 2 к ультрачистой воде. Определите количество необходимого решения, основанное на количестве испытуемых.
    1. Используя следующее уравнение, определите количество порошка, необходимое для приготовления желаемого количества раствора в заданном объеме воды с использованием данного процента доступного хлора:
      /files/ftp_upload/55604/55604eq1.jpg "/>
      ПРИМЕЧАНИЕ. Порошок Ca (ClO) 2 обычно имеет 60-80% доступного хлора.
  4. Подготовьте 0,05% раствор дихлоризоцианурата натрия (NaDCC) путем добавления гранулированного порошка NaDCC к ультрачистой воде.
    1. Используя следующее уравнение, определите количество порошка, необходимое для приготовления желаемого количества раствора в заданном объеме воды с использованием данного процента доступного хлора:
      Уравнение
      ПРИМЕЧАНИЕ. Порошок NaDCC обычно содержит около 50% хлора.
  5. Подготовьте стабилизированный раствор 0,05% NaOCl, добавив раствор гипохлорита натрия в сверхчистую воду.
    1. Подтвердите концентрацию исходного раствора NaOCl (вероятно, на 5-8%), используя метод испытания титрования в соответствии с инструкциями производителя ( например, йодметрическое титрование, см. Список материалов для suGgested kit).
    2. Используя результаты метода испытания, вычислите количество раствора для добавления в воду, используя следующее уравнение:
      Уравнение
  6. Подготовьте стабилизированный раствор 0,05% NaOCl, добавив раствор гипохлорита натрия, полученный с помощью электрохлорорактора, сверхчистой воды и хлорида натрия (NaCl) лабораторного качества до ультрачистой воды.
    1. Подготовьте 1% раствор хлора с ультрачистой водой и NaCl, используя электрохлоратор в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Используйте метод испытания титрования ( например, йодметрическое титрование), чтобы подтвердить концентрацию исходного раствора NaOCl 32 .
    3. Используя результаты теста, вычислите количество раствора для добавления в воду, используя следующее уравнение:
      Уравнение
  7. Подтвердите c( Например, иодометрическое титрование) и регулировать растворы путем добавления порошка / раствора источника воды или хлора до тех пор, пока они не достигнут 10% -ной погрешности целевой концентрации (0,045-0,055%).

3. Подготовьте организмы и грунт и объедините их для получения инокуляции

ПРИМЕЧАНИЕ. В следующих подразделах E. coli и Phi6 используются в качестве образцов бактериальных и вирусных организмов для описания методов.

  1. Подготовьте организм для тестирования на концентрацию более 10 × 10 8 КОЕ / мл для бактерий и более 10 × 10 7 ПФУ / мл для вирусов.
    1. Для приготовления E. coli полоскать непатогенный штамм E. coli на пластины агара Luria-Bertani (LB) и инкубировать при 37 ° C в течение 24 часов для получения отдельных колоний. Хранить при температуре 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это можно сделатьЗа несколько дней до экспериментов.
      1. За один день до начала эксперимента вытащите из колонии одну колонию и инокулируйте 10 мл бульона LB, используя стерильную петлю. Инкубируйте в течение ночи при 37 ° C со встряхиванием.
      2. Утром эксперимента начинайте новую культуру, добавляя 1 мл ночной культуры в 20 мл свежего бульона LB. Инкубируйте в течение примерно 2,5 ч для достижения плотности клеток более 10 8 КОЕ / мл.
      3. Используйте спектрофотометр для оценки концентрации культуры.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте ранее установленный коэффициент пересчета по кривой стандартов для используемого штамма E. coli , обеспечивая концентрацию более 10 8 КОЕ / мл 33 . Если плотность клеток недостаточно высока, верните культуру в инкубатор и повторите тест до готовности.
    2. Подтвердите концентрацию с помощью мембранной фильтрации 34 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Выполняйте серийные разведения oF культура в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), так что фильтрованный раствор будет производить счетное количество колоний на пластине (точное количество будет зависеть от используемой среды).
      1. Настройте пламя и фильтрующий коллектор со стерильными фильтровальными воронками и вакуумным соединением. Стерилизуйте щипцы, пылая их этанолом. Используйте их, чтобы разместить фильтр 0,45 мкм на фильтровальном коллекторе, а сетка - вверх. Смочите фильтр небольшим количеством стерильного PBS.
      2. Поместите воронку на основание и добавьте раствор образца для обработки путем пипетирования или заливки непосредственно на фильтр. Включите вакуум, пока весь образец не пройдет через мембрану. Промойте стороны воронки стерильным PBS и снова включите вакуум.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Образцы должны быть не менее 100 мкл и до 100 мл. Если образец составляет менее 10 мл, добавьте приблизительно 20 мл PBS в фильтровальную воронку перед фильтрованием, чтобы обеспечить равномерную фильтрацию сывороткиле.
      3. Удалите воронку, пламени-стерилизуйте щипцы и поднимите фильтр с основания. Мягко размещайте фильтр на агаре LB в чашке Петри, при этом сетка должна быть направлена ​​вверх, чтобы фильтр лежал на одном уровне с поверхностью. Инвертируйте планшеты и инкубируйте в течение 24 часов при 37 ° C.
      4. Через 24 часа удалите пластины из инкубатора и подсчитайте колонии E. coli . Используйте эти данные и известный коэффициент разбавления и объем раствора для расчета концентрации фильтрованного раствора в КОЕ / мл.
    3. Пропагандируйте Phi6 в хозяине Pseudomonas syringae, используя метод наложения двойного агара 35 .
      1. Добавьте 100 мкл суспензии Phi6 и 100 мкл культуральной культуры P. syringae в течение ночи непосредственно к 6 мл мягкого агара дрожжевых дрожжей (NBY) (0,3%). Вылейте его на чашки с твердым агаром NBY (1,5%) и инкубируйте в течение ночи при 26 ° C. Подготовьте достаточное количество пластин для получения достаточного количества инокулума для экспериментаС оценкой выхода приблизительно 4 мл вирусной суспензии на пластину.
      2. На следующий день добавьте 5 мл PBS поверх слоя мягкого агара. Оставьте его при комнатной температуре в течение 4 часов, извлеките его с помощью пипетки и отфильтруйте с помощью фильтра 0,45 мкм. Хранить при температуре 4 ° C.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Это решение будет служить в качестве вирусного инокулята.
    4. Используйте анализ налета, чтобы подтвердить, что концентрация превышает 10 7 PFU / mL 35 . Выполнять серийные разведения вирусной суспензии в PBS, так что 100 мкл производит счетное число бляшек на пластине.
      1. Внесите 100 мкл подходящего разбавленного образца и 100 мкл культуры ночного хозяина непосредственно в пробирку, содержащую 6 мл мягкого агара NBY. Налейте мягкий агар на твердый агар NBY и инкубируйте при 26 ° C в течение 24 часов.
      2. На следующий день удалите пластины из инкубаторов и подсчитайте количество пластин на тарелку. Используйте эти данные и известное разведение faCtor и объем раствора для расчета концентрации отфильтрованного раствора в PFU / мл.
  2. Подготовьте трехстороннюю нагрузку на грунт, предназначенную для имитации сыворотки человека.
    1. Объединить 7,80 мг / мл бычьего сывороточного альбумина, 10,92 мг / мл триптона и 2,52 мг / мл бычьего муцина для получения требуемого объема грунта. После смешивания грунта загрузите фильтр через фильтр 0,22 мкм для стерилизации. Хранить при температуре 4 ° C до использования. Не нагревайте стерилизацию, так как белки будут денатурировать.
  3. Подготовьте 0,9% раствор NaCl для смешивания инокулята в условиях без нагрузки на грунт.
  4. Непосредственно перед тестированием подготовьте инокулят, состоящий из 68% бактериальной или вирусной суспензии и 32% почвенной нагрузки. Например, используйте 1,02 мл бактериальной или вирусной суспензии из стадий 3.1.1.2 или 3.1.3.2 и 0.48 мл либо нагрузки на грунт (этап 3.2.1), либо 0.9% раствора NaCl (шаг 3.3). Вихрь или вихрь осторожно перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ. 1,5 мл этогоИнокулят будет использоваться для каждого добровольца при каждом условии, поэтому убедитесь, что общий объем приготовленного инокулята достаточен для предполагаемого количества испытаний.

4. Подготовка добровольцев к эксперименту

ПРИМЕЧАНИЕ. Определите состояние организма и состояние грунта, которое будет проверено в этот день. Те же самые добровольцы могут быть использованы для тестирования нескольких состояний, но каждый добровольник должен пройти только один раунд тестирования в течение 48 часов.

  1. Перед началом тестирования подтвердите, что добровольцы по-прежнему имеют право на вербную проверку того, что они придерживались 7-дневного периода антимикробного вымывания и визуально подтверждая, что у них не было никаких разрывов или нарушений на их коже.
  2. Используя генератор случайных чисел, назначьте каждого добровольца использовать их правую или левую руку для отбора проб в этот день тестирования. Назначьте порядок, в котором будут выполняться условия ручной стирки.
    ПРИМЕЧАНИЕ.Например, ABHS может быть назначен № 3 и будет выполняться третьим.
  3. Выполните «очищающую стирку» один раз в начале тестирования, чтобы удалить кожу грязи и масел, чтобы каждый последующий тест проводился в эквивалентных условиях.
    1. Чтобы сделать очищающую смывку, пройдите через каждый шаг эксперимента (раздел 5 ниже), используя чистый инокулят (бульон LB или только PBS) и взяв образец без мытья рук.

5. Экспериментальная процедура

  1. Чтобы проверить pH кожи каждого добровольца (чтобы контролировать изменение), поместите плоский наконечник pH-зонда на поверхность ладонной поверхности и пространство между указателем и средними пальцами. Убедитесь, что электрод плоский относительно кожи. Запишите показание pH.
  2. Спайк руки.
    1. Попросите добровольцев куклу обеими руками. Положите руки 1,5 мл инокулята осторожно пипетируйте 750 мкл медленно в каждую ладонь,
    2. Попросите добровольцев аккуратно втирать руки, пока все поверхности кисти не будут покрыты инокулятом, при условии, что руки будут как можно меньше трения.
    3. Попросите добровольцев держать руки еще вдали от своего тела в течение дополнительных 30 с, чтобы позволить инокуляту высохнуть. Инокулят не может полностью высохнуть.
  3. Вымойте руки.
    1. Для всех последующих этапов промывки уберите промывочную воду из рук в большом пакете для сбора проб. Добавить 4,5 мл 12% раствора тиосульфата натрия в мешок для нейтрализации хлора при контакте и процесса в течение 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Тиосульфат натрия следует добавлять во все образцы (даже без хлора) для контроля за любым воздействием, которое он может иметь на организм.
    2. После инокуляции (раздел 5.2) вымойте руки следующим способом в указанном порядке.
      1. Для элемента управления A не выполняйте этап ручной стирки и переходите непосредственно к этапу5.5.
      2. Для управления B мойте руки только сверхчистой водой при комнатной температуре (приблизительно 21 ° C) через воронку с известным расходом.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь использовали скорость потока 1,5 л / м и 500 мл воды.
      3. Для мытья рук с мылом намочите руки 10 мл ультрачистой воды. Попросите добровольцев вымыть руки с мылом, а затем протрите их руки еще на 20 секунд. Промойте руки, наливая 500 мл сверхчистой воды при комнатной температуре через воронку со скоростью потока 1,5 л / м.
      4. Для всех растворов хлора ( например, ABHS, HTH, NaDCC и NaOCl), вылейте 200 мл раствора хлора через воронку со скоростью потока 1,5 л / м и попросите добровольца тщательно протирать руки.
  4. Ручное полоскание с использованием модифицированной процедуры для перчаточного сока.
    1. После ручной стирки немедленно поместите руку каждого добровольца ( т. Е. Руку (справа или слева), выбранную для тестаNg на этапе 4.2) в мешок для образца, содержащий 75 мл элюента ( например, PBS) до запястья. Держите верхнюю часть мешка плотно вокруг запястья.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте элюент для отбора проб, который содержит достаточное количество тиосульфата натрия для нейтрализации любого хлора, используемого для мытья рук. PBS является широко используемым элюентом, который подходит для многих организмов.
    2. Попросите добровольцев осторожно протирать руку в растворе в течение 30 с, стараясь достичь между пальцами и под ногтями. Слегка помассируйте руку снаружи мешка в течение 30 с, чтобы вся рука полностью промылась в элюенте, вплоть до запястья.
    3. Уплотните мешок и обработайте его согласно соответствующему анализу, описанному в разделе 6, в течение 2 часов.
  5. Обеззараживание.
    1. Прежде чем повторять процесс с помощью каждого метода ручной стирки, добровольцы тщательно мойте руки в раковине с мылом и теплой водой. Распылите добровольцаRs 'с 70% этанолом, пока они не будут покрыты с обеих сторон. Дайте им высохнуть.
    2. Повторите все шаги в разделе 5 для каждого условия ручной стирки, только используя руку, случайно выбранную на шаге 4.2 ( рисунок 1 ).

6. Количественная оценка

  1. Проведите анализы, соответствующие выбранному организму ( например, мембранная фильтрация для бактерий или анализ налета на вирусы, описанные выше в разделах 3.1.2 и 3.1.4 соответственно).
  2. После подсчета пластин запишите расчетный КОЕ / мл или ПФУ / мл для каждого теста для анализа (разделы 3.1.2 и 3.1.4).

7. Анализ

  1. Используя результаты шага 6.2, вычислите значение сокращения логарифма организмов на руках, для каждого состояния организма и состояния грунта, а также для каждого предмета и метода ручной стирки.
    1. Для эффективности мытья рук сравните концентрацию бактерий / вируса в каждом Образец для мытья рук для управления A (без мытья рук). Для стойкости промывочной воды сравните каждый образец промывочной воды для контроля B (промывание только водой). Используйте следующую стандартную формулу:
      Сокращение журнала (ручная стирка ) = УравнениеУравнение
      Сокращение бревен (промывка воды ) = УравнениеУравнение
      ПРИМЕЧАНИЕ. Сокращение журнала также можно выразить как log 10 (без ручного мытья) - журнал 10 (с ручной стиркой)
  2. Используйте дисперсионный анализ дисперсии односторонних измерений (ANOVA) для оценки существенных различий в рассчитанных значениях уменьшения логарифмов между методами ручной стирки и теста HSD после спешки Tukey для значимых моделей для оценки в паре существенных различий (p <0,05)Ef "> 36.
    1. Перед запуском ANOVA оценивайте каждый набор данных для сферичности ( например, используя тест Бартлетта). Примените коррекцию ( например, коррекцию парниковых газов), когда тест указывает на нарушение сферичности 37 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Здесь протокол ( рис. 1 ) был заполнен 18 добровольцами, каждый из которых тестировался с использованием как E. coli, так и Phi6. Значительные различия были обнаружены между результатами ручной промывки с E. coli как с почвой, так и без нее, и Phi6 с нагрузкой на грунт ( рис. 2 и рис. 3 ). Для E. coli без нагрузки на грунт мытье рук с HTH, NaDCC и стабилизированным NaOCl приводило к значительно большему сокращению бревен, чем мытье рук только водой (F (6,102) = 2,72, p = 0,034). При нагрузке на почву HTH приводило к значительно большему бремени редукции E. coli, чем только вода, HWWS и ABHS (F (6,102) = 3,94, p <0,001). Не было существенной разницы между методами для Phi6 без нагрузки на грунт (F (6,66) = 2,04, p = 0,073). Однако для Phi6 с нагрузкой на грунт (F (6,102) = 7,01, p <0,001) вода сама по себе приводила к образованиюАцетил-логарифм, чем ABHS или стабилизированный NaOCl, и HWWS при большем бремени восстановления, чем ABHS, стабилизированный NaOCl и генерированный NaOCl. HTH также имел большее логарифмическое снижение, чем ABHS и стабилизированный NaOCl, и NaDCC приводил к большему бремени, чем стабилизированные NaOCl и ABHS. Несмотря на то, что HTH наиболее эффективно реагирует на различные состояния, мы предупреждаем о чрезмерной интерпретации значимых результатов, поскольку многие доверительные интервалы были большими, в большинстве случаев, от менее 0,5 log до более чем 1,5 log сокращения.

В полоскании воды хлор приводил к значительно большему бремени редукции E.coli, сохраняющейся в промывной воде, чем HWWS (без нагрузки на грунт, F (4,68) = 331,7, p <0,001, с нагрузкой на грунт, F (4,68) ) = 162,44, p <0,001) ( фиг. 4 ). Эта же картина была обнаружена в Phi6 без нагрузки на грунт ((F (4,43) = 8,95, P <0,001), причем все растворы хлора приводят кЗначительно большее снижение Phi6 в промывочной воде, чем HWWS. Не было существенных различий в стойкости промывной воды с Phi6 и нагрузкой на грунт ((F (4,67) = 3,35, p = 0,071) ( рисунок 5 ).

Рисунок 1
Рисунок 1: Обзор эксперимента. Пять шагов, предпринятых для каждого раунда промывки рук, включают: 1) тестирование pH, 2) инокуляцию рук, 3) ручную стирку, 4) ополаскивание рук и 5) обеззараживание рук для каждого из восьми испытанных условий. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Повторная промывка E. coli ULTS. По сравнению с отсутствием мытья рук, проведенные методы ручной промывки приводили к общему снижению логарифма в E. coli 1,94-3,01 без нагрузки на грунт и 2,18-3,34 с нагрузкой на грунт. Мытье рук водой продемонстрировало наименьшее снижение E. coli в обоих условиях (1,94 и 2,18 log). Мытье рук с NaDCC приводило к наибольшему уменьшению без нагрузки на грунт (3.01), а HTH приводило к наибольшему уменьшению с нагрузкой на грунт (3.34). В диаграммах линия представляет собой процентное уменьшение количества организмов, а полосы ошибок представляют собой стандартную ошибку сокращения журнала. Ctrl B, управление B; HWWS, мытье рук с мылом; ABHS, дезинфицирующее средство для рук на спиртовой основе; HTH, высокотемпературный гипохлорит; NaDCC, дихлоризоцианурат натрия; NaOCl, стабилизированный гипохлорит натрия; Gen NaOCl, образуется гипохлорит натрия. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Рисунок 3
Рисунок 3: Результаты промывки Phi6. По сравнению с отсутствием мытья рук, проведенные методы ручной стирки привели к среднему бремени редукции в Phi6 2,44-3,06 без нагрузки на грунт и 2,71-3,69 при нагрузке на грунт. Мытье рук мылом продемонстрировало наименьшее сокращение Phi6 без нагрузки на грунт (2.44), а мытье рук со стабилизированным NaOCl привело к наименьшему уменьшению с нагрузкой на грунт (2.71). Мытье рук с сгенерированным NaOCl приводило к наибольшему уменьшению без нагрузки на грунт (3.06), а мытье рук мылом приводило к наибольшему уменьшению с нагрузкой на грунт (3.69). В диаграммах линия представляет собой процентное уменьшение количества организмов, а полосы ошибок представляют собой стандартную ошибку сокращения журнала. Ctrl B, управление B; HWWS, мытье рук с мылом; ABHS, дезинфицирующее средство для рук на спиртовой основе; HTH, высокотемпературный гипохлорит; NaDCC, дихлоризоцианурат натрия;NaOCl, стабилизированный гипохлорит натрия; Gen NaOCl, образуется гипохлорит натрия. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Результаты промывки рук E. coli . По сравнению с ручным мытьем только с водой, средняя редукция E. coli, оставшаяся в воде для полоскания, составляла 0,28-4,77 без нагрузки на грунт и 0,21-4,49 с нагрузкой на грунт. Как с почвой, так и без нее, наименьшее сокращение было обнаружено при мытье рук с мылом (0,28 и 0,21). Наибольшие сокращения наблюдались со стабилизированным и сгенерированным NaOCl без нагрузки на грунт (как 4.77), так и с HTH и генерировали NaOCl с нагрузкой на грунт. В диаграммах линия представляет собой процентное сокращение организмов, а полосы ошибок представляют собой sTandard ошибка регистрации журнала. HWWS, мытье рук с мылом; ABHS, дезинфицирующее средство для рук на спиртовой основе; HTH, высокотемпературный гипохлорит; NaDCC, дихлоризоцианурат натрия; NaOCl, стабилизированный гипохлорит натрия; Gen NaOCl, образуется гипохлорит натрия. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5
Рисунок 5: Результаты промывки рук Phi6. По сравнению с ручной промывкой только водой, средняя редукция Phi6, оставшаяся в промывочной воде, составляла 1,26-2,02 без нагрузки на грунт и 1,30-2,20 с нагрузкой на грунт. При нагрузке на грунт наименьшее сокращение было обнаружено при мытье рук с мылом (1,26). Без нагрузки на грунт HTH привело к наименьшему уменьшению (2.02). Наибольшие сокращения наблюдались как с почвой, так и без нее с NaDCC(2,02 и 2,20). В диаграммах линия представляет собой процентное уменьшение количества организмов, а полосы ошибок представляют собой стандартную ошибку сокращения журнала. HWWS, мытье рук с мылом; ABHS, дезинфицирующее средство для рук на спиртовой основе; HTH, высокотемпературный гипохлорит; NaDCC, дихлоризоцианурат натрия; NaOCl, стабилизированный гипохлорит натрия; Gen NaOCl, образуется гипохлорит натрия. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Агентством США по международному развитию, Управлением по оказанию помощи в случае стихийных бедствий (AID-OFDA-A-15-00026). Марлен Вулф поддерживалась Национальным научным фондом (грант 0966093).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soap bar Dove White Beauty Bar soap
Alcohol-based hand sanitizer Purell Advanced Instant Hand Sanitizer with 70% Ethyl Alcohol
HTH Powder Acros Organics 300340010
NaDCC Powder Medentech Klorsept granules
NaOCl Solution Acros Organics 419550010
Electrochlorinator AquaChlor
Iodometric titrator Hach 1690001
Bovine serum albumin MP Biomedicals NC0117242
Tryptone Fisher BP1421-100
Bovine Mucin EMD Milipore 49-964-3500MG
0.22 µm Filter EMD Milipore GVWP04700
NaCl Fisher BP358-1
Skin pH probe Hanna Instruments H199181
Large Whirlpak Sample Bag Nasco B01447WA
Small Whirlpak Sample Bag Nasco B01323WA
Funnel bottle Thermo Scientific 3120850001 You may drill an appropriately sized hole in the lid of a bottle to form a funnel that will dispense water at the appropriate flow rate
Ethanol ThermoScientific 615090010 Mix with water to produce 70% ethanol
Spray bottle Qorpak PLC06934
E. coli ATCC 25922
LB Broth Fisher BioReagents BP1426-2
LB Agar Fisher BioReagents BP1425-500
Sterile loop Globe Scientific 22-170-204
Phi6 HER 102
Nutrient broth BD Difco BD 247110
GeneQuant 100 Spectrophotometer General Electric 28-9182-04
Sodium thiosulfate Fisher Chemical S445-3
Membrane filter (47 mm, 0.45 µm) EMD Millipore HAWP04700
m-ColiBlue24 broth media EMD Millipore M00PMCB24
Petri dish with pad (47 mm) Fisherbrand 09-720-500
Vacuum Manifold Thermo Scientific/Nalgene 09-752-5
Filter funnels Thermo Scientific/Nalgene 09-747
Pseudomonas syringae HER 1102
Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific 10010031 Solution may also be mixed from source compounds according to any basic recipe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kampf, G., Kramer, A. Epidemiologic Background of Hand Hygiene and Evaluation of the Most Important Agents for Scrubs and Rubs. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 863-893 (2004).
  2. Miller, T., Patrick, D., Ormrod, D. Hand decontamination: influence of common variables on hand-washing efficiency. Healthc Infect. 16, (1), 18 (2013).
  3. Jensen, D. A., Danyluk, M. D., Harris, L. J., Schaffner, D. W. Quantifying the effect of hand wash duration, soap use, ground beef debris, and drying methods on the removal of Enterobacter aerogenes on hands. J Food Prot. 78, (4), 685-690 (2015).
  4. Girou, E., Loyeau, S., Legrand, P., Oppein, F., Brun-Buisson, C. Efficacy of handrubbing with alcohol based solution versus standard handwashing with antiseptic soap: randomised clinical trial. BMJ. 325, (7360), 362 (2002).
  5. Kac, G., Podglajen, I., Gueneret, M., Vaupré, S., Bissery, A., Meyer, G. Microbiological evaluation of two hand hygiene procedures achieved by healthcare workers during routine patient care: a randomized study. J Hosp Infect. 60, (1), 32-39 (2005).
  6. Lages, S. L. S., Ramakrishnan, M. A., Goyal, S. M. In-vivo efficacy of hand sanitisers against feline calicivirus: a surrogate for norovirus. J Hosp Infect. 68, (2), 159-163 (2008).
  7. Holton, R. H., Huber, M. A., Terezhalmy, G. T. Antimicrobial efficacy of soap and water hand washing versus an alcohol-based hand cleanser. Tex Dent J. 126, (12), Retrieved from: http://www.tda.org/Publications/Texas-Dental-Journal 1175-1180 (2009).
  8. Salmon, S., Truong, A. T., Nguyen, V. H., Pittet, D., McLaws, M. -L. Health care workers' hand contamination levels and antibacterial efficacy of different hand hygiene methods used in a Vietnamese hospital. Am J Infect Control. 42, (2), 178-181 (2014).
  9. Steinmann, J., Nehrkorn, R., Meyer, A., Becker, K. Two in-vivo protocols for testing virucidal efficacy of handwashing and hand disinfection. Int J Hyg Environ Health. 196, (5), Retrieved from: https://www.journals.elsevier.com/international-journal-of-hygiene-and-environmental-health 425-436 (1995).
  10. Weber, D. J., Sickbert-Bennett, E., Gergen, M. F., Rutala, W. A. Efficacy of selected hand hygiene agents used to remove Bacillus atrophaeus (a surrogate of Bacillus anthracis) from contaminated hands. JAMA. 289, (10), 1274-1277 (2003).
  11. Grayson, M. L., Melvani, S., et al. Efficacy of Soap and Water and Alcohol-Based Hand-Rub Preparations against Live H1N1 Influenza Virus on the Hands of Human Volunteers. Clin Infect Dis. 48, (3), 285-291 (2009).
  12. Oughton, M. T., Loo, V. G., Dendukuri, N., Fenn, S., Libman, M. D. Hand hygiene with soap and water is superior to alcohol rub and antiseptic wipes for removal of Clostridium difficile. Infect Control Hosp Epidemiol. 30, (10), 939-944 (2009).
  13. Liu, P., Yuen, Y., Hsiao, H. -M., Jaykus, L. -A., Moe, C. Effectiveness of liquid soap and hand sanitizer against Norwalk virus on contaminated hands. Appl Environ Micro. 76, (2), 394-399 (2010).
  14. Savolainen-Kopra, C., Korpela, T., et al. Single treatment with ethanol hand rub is ineffective against human rhinovirus--hand washing with soap and water removes the virus efficiently. J Med Virol. 84, (3), 543-547 (2012).
  15. Tuladhar, E., Hazeleger, W. C., Koopmans, M., Zwietering, M. H., Duizer, E., Beumer, R. R. Reducing viral contamination from finger pads: handwashing is more effective than alcohol-based hand disinfectants. J Hosp Infect. 90, (3), 226-234 (2015).
  16. Steinmann, J., Paulmann, D., Becker, B., Bischoff, B., Steinmann, E., Steinmann, J. Comparison of virucidal activity of alcohol-based hand sanitizers versus antimicrobial hand soaps in vitro and in vivo. J Hosp Infect. 82, (4), 277-280 (2012).
  17. de Aceituno, A. F., Bartz, F. E., et al. Ability of Hand Hygiene Interventions Using Alcohol-Based Hand Sanitizers and Soap To Reduce Microbial Load on Farmworker Hands Soiled during Harvest. J Food Protect. 78, (11), 2024-2032 (2015).
  18. Sterk, E. Médecins Sans Frontières - Filovirus Haemorrhagic Fever Guideline. Available from: http://jid.oxfordjournals.org/content/204/suppl_3/S791.full (2008).
  19. World Health Organization. WHO Report. Ebola Virus Disease ( EVD ) Key questions and answers concerning water, sanitation and hygiene. Available from: http://www.who.int/water_sanitation_health/WASH_and_Ebola.pdf 1-5 (2014).
  20. World Health Organization. Guidelines on Hand Hygiene in Health Care. First Global Patient Safety Challenge, Clean Care is Safer Care. Available from: http://whqlibdoc.who.int/publications/2009/9789241597906_eng.pdf (2009).
  21. Boyce, J. M., Pittet, D. Guideline for Hand Hygiene in Health-Care Settings Recommendations of the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee and the HICPAC/SHEA/APIC/IDSA Hand Hygiene Task Force. Infect Control Hosp Epidemiol. 23, (12 Suppl), Society for Healthcare Epidemiology of America. S3-S40 (2002).
  22. Emmanuel, J., Ndoye, B. UNDP Medical Waste Experts Assessment and Recommendations Regarding Management of Ebola-Contaminated Waste. United Nations Development Programme. Available from: https://noharm-global.org/sites/default/files/documents-files/3127/Report%20to%20WHO%20WASH%20and%20Geneva%20on%20Ebola%20final.pdf (2015).
  23. Hopman, J., Kubilay, Z., Allen, T., Edrees, H., Pittet, D., Allegranzi, B. Efficacy of chlorine solutions used for hand hygiene and gloves disinfection in Ebola settings: a systematic review. Antimicrob Resist Infect Control. 4, (1), 1 (2015).
  24. Lowbury, E. J. L., Lilly, H. A., Bull, J. P. Disinfection of hands: removal of transient organisms. BMJ. 2, (5403), 230-233 (1964).
  25. Edmonds, S. L., Zapka, C., et al. Effectiveness of Hand Hygiene for Removal of Clostridium difficile Spores from Hands. Infect Control Hosp Epidemiol. 34, (3), 302-305 (2013).
  26. Rotter, M. L. 150 years of hand disinfection-Semmelweis' heritage. Hyg Med. (22), 332-339 (1997).
  27. Hitomi, S., Baba, S., Yano, H., Morisawa, Y., Kimura, S. Antimicrobial effects of electrolytic products of sodium chloride--comparative evaluation with sodium hypochlorite solution and efficacy in handwashing. Kansenshōgaku Zasshi. 72, (11), 1176-1181 (1998).
  28. ASTM International. Standard E1174-13. Standard Test Method for Evaluation of the Effectiveness of Health Care Personnel Handwash Formulations. Available from: https://www.astm.org/ (2013).
  29. Casanova, L. M., Weaver, S. R. Evaluation of eluents for the recovery of an enveloped virus from hands by whole-hand sampling. J Appl Microbiol. 118, (5), 1210-1216 (2015).
  30. Sinclair, R. G., Rose, J. B., Hashsham, S. A., Gerba, C. P., Haas, C. N. Criteria for Selection of Surrogates Used To Study the Fate and Control of Pathogens in the Environment. Appl Environ Microbiol. 78, (6), 1969-1977 (2012).
  31. Held, E., Skoet, R., Johansen, J. D., Agner, T. The hand eczema severity index (HECSI): A scoring system for clinical assessment of hand eczema. A study of inter- and intraobserver reliability. Br J Dermatol. 152, (2), 302-307 (2005).
  32. Chlorine Total, Iodometric Method Using Sodium Thiosulfate, Method 8209 Digital Titrator. Available from: http://www.hach.com/asset-get.download-en.jsa?id=7639983937 (2016).
  33. GeneQuant 100 User Manual. Available from: http://biochromspectros.com/media/wysiwyg/support_page/support-genequant-100/Genequant-100-UM.pdf (2016).
  34. United States Environmental Protection Agency. Method 1604: Total Coliforms and Escherichia coli in Water by Membrane Filtration Using a Simultaneous Detection Technique (MI Medium). Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-08/documents/method_1604_2002.pdf (2002).
  35. Adams, M. H., Anderson, E. S. Bacteriophages. Interscience Publishers. New York. (1959).
  36. Kao, L. S., Green, C. E. Analysis of Variance: Is There a Difference in Means and What Does It Mean? The Journal of surgical research. 144, (1), 158-170 (2008).
  37. Schutz, R. W., Gessaroli, M. E. The Analysis of Repeated Measures Designs Involving Multiple Dependent Variables. Research Quarterly for Exercise and Sport. 58, (2), 132-149 (1987).
  38. Woolwine, J. D., Gerberding, J. L. Effect of testing method on apparent activities of antiviral disinfectants and antiseptics. Antimicrob Agents Chemother. 39, (4), 921-923 (1995).
Метод проверки эффективности мытья рук для удаления возникающих инфекционных патогенов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).More

Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter