Summary

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Published: June 09, 2017
doi:

Summary

נוירונים גזעיים של גזע המוח של avians ויונקים הם מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר, תהליך בסיסי עבור פונקציות השמיעה הרגילה. נוירונים אלה נובעים מבשרי ברורים של המוח האחורי עובריים. אנו מציגים טכניקות ניצול electroporation להביע גנים במוח האחורי של עוברים עוף ללמוד תפקוד הגן במהלך פיתוח השמיעה.

Abstract

Electroporation היא שיטה המציגה גנים של עניין לתוך אורגניזמים ביולוגיים רלוונטיים כמו עוף העוף. זה כבר זמן רב כי העובר עוף הוא מודל מחקר יעיל לחקר תפקודים ביולוגיים בסיסיים של פיתוח מערכת השמיעה. לאחרונה, העובר עוף הפך חשוב במיוחד בחקר ביטוי גנים, רגולציה הפונקציה הקשורים השמיעה. ב electroporation אובו ניתן להשתמש כדי למקד אזורים המוח השמיעתי אחראי על פונקציות שמיעה מיוחדות מאוד. אזורים אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM) ואת גרעין laminaris (NL). NM ו נוירונים NL נובעים מבשרי מובהק של rhombomeres 5 ו 6 (R5 / R6). כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד ללמוד מאפיינים הקשורים גנים באזורים אלה. אנו מראים שיטה לשליטה מרחבית וזמנית של ביטוי גנים המקדמים גם רווח או הפסד של פנוטיפ פונקציונליEs. על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים R5 / R6, אנו מראים transfection פלסמיד ב NM ו NL. הרגולציה הזמנית של ביטוי גנים יכולה להיות מושגת על ידי אימוץ מערכת וקטורית. זהו הליך תרופתי מעורר אשר מבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox). ב ov electroporation טכניקה – יחד עם או ביוכימיים, פרמקולוגיים, או מבחני תפקודית vivo – מספק גישה חדשנית ללמוד פיתוח נוירון השמיעה תופעות פתופיזיולוגיות הקשורות.

Introduction

קידוד עצבי מהיר של צליל הוא חיוני עבור פונקציות השמיעה נורמלי. אלה כוללים יכולות לוקליזציה צליל 1 , דיבור באפליה רעש 2 , ואת ההבנה של אותות תקשורת רלוונטיים אחרים רלוונטיים 3 . נוירונים אנלוגיים הממוקמים בגזע המוח השמיעתי של שני avians ו יונקים הם מאוד מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר 4 . אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM), גרעין laminaris (NL) ואת האנלוגים יונקים שלהם, גרביים שבלול anteroventral (AVCN) ואת המדיום מעולה זית (MSO), בהתאמה. עם זאת, מנגנוני התפתחות המסדירים קידוד עצבי מהיר הם הבינו היטב את המוח השמיעתי. לכן, כדאי ללמוד גנים ספציפיים אשר אחראים על קידוד עצבי מהיר על מנת להבין טוב יותר את הביטוי, הרגולציה והפונקציה שלהם ב- auפיתוח דיטורי.

העובר בפיתוח עוף הוא כלי מחקר יעיל ומבוסס ללמוד שאלות ביולוגיות בסיסיות של פיתוח מערכת השמיעה 6 , 7 . ההתקדמות המולקולרית האחרונות התייחסו לשאלות ביולוגיות אלה בעובר המתפתח על ידי הבעת או דפיקות גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo 8 , 9 . לחקור את התפקיד הרגולטורי של גנים ספציפיים היא התקדמות משמעותית בהבנת הפתולוגיות הקשורות גירעונות השמיעה. כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד לתוך המוח גזע עוף שמיעה שם קידוד עצבי מהיר של צליל מתרחשת 10 . על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים rhombomeres 5 ו 6 11 , 12 (R5 /R6), אנו מראים שליטה מרחבית של transfection פלסמיד ב NM ו NL. בנוסף, אנו מראים הרגולציה הזמנית של הביטוי על ידי אימוץ טקט על וקטור המערכת. זהו הליך נוגד תרופה המבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox) 8 .

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי אוניברסיטת נורת 'ווסטרן טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדות, וביצעו בהתאם המוסדות הלאומיים לבריאות הנחיות לטיפול ושימוש של חיות מעבדה. 1. טיפול ביצים רכ…

Representative Results

אנו מראים כאן כי ב electroporation אובו מאפשר ביטוי גנים במערכת ביולוגית המתפתחת בדרך כלל. גנים מקודדים פלסמיד מוזרקים בפוקוס לתוך הצינור העצבי שמעל R5 / R6. דוגמה סכמטית של האלקטרודה ופיפטה מיקומים יחסית סמנים אנטומיים חשובים מוצג בתרשים 1A</stron…

Discussion

ב electroporation אובו היא שיטה להביע או להפיל גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo 8 , 9 . בעובר עוף, היא שיטה חדשנית להבעת גנים מקודדים פלסמיד לתוך אזורים שונים גזע המוח השמיעתי 8 . כדי להבטיח ביטוי אופטימלי, נדרש?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לד"ר. Leslayann Schecterson, יואן ואנג, אנדרס Barria וגברת Ximena Optiz-Araya לסיוע ראשוני עם פרוטוקול הגדרת למתן פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCD מענק DC013841 (JTS).

Materials

Fertilized white leghorn chicken eggs Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer Parker Hannifin 052-0500-900 Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator Grass Technologies SD9 SD9
Microfil syringe needles World Precision Instruments MF28G67-5 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder Warner Instruments 64-1280 MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode FHC PBSA1075 PBSA1075
Air tank/regulator NU Laboratory Services Air dry 300 CF
Fast green Sigma Aldrich F7258-25G F7258-25G
Clear plastic tape Scotch 191
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D9891-1G
Egg refrigerator Vissani Wine Refrigerator 13.3-16.1° C (56-61° F)
Incubator Hova-Bator 37.8° C (100° F), ~50% humidity
Dissection scope Zeiss 4.35E+15 SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source Zeiss 4.36E+15 CL6000 LED
Micromanipulators Narishige Japan Model: MM-3 2 Micromanipulators
Capillary tubes Sutter Instrument BF150-86-10 Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes 1 mL, 3 mL
Needles BD Precision Glide  27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps Stoelting No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder Custom Made Clay base works as well
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97
Syringe filter Ultra Cruz sc-358811 PVDF 0.22 μm

References

  1. Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
  2. Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
  3. Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
  4. Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
  5. Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
  6. Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
  7. Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
  8. Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  9. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
  10. Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
  11. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
  12. Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
  13. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
  14. Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
  15. Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
  16. Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
  17. Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
  18. Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
  19. Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
  20. Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
  21. Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
  22. Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
  23. Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).

Play Video

Cite This Article
Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).

View Video