Summary

鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

Published: June 09, 2017
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Summary

鳥類および哺乳動物の聴覚脳幹ニューロンは、正常な聴覚機能のための基本的なプロセスである高速神経エンコーディングに特化しています。これらのニューロンは、胚後脳の別個の前駆細胞から生じる。我々は、聴覚発達中の遺伝子機能を研究するために、ニワトリ胚の後脳における遺伝子を発現させるためにエレクトロポレーションを利用する技術を提示する。

Abstract

エレクトロポレーションは、ニワトリ胚のような生物学的に関連する生物に関心のある遺伝子を導入する方法である。ニワトリ胚は、聴覚系発達の基本的な生物学的機能を研究するための有効な研究モデルであることは長い間確立されている。より最近では、ニワトリ胚は、聴覚に関連する遺伝子発現、調節および機能の研究において特に価値があるようになった。 内では、エレクトロポレーションを用いて、高度に特殊化された聴覚機能を担う聴性脳幹領域を標的とすることができる。これらの領域は、ニワトリ核magnocellularis(NM)および核laminaris(NL)を含む。 NMおよびNLニューロンは、菱形5および6(R5 / R6)の別個の前駆体から生じる。ここでは、これらの領域における遺伝子関連特性を研究するために、プラスミドコード遺伝子の卵内エレクトロポレーションを提示する。我々は、機能的表現型の増加または減少のいずれかを促進する遺伝子発現の空間的および時間的制御のための方法を示すes。 R5 / R6に関連する聴覚神経前駆細胞を標的化することにより、NMおよびNLにおけるプラスミドトランスフェクションを示す。遺伝子発現の時間的調節は、tet-onベクターシステムを採用することによって達成することができる。これは、ドキシサイクリン(Dox)の存在下で目的の遺伝子を発現する薬物誘発性の手順である。 インビボでのエレクトロポレーション技術は、生化学的、薬理学的、および/または生体内での機能アッセイとともに、聴覚ニューロン発達および関連する病態生理学的現象を研究する革新的なアプローチを提供する。

Introduction

正常な聴覚機能のためには、音声の高速神経符号化が不可欠です。これには、音の定位能力1 、騒音弁別2の声音、および他の行動関連の通信信号3の理解が含まれる。鳥類および哺乳動物の聴性脳幹に位置する類似のニューロンは、高速神経エンコーディングに高度に特化されています4 。これらには、ニワトリ核大細胞膜(NM)、核薄片(NL)およびそれらの哺乳類類似体、前庭内蝸牛核(AVCN)および内上位オリーブ(MSO)が含まれる。しかし、聴性脳幹では、速い神経のコード化を制御する発達メカニズムはほとんど理解されていない。したがって、auにおける発現、調節および機能をよりよく理解するためには、速い神経のコード化に関与する特定の遺伝子を研究することが有利である誕生日の開発。

発育中のニワトリ胚は、聴覚系発達の基本的な生物学的問題を研究するための効果的かつ確立された研究ツールである 6,7 。近年の分子進歩は、インビボ遺伝子機能を解析するために興味のある遺伝子を発現またはノックダウンすることにより、ニワトリ胚の発生におけるこれらの生物学的問題に対処している。特定の遺伝子の調節的役割を調べることは、聴力障害に関連する病理を理解する上で重要な進歩です。ここでは、プラスミドエンコードされた遺伝子の卵内電気穿孔法を、鶏の聴覚脳幹に提示し、速い神経のコード化が起こる10 。菱形5および6に関連する聴覚神経前駆細胞を標的化することによって11,12(R5 /R6)、NMおよびNLにおけるプラスミドトランスフェクションの空間的制御を示す。さらに、tet-onベクターシステムを採用することにより、発現の時間的調節を示す。これは、ドキシサイクリン(Dox) 8の存在下で目的の遺伝子を発現する薬物誘導性の手順である。

Protocol

すべての手順は、ノースウェスタン大学機関動物用ケアおよび使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のための国立衛生研究所ガイドラインに従って実施された。 1.卵の取り扱い地元の業者から受精卵を購入する。インキュベーションの5日前まで冷蔵庫に13°Cで卵を保管してください。胚の生存率は1週間後に著しく低下する。 インキュ?…

Representative Results

我々は、卵子でエレクトロポレーションが正常に発生する生物系における遺伝子発現を可能にすることをここに示す。プラスミドにコードされた遺伝子は、R5 / R6の上にある神経管に局所的に注射される。重要な解剖学的マーカーに対する電極およびピペット配置の概略的な例を図1Aに示す 。プラスミド注入の正確な位置は、エレクトロポレーションの24?…

Discussion

卵内エレクトロポレーションでは、 in vivo遺伝子機能を解析するために目的の遺伝子を発現またはノックダウンする方法8,9 。ニワトリの胚では、それはプラスミドにコードされた遺伝子を異なる聴性脳幹領域に発現させる革新的な方法です8 。最適な発現を確保するためには、いくつかの重要なステップが必要です。まず、卵胞嚢がはっきり?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちはDrsに感謝したいと思います。プロトコルの設定とプラスミド提供のための初期支援については、Leslayann Schecterson、Yuan Wang、Andres Barria、Ximena Optiz-Araya氏この研究は、NIH / NIDCDグラントDC013841(JTS)によって支持された。

Materials

Fertilized white leghorn chicken eggs Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer Parker Hannifin 052-0500-900 Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator Grass Technologies SD9 SD9
Microfil syringe needles World Precision Instruments MF28G67-5 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder Warner Instruments 64-1280 MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode FHC PBSA1075 PBSA1075
Air tank/regulator NU Laboratory Services Air dry 300 CF
Fast green Sigma Aldrich F7258-25G F7258-25G
Clear plastic tape Scotch 191
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D9891-1G
Egg refrigerator Vissani Wine Refrigerator 13.3-16.1° C (56-61° F)
Incubator Hova-Bator 37.8° C (100° F), ~50% humidity
Dissection scope Zeiss 4.35E+15 SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source Zeiss 4.36E+15 CL6000 LED
Micromanipulators Narishige Japan Model: MM-3 2 Micromanipulators
Capillary tubes Sutter Instrument BF150-86-10 Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes 1 mL, 3 mL
Needles BD Precision Glide  27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps Stoelting No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder Custom Made Clay base works as well
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97
Syringe filter Ultra Cruz sc-358811 PVDF 0.22 μm

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Cite This Article
Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).

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