Summary

In Ovo Electroporation im Hühnchen auditorischen Hirnstamm

Published: June 09, 2017
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Summary

Auditorische Hirnstamm Neuronen von Vogel und Säugetiere sind spezialisiert auf schnelle neuronale Kodierung, ein grundlegendes Verfahren für normale Hörfunktionen. Diese Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern des embryonalen Hinterhirns. Wir präsentieren Techniken, die die Elektroporation verwenden, um Gene im Hirnhirn von Hühnerembryonen zu exprimieren, um die Genfunktion während der auditorischen Entwicklung zu untersuchen.

Abstract

Elektroporation ist eine Methode, die interessante Gene in biologisch relevante Organismen wie den Hühnerembryo einführt. Es ist lange festzustellen, dass der Hühnerembryo ein wirksames Forschungsmodell für das Studium der grundlegenden biologischen Funktionen der auditorischen Systementwicklung ist. In jüngster Zeit ist der Hühnerembryo besonders wertvoll bei der Untersuchung von Genexpression, Regulation und Funktion, die mit dem Hören verbunden ist. In ovo Elektroporation kann verwendet werden, um auditorische Hirnstammregionen zu bestimmen, die für hochspezialisierte auditive Funktionen verantwortlich sind. Zu diesen Regionen gehören der Hühnerkern Magnozellularis (NM) und der Kernlaminaris (NL). NM- und NL-Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern der Rhombomere 5 und 6 (R5 / R6). Hier präsentieren wir in der Ovo- Elektroporation von Plasmid-codierten Genen, um gen-bezogene Eigenschaften in diesen Regionen zu untersuchen. Wir zeigen eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der Genexpression, die entweder Gewinn oder Verlust des funktionellen Phänotyps fördernEs Durch die Ausrichtung auf auditorische neuronale Progenitorregionen, die mit R5 / R6 assoziiert sind, zeigen wir die Plasmid-Transfektion in NM und NL. Die zeitliche Regulation der Genexpression kann durch die Annahme eines Tet-on-Vektorsystems erreicht werden. Dies ist ein Arzneimittel-induzierbares Verfahren, das die interessierenden Gene in Gegenwart von Doxycyclin (Dox) exprimiert. Die in ovo- Elektroporationstechnik – zusammen mit biochemischen, pharmakologischen und oder in vivo funktionellen Assays – bietet einen innovativen Ansatz zur Untersuchung der auditorischen Neuronenentwicklung und der damit verbundenen pathophysiologischen Phänomene.

Introduction

Eine schnelle neuronale Kodierung von Klängen ist für normale Hörfunktionen unerlässlich. Dazu gehören die Klanglokalisierungsfähigkeiten 1 , die Sprache in der Rauschunterscheidung 2 und das Verständnis anderer verhaltensrelevanter Kommunikationssignale 3 . Analoge Neuronen, die sich im auditorischen Hirnstamm von Vogel und Säugetieren befinden, sind hochspezialisiert für eine schnelle neuronale Kodierung 4 . Dazu gehören der Hühnerkern Magnocellularis (NM), der Nucleus laminaris (NL) und deren Säugetieranaloga, der anteroventrale Cochlearkern (AVCN) und der mediale Superior Olive (MSO) bzw. 5 . Allerdings sind Entwicklungsmechanismen, die eine schnelle neuronale Kodierung regulieren, im auditorischen Hirnstamm schlecht verstanden. Daher ist es vorteilhaft, spezifische Gene zu studieren, die für eine schnelle neuronale Kodierung verantwortlich sind, um ihren Ausdruck, ihre Regulierung und ihre Funktion in au zu verstehenDitory Entwicklung.

Der Entwicklung von Hühnerembryo ist ein wirksames und etabliertes Forschungsinstrument, um grundlegende biologische Fragen der auditorischen Systementwicklung zu untersuchen 6 , 7 . Jüngste molekulare Fortschritte haben diese biologischen Fragen in den sich entwickelnden Hühnerembryo durch Ausdrücken oder Klopfen von Genen von Interesse, um in vivo Gen-Funktion 8 , 9 zu analysieren. Die Untersuchung der regulatorischen Rolle von spezifischen Genen ist ein wichtiger Fortschritt beim Verständnis von Pathologien im Zusammenhang mit akustischen Defiziten. Hier präsentieren wir in der Ovo- Elektroporation von Plasmid-codierten Genen in den Hühner-Hirnstamm, wo eine schnelle neuronale Kodierung des Klangs auftritt 10 . Durch die Ausrichtung auf auditorische neuronale Vorläuferregionen, die mit den Rhombomeren 5 und 6, 11 , 12 (R5 /R6) zeigen wir die räumliche Kontrolle der Plasmid-Transfektion in NM und NL. Darüber hinaus zeigen wir eine zeitliche Regulierung des Ausdrucks durch die Annahme eines Tet-on-Vektorsystems. Dies ist ein Arzneimittel-induzierbares Verfahren, das die interessierenden Gene in Gegenwart von Doxycyclin (Dox) 8 exprimiert.

Protocol

Alle Verfahren wurden von Northwestern University Institutional Animal Care und Use Committees genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guidelines für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Eierbearbeitung Kaufen Sie befruchtete Eier von einem örtlichen Verkäufer. Eier bei 13 ° C im Kühlschrank für höchstens 5 Tage vor der Inkubation aufbewahren. Die Embryo-Lebensfähigkeit verringert sich nach 1 Woche deutlich. …

Representative Results

Wir zeigen hier, dass in ovo Elektroporation die Genexpression in einem normal sich entwickelnden biologischen System erlaubt. Plasmid-codierte Gene werden fokal in das Neuralrohr injiziert, das über R5 / R6 liegt. Ein schematisches Beispiel für die Elektroden- und Pipettenplatzierungen relativ zu wichtigen anatomischen Markern ist in Fig. 1A gezeigt . Die korrekte Position der Plasmidinjektion wird 24 h nach der Elektroporation bestätigt und in 1B ge…

Discussion

In ovo Elektroporation ist eine Methode zur Expression oder Klopfen von Genen von Interesse, um in vivo Gen-Funktion 8 , 9 zu analysieren. Im Hühnerembryo ist es eine innovative Methode zur Expression von Plasmid-codierten Genen in verschiedene akustische Hirnstammregionen 8 . Um einen optimalen Ausdruck zu gewährleisten, sind mehrere kritische Schritte erforderlich. Zuerst nur Embryonen injizieren, deren Otozysten deu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria und Frau Ximena Optiz-Araya für die erste Unterstützung bei der Protokollierung und zur Bereitstellung von Plasmiden. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCD Grant DC013841 (JTS) unterstützt.

Materials

Fertilized white leghorn chicken eggs Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer Parker Hannifin 052-0500-900 Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator Grass Technologies SD9 SD9
Microfil syringe needles World Precision Instruments MF28G67-5 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder Warner Instruments 64-1280 MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode FHC PBSA1075 PBSA1075
Air tank/regulator NU Laboratory Services Air dry 300 CF
Fast green Sigma Aldrich F7258-25G F7258-25G
Clear plastic tape Scotch 191
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D9891-1G
Egg refrigerator Vissani Wine Refrigerator 13.3-16.1° C (56-61° F)
Incubator Hova-Bator 37.8° C (100° F), ~50% humidity
Dissection scope Zeiss 4.35E+15 SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source Zeiss 4.36E+15 CL6000 LED
Micromanipulators Narishige Japan Model: MM-3 2 Micromanipulators
Capillary tubes Sutter Instrument BF150-86-10 Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes 1 mL, 3 mL
Needles BD Precision Glide  27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps Stoelting No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder Custom Made Clay base works as well
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97
Syringe filter Ultra Cruz sc-358811 PVDF 0.22 μm

References

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Cite This Article
Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).

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