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Developmental Biology

鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

doi: 10.3791/55628 Published: June 9, 2017

Summary

鳥類および哺乳動物の聴覚脳幹ニューロンは、正常な聴覚機能のための基本的なプロセスである高速神経エンコーディングに特化しています。これらのニューロンは、胚後脳の別個の前駆細胞から生じる。我々は、聴覚発達中の遺伝子機能を研究するために、ニワトリ胚の後脳における遺伝子を発現させるためにエレクトロポレーションを利用する技術を提示する。

Abstract

エレクトロポレーションは、ニワトリ胚のような生物学的に関連する生物に関心のある遺伝子を導入する方法である。ニワトリ胚は、聴覚系発達の基本的な生物学的機能を研究するための有効な研究モデルであることは長い間確立されている。より最近では、ニワトリ胚は、聴覚に関連する遺伝子発現、調節および機能の研究において特に価値があるようになった。 内では、エレクトロポレーションを用いて、高度に特殊化された聴覚機能を担う聴性脳幹領域を標的とすることができる。これらの領域は、ニワトリ核magnocellularis(NM)および核laminaris(NL)を含む。 NMおよびNLニューロンは、菱形5および6(R5 / R6)の別個の前駆体から生じる。ここでは、これらの領域における遺伝子関連特性を研究するために、プラスミドコード遺伝子の卵内エレクトロポレーションを提示する。我々は、機能的表現型の増加または減少のいずれかを促進する遺伝子発現の空間的および時間的制御のための方法を示すes。 R5 / R6に関連する聴覚神経前駆細胞を標的化することにより、NMおよびNLにおけるプラスミドトランスフェクションを示す。遺伝子発現の時間的調節は、tet-onベクターシステムを採用することによって達成することができる。これは、ドキシサイクリン(Dox)の存在下で目的の遺伝子を発現する薬物誘発性の手順である。 インビボでのエレクトロポレーション技術は、生化学的、薬理学的、および/または生体内での機能アッセイとともに、聴覚ニューロン発達および関連する病態生理学的現象を研究する革新的なアプローチを提供する。

Introduction

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正常な聴覚機能のためには、音声の高速神経符号化が不可欠です。これには、音の定位能力1 、騒音弁別2の声音、および他の行動関連の通信信号3の理解が含まれる。鳥類および哺乳動物の聴性脳幹に位置する類似のニューロンは、高速神経エンコーディングに高度に特化されています4 。これらには、ニワトリ核大細胞膜(NM)、核薄片(NL)およびそれらの哺乳類類似体、前庭内蝸牛核(AVCN)および内上位オリーブ(MSO)が含まれる。しかし、聴性脳幹では、速い神経のコード化を制御する発達メカニズムはほとんど理解されていない。したがって、auにおける発現、調節および機能をよりよく理解するためには、速い神経のコード化に関与する特定の遺伝子を研究することが有利である誕生日の開発。

発育中のニワトリ胚は、聴覚系発達の基本的な生物学的問題を研究するための効果的かつ確立された研究ツールである 6,7 。近年の分子進歩は、インビボ遺伝子機能を解析するために興味のある遺伝子を発現またはノックダウンすることにより、ニワトリ胚の発生におけるこれらの生物学的問題に対処している。特定の遺伝子の調節的役割を調べることは、聴力障害に関連する病理を理解する上で重要な進歩です。ここでは、プラスミドエンコードされた遺伝子の卵内電気穿孔法を、鶏の聴覚脳幹に提示し、速い神経のコード化が起こる10 。菱形5および6に関連する聴覚神経前駆細胞を標的化することによって11,12(R5 /R6)、NMおよびNLにおけるプラスミドトランスフェクションの空間的制御を示す。さらに、tet-onベクターシステムを採用することにより、発現の時間的調節を示す。これは、ドキシサイクリン(Dox) 8の存在下で目的の遺伝子を発現する薬物誘導性の手順である。

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Protocol

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すべての手順は、ノースウェスタン大学機関動物用ケアおよび使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のための国立衛生研究所ガイドラインに従って実施された。

1.卵の取り扱い

  1. 地元の業者から受精卵を購入する。インキュベーションの5日前まで冷蔵庫に13°Cで卵を保管してください。胚の生存率は1週間後に著しく低下する。
  2. インキュベーターにセットする前に各卵を70%エタノールで拭く。
  3. インキュベーター内の温度を38℃に設定し、約50%の湿度で1~2ダースの卵を両側に置きます。これは、電気穿孔および最適生存率のための適切な胚の位置を確実にする。
    注:インキュベーションの48〜52時間後、卵はハンバーガー - ハミルトン(HH)ステージ〜12〜13にあり、エレクトロポレーションの準備ができます。

2.準備

  1. プラスミドMi
    1. DNA混合物7μLごとに1μLの0.1%高速緑色(18MΩ脱イオン化および蒸留H 2 O [ddH 2 O]中0.1%)を加える。
    2. 複数のプラスミドの同時エレクトロポレーションのために、プラスミドを1:1の比率で混合する。最終的なDNA濃度は5〜8μg/μLでなければなりません。
  2. 注入ピペットを充填する
    1. マイクロピペットプーラーでピペットを引っ張ります。 28Gシリンジ針を用いて1-2μLのプラスミドでピペットを満たします。
    2. 鉗子を使用してピペットチップを10〜20μmに破る。壊れたピペットチップのサイズを決定するのを助けるために顕微鏡を使用してください。ピコスプライザーのピペットホルダーにピペットを取り付けます。

3.ウィンドウ処理

注:ウィンドウ処理手順は、 13より前に公開されています。追加のビジュアル情報については、参考文献13を参照してください。

  1. すべての楽器と作業領域を70%エタノール。
  2. インキュベーターから所望の数の卵を取り出し(室温で放置)、70%エタノールで卵を個別に拭きます。インキュベーターを取り外した後、少なくとも2時間は卵を生存させる。
  3. 胚の位置を特定するために卵を照明器具の上に置く。暗い領域( すなわち 、胚)の中心を鉛筆で囲む。
  4. 19G針を使用して、卵の鈍い端に穴を開ける。
  5. 卵の尖った側に描かれた円の近くに別の穴を突き刺す。 19Gの針で外卵殻(約16mm 2 )の小さな部分を削除し、鉗子で内側の卵殻(約8mm 2 )の小さな部分を削除します。
  6. 19G針を装着した3mLシリンジで、平滑末端の穴を通して卵から1.5-2.5mLのアルブミンを取り出します。ニードルを45°に傾けてください。
  7. 平滑末端の穴を小さなテープ(1cm×1cm)で覆ってください。描かれた円を覆うテープで2番目の穴(2.5 cm x 4 cm)。
  8. 湾曲したはさみ(刃先= 2.5cm)で、円内の窓を切断します。はさみは卵殻に平行で、窓の直径は2cm未満でなければなりません。

プラスミド注入

  1. picospritzerをオンにします。圧力を18 psiに、持続時間を5μsに設定します。解剖顕微鏡用のエアータンクとランプを点灯させます。
  2. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に混合した店頭購入インディアンインクを1:10に希釈した30 mLストック溶液を調製する。 4℃で保存する。インディアンインクの注入は、ニワトリ胚のより良い可視化を得るための重要なステップです。
    1. 希釈したインディアンインク溶液で1 mLシリンジを満たします。 27Gの針を取り付けて、シリンジに入っている気泡を追い出す。
    2. 胚から2〜3mmの卵黄膜のすぐ下に針を挿入し、胚の下に約0.2mLのインディアンインクを注射する。行う胚の生存率を低下させる可能性があるため、インディアンインクを0.5 mL以上注入しないでください。
  3. 解剖顕微鏡の下の卵のホルダーに窓の卵を置きます。プラスミドの注入部位を最もよく視覚化するには、最高倍率を使用します。
  4. 鉗子を使用して、注入領域上の膜を除去する。興味のある聴性脳幹領域(NMおよびNL)はRhombomeres 5および6(R5 / R6)から生じる。 R5 / R6は、R5 / R6プラスミド注入のランドマークとして役立つ耳鞘(内耳に発生する脊椎動物の胚構造)に隣接して位置する。
  5. マイクロマニピュレーターを使用して、R5 / R6領域と卵胞嚢の間にある神経管にDNA充填ピペットを下ろします。理想的な配置の模式図を図1Aに示します。
  6. ピコスプライザーから空気圧(18psi、5μs持続時間)をかけて神経管内のDNAを放出させる。

5.エレクトロポレーション

  1. tをオンにする彼は電流/電圧刺激装置である。
  2. PBSで3 mLシリンジを満たし、シリンジフィルターを取り付けます。胚にPBSを1〜2滴加える。
  3. 注射部位(内側)の上の陰性電極とR5 / R6( 図1A )の側方の陽電極とを有するマイクロマニピュレーターを用いて双極電極を胚に下げる。胚との直接接触を避ける。電極材料が白金イリジウムであるバイポーラ電極を使用する。鉗子で先端間の間隔を0.5 mmに調整する。
  4. 電流/電圧刺激装置を使用して、50Vで1秒間に1秒の間隔で20回パルスする。
  5. エレクトロポレーションの後、露出した領域に1滴のPBSを加える。静かに電極を取り出し、実験室の組織と70%エタノールで拭いてください。胚をテープで露出させたウィンドウを閉じます。
  6. 注入されたプラスミドの種類と孵化日で卵殻にラベルを付ける。
  7. ウインドウを上にしてインキュベーターに卵を戻します。 38℃で50℃でインキュベートする所望の発達段階に達するまで湿度%。
  8. tet-onベクターを遺伝子発現の一時的な制御のためにエレクトロポレーションする場合、遺伝子発現を誘導するために24時間毎にDoxycycline(Dox)を適用する(セクション6参照)。

6.遺伝子発現の時間制御のためのテット・オン・システム

  1. 以下のプラスミドを使用してください:
    pCAGGS-T2TP:プラスミドを発現するトランスポザーゼ。
    pT2K-CAGGS-rtTA-M2:Dox結合タンパク質を安定に発現するプラスミド。
    pT2K-BI-TRE-EGFP:EGFPレポーターおよび目的の第2の遺伝子の双方向tet-onプロモーター(TRE)駆動発現を含むプラスミド。
    注:上記3つのプラスミドは、1:1:1の比で共エレクトロポレーションする必要があります。
  2. ストック溶液調製:
    1. Doxを滅菌PBSに溶解して、1 mg / mLのストック溶液を調製する。 -20℃で保存する。
  3. Doxアプリケーション:
    1. 表現を誘導する24時間ごとにDoxを適用する。
    2. Doxを適用するときは、卵を取り出し、窓を開き、Dorox50μLを腎臓の腎臓の膜にピペットで移し、窓を閉じてインキュベーターに戻します。

脳幹スライスの解剖領域の準備

注記:以下のセクション(7-9)および手順は14日前に公開されています。追加のビジュアル情報については、これらの参考文献を参照してください。

  1. 寒天溶液(40mg / mLアガロース、 すなわち ddH 2 O中4%)を調製する。ペトリ皿に寒天溶液を注ぎ、室温で凝固させます。組織の脳幹スライスの間の将来の使用のために、寒天プレートを冷蔵庫に保存する。
  2. 95%O 2および5%CO 2 (pH 7.2-7.4およびオスモル濃度:295〜310mOsm / L)を有する人工大脳脊髄液(ACSF)を連続的に泡立てる。
  3. ワーキングエリアとビブラトームを70%EtOHで洗浄し、刃を蒸留水ですすいでください。
  4. 適切な切開ツールを使用して、作業領域に清潔な液体吸収パッドを置きます。
  5. 寒天プレートを冷蔵庫から取り出し、小さな寒天キューブ(10mm×10mm×8mm)を切断する。市販のスーパーグルーを使用して、寒天ブロックをビブラトームスライシングチャンバーのステージに接着します。

チキン聴覚脳幹の単離

  1. テーピングされた窓の場所で卵を開きます。メスでメンブレン嚢を穿刺し、鶏の胚の頭を取り除く。
  2. 鋭いはさみで鶏肉を断頭してください。
  3. カミソリの先端を目のわずかに後方に置きます。吻側から尾側への頭蓋骨を通って切開する。胚の年齢に応じてわずかな圧力をかけます。より古い胚はより多くの圧力を必要とする。
  4. 静かに頭蓋骨を露出させるために皮と羽を脇に押し、正中線カットを確認します。
  5. sを適用するトロン圧、頭蓋骨の吻側部分をカミソリの刃でスライスします。直ちに目の後ろに刃を置き、頭蓋骨や脳の組織全体を切断します。
  6. 頭の両側の頸部筋肉の少し前に、頭蓋骨の尾側領域のハサミで中線から横方向の切開を行い、頭蓋骨および過剰組織を引き離すことによって脳および小脳を露出させる。
  7. はさみで脳幹に付着した組織を切除し、脳幹を自由に離します。

生体内電気生理学または画像化のための脳幹スライスの調製

  1. 視神経を介して脳幹をピン止めする。
  2. はさみで足を切断し、第4脳室の床を露出させて小脳を除去する。
  3. ピンセットを使用して、膜組織および血管を脳幹表面から除去する。
  4. 脳幹をブロックするには、4つの床の最も吻側の端に水平に切る心室の尾側に位置する。脳幹部を隔離するために、視神経乳頭を横切る横方向切断を行う。
  5. 寒天ブロックの直前のビブラトームステージに少量のスーパーグルーを置きます。
  6. ピンセットを使用して脊髄の脳幹を持ち上げ、鼓膜側を下に、背側をビブラトームの刃に向かってスーパー接着剤の上に置きます。実験室のティッシュペーパーまたは濾紙で余分な接着剤を除去する。
  7. 酸素化されたACSFをビブラトームステージに注ぎます。ビブラトームの刃を20〜22°の角度に設定します。最大振幅振動でビブラトームを開始する。組織の上部がブレードと平行になるようにステージをブレードに向かって上に動かします。
  8. 急速に脳幹組織に向かってブレードを動かす。ブレードが組織に接触する前にブレードをかなりゆっくりと下ろす。
  9. 可能な限り遅い速度で組織をスライスします。ブレードが冠状組織切片全体を通過したら、移送ピペットを用いて穏やかにスライスを除去する</ li>
  10. ステージを200〜300μm下げ、再びスライスします。聴覚核の解剖学的ランドマークが目に見えるようになるまで、例えばNLの別個の背側/腹側ニューロピル領域およびNLに対するNMの内側位置のように繰り返す。
  11. ACFSでスライスを慎重に管理する。これは、温水浴を使用して、室温(22℃)または生理的条件に近い(〜41℃)で行うことができる。スライスの順序に注意してください。第1のスライスは組織の最も尾側の領域に対応し、最後のスライスは最も吻側領域に対応する。これは、大まかに言えば、低周波から高周波数の符号化領域からの聴覚脳幹のトモシンピック構成をそれぞれ表す。

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Representative Results

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我々は、卵子でエレクトロポレーションが正常に発生する生物系における遺伝子発現を可能にすることをここに示す。プラスミドにコードされた遺伝子は、R5 / R6の上にある神経管に局所的に注射される。重要な解剖学的マーカーに対する電極およびピペット配置の概略的な例を図1Aに示す 。プラスミド注入の正確な位置は、エレクトロポレーションの24時間後に確認され、 図1Bに示されている 。 R5 / R6を覆う神経管への標的化されたプラスミドの注射は、特定の聴性脳幹領域、すなわちNMおよびNL (11)における発現を可能にする。 図1Cは、微分干渉コントラスト(DIC)照射下でのE12胚からのインビトロ脳幹スライスを示す。関心のある聴覚領域が概説されている。蛍光照度( 1C1)では、N内のニューロンを発現するYFPMとNLは見える。 図1Dは、高倍率下でのE18胚のDIC照明を示す。多数のNMニューロンの古典的な樹状細胞体が明らかである。蛍光照射( 図1D 1 )では、他のトランスフェクトされたニューロンが焦点面外にある間に、YFPを発現するNMニューロンがはっきりと見える。標的NM領域の一部のニューロンのみがトランスフェクトされるので、同じ核内の他のニューロンが、二重パッチクランプ電気生理学実験中に内部対照として機能することが可能になる。導入遺伝子は薬物適用によって一時的に調節され、正確な発達期間での遺伝子発現および操作を可能にする。

図1
図1: チキンAuのオーボエのエレクトロポレーションDitory Brainstem。 ( A )HHステージ12ニワトリ胚の後脳におけるエレクトロポレーションの模式図。インジェクションピペットは、注入された後脳(菱形5/6 [R5 / R6])の可視化のためにプラスミドDNAおよび高速緑色染料で満たされる。この研究では、目的の遺伝子と黄色蛍光タンパク質(YFP)レポーターを共発現するプラスミドを使用した。電気穿孔された胚を、所望の発生段階に達するまでさらにインキュベートする。 ( B )左眼(矢印、E)および左卵巣(矢印、O)に対するYFP発現の部位を示す胎生(E)4日目のニワトリ胚。破線の白い線は、背側脳および脳幹境界を表す。スケールバー=480μm。 ( CおよびC 1 )微分干渉コントラスト(DIC、 C )および蛍光(YFP、 C 1 )照明下でのE12チキンからの脳幹スライス(300μm厚) n。破線の白い線は、核大細胞膜(NM)および核薄片(NL)の境界を表す。脳幹スライスは、組織の片側のみを示していることに注意してください。白い矢印は、脳幹スライスの正中線の溝を表す。白い矢印は、NMおよびNLのYFP発現領域を示す。 V =腹側、M =内側。スケールバー=240μm。 ( DおよびD1 )NMを含むE18ニワトリ胚脳幹スライスの高倍率(80倍水浸対物レンズ)。古典的な樹状細胞本体15は、DIC照明下ではっきりと見える(上向きの矢印D )。同じスライスの蛍光照明では、YFP蛍光によって同定されたトランスフェクトされたNMニューロンがはっきりと見える(上向き矢印、 D1 )。アスタリスク=焦点面の直下のNMニューロンを発現するYFP。スケールバー=30μm。large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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卵内エレクトロポレーションでは、 in vivo遺伝子機能を解析するために目的の遺伝子を発現またはノックダウンする方法8,9 。ニワトリの胚では、それはプラスミドにコードされた遺伝子を異なる聴性脳幹領域に発現させる革新的な方法です8 。最適な発現を確保するためには、いくつかの重要なステップが必要です。まず、卵胞嚢がはっきりと見える胚を注入するだけです。卵胞嚢が見えない場合、胚はエレクトロポレーションのための正しい発達段階ではない。第2に、より小さなピペットチップは、神経管に容易に浸透し、組織損傷をより少なくする。しかし、破損した先端は、DNAを排出するのに十分な大きさでなければならない。第3に、R5 / R6の上にある神経管領域全体をDNAで満たす(高速緑色溶液の拡散によって視覚化される)。最後に、可能な限り胚の近くに刺激電極を配置することは、impオルタント。しかし、電流パルスは組織を焦がして損傷させる可能性があるので、胚との直接接触を避けるようにしてください。

この技術の改変は、胚の生存能力およびプラスミドの発現を改善するのに役立ち得る。まず、高い生存率を維持するために、到着24時間以内に卵をセットすることが重要です。第二に、卵の窓は、不十分なシールによる液体の損失( すなわち脱水)が胚の死亡を増加させるため、テープで密封されなければならない。第3に、卵胞嚢の視覚化を最適化するために、できるだけ少ない量のインキを使用して、胚の吻側からインディアンインキを注入する。最後に、刺激電極をR5 / R6領域間でわずかに動かして、電流強度を増加させることなく帯電領域を広げることができる。

上記の提案にもかかわらず、制限が存在することに留意すべきである。これらには、トランスフェクトされたニューロンの可変速度、脳幹スライス内のそれらの位置、および胚の生存。トランスフェクション効率は胚の間で異なりますが、我々はこれまでに記載された電気穿孔パラメータで報告しました〜NM / NLニューロンの5-10%が一貫してトランスフェクションされています8 。ニューロントランスフェクションの速度がより速い場合でも、 インビトロパッチクランプ電気生理学のための脳幹組織の調製は困難をもたらす。例えば、脳幹スライスは200〜300μmの厚さであり、場合によっては、トランスフェクトされたニューロンは組織内で深くなりすぎて適切にパッチして機能アッセイを行うことができない。最終的に、成功したエレクトロポレーションの後の胚の生存は、トランスフェクション率ほどではないにしても変わります。実験的使用のための所望の胚の年齢に依存して、生存の変動性は80-20%の間で激しくなり、後者は最も古い胚(> E18)に対応する。

ニワトリにおける卵内エレクトロポレーションの重要性は、哺乳動物モデル系よりも数rイースンズ16 。第一に、それは比較的安価であり、トランスジェニック動物またはノックダウン動物の優れた代替物である。次に、鶏は細胞、シナプス、ニューラルネットワークレベルで音の時間的情報を処理する哺乳動物と類似の核を共有します17 。同様の聴覚機能の例は、哺乳動物のAVCN / MSOとニワトリのNM / NL、類似の聴覚脳幹構造との間でそれぞれ起こる4,5 。しかし、マウスやラットなどの伝統的な高周波数聴覚哺乳動物研究モデルとは異なり、鶏は低周波および高周波信号によって提供されるキューを利用して聴覚情報を符号化する18 。最後に、鶏は聴覚早熟動物である。すなわち、それらの聴覚系は、出生時に機能成熟に近く、聴覚の発症および精緻化は、環境影響のない胚段階で起こる> 19,20。対照的に、典型的な哺乳類の研究モデルのための聴覚の発症は、出生後10-13日目に始まる21,23

生化学的、薬理学的、および機能的アッセイと組み合わせて、卵遺伝子操作は、解剖学的および生理学的専門化のニューロン特異的発生を研究する革新的なアプローチを提供し、聴性脳幹発達における明確な期間の制御を可能にする。

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Disclosures

著者は何も開示することはない。

Acknowledgments

私たちはDrsに感謝したいと思います。プロトコルの設定とプラスミド提供のための初期支援については、Leslayann Schecterson、Yuan Wang、Andres Barria、Ximena Optiz-Araya氏この研究は、NIH / NIDCDグラントDC013841(JTS)によって支持された。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer Parker Hannifin 052-0500-900 Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator Grass Technologies SD9 SD9
Microfil syringe needles World Precision Instruments MF28G67-5 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder Warner Instruments 64-1280 MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode FHC PBSA1075 PBSA1075
Air tank/regulator NU Laboratory Services Air dry 300 CF
Fast green Sigma Aldrich F7258-25G F7258-25G
Clear plastic tape Scotch 191
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D9891-1G
Egg refrigerator Vissani Wine Refrigerator 13.3 - 16.1 °C (56-61° F)
Incubator Hova-Bator 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity
Dissection scope Zeiss 4.35E+15 SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source Zeiss 4.36E+15 CL6000 LED
Micromanipulators Narishige Japan Model: MM-3 2 Micromanipulators
Capillary tubes Sutter Instrument BF150-86-10 Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes 1 mL, 3 mL
Needles BD Precision Glide  27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps Stoelting No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder Custom Made Clay base works as well
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97
Syringe filter Ultra Cruz sc-358811 PVDF 0.22 μm

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References

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鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔
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Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).More

Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).

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