Auditoriske hjernestammenes neuroner av avians og pattedyr er spesialisert på rask nervekoding, en grunnleggende prosess for normale hørefunksjoner. Disse nevronene oppstår fra tydelige forløperne av embryonale hindbrain. Vi presenterer teknikker som benytter elektroporasjon til å uttrykke gener i hindre av kyllingembryoer for å studere genfunksjon under auditiv utvikling.
Elektroporation er en metode som introduserer gener av interesse for biologisk relevante organismer som kyllingembryoen. Det er lenge fastslått at kyllingembryoen er en effektiv forskningsmodell for å studere grunnleggende biologiske funksjoner for lydsystemutvikling. Mer nylig har kyllingembryoen blitt spesielt verdifull i å studere genuttrykk, regulering og funksjon forbundet med hørsel. I ovo kan elektroporasjon brukes til å målrette auditiv hjernestamregion som er ansvarlig for høyt spesialiserte hørselsfunksjoner. Disse områdene inkluderer kyllingekernen magnocellularis (NM) og nucleus laminaris (NL). NM- og NL-neuroner oppstår fra tydelige forløpere av rombomerer 5 og 6 (R5 / R6). Her presenterer vi i ovo elektroporation av plasmidkodede gener for å studere genrelaterte egenskaper i disse regionene. Vi viser en metode for romlig og tidsmessig kontroll av genuttrykk som fremmer enten gevinst eller tap av funksjonell fenotypees. Ved å målrette auditoriske neurale progenitorregioner assosiert med R5 / R6, viser vi plasmidtransfeksjon i NM og NL. Temporal regulering av genuttrykk kan oppnås ved å vedta et tet-on-vektorsystem. Dette er en legemiddelinducerbar prosedyre som uttrykker genene av interesse i nærvær av doxycyklin (Dox). I ovo elektroporasjonsteknikken – sammen med enten biokjemiske, farmakologiske og eller in vivo funksjonelle analyser – er det en nyskapende tilnærming til å studere lydutvikling og tilhørende patofysiologiske fenomener.
Rask neural koding av lyd er viktig for normale lydfunksjoner. Disse inkluderer lyd lokaliseringsevner 1 , tale i støy diskriminering 2 , og forståelsen av andre adferdsrelevante kommunikasjonssignaler 3 . Analoge nevroner som er lokalisert i den hørbare hjernestammen til både avianer og pattedyr, er høyt spesialiserte for rask neural koding 4 . Disse inkluderer kyllingekernen magnocellularis (NM), nucleus laminaris (NL) og deres pattedyranaloger, den anteroventrale cochleære kjernen (AVCN) og den mediale overlegne oliven (MSO) henholdsvis 5 . Imidlertid er utviklingsmekanismer som regulerer rask nervekoding, dårlig forstått i den hørbare hjernestammen. Derfor er det fordelaktig å studere spesifikke gener som er ansvarlige for rask nervekoding for å bedre forstå deres uttrykk, regulering og funksjon i auSykdomsutvikling.
Den utviklende kyllingembryoen er et effektivt og veletablert forskningsverktøy for å studere grunnleggende biologiske spørsmål om lydsystemutvikling 6 , 7 . Nylige molekylære fremskritt har adressert disse biologiske spørsmålene i det utviklende kyllingembryoen ved å uttrykke eller slå ned gener av interesse for å analysere in vivo genfunksjon 8 , 9 . Undersøkelse av regulerende rolle av spesifikke gener er en betydelig fremgang i forståelse av patologier forbundet med auditiv underskudd. Her presenterer vi i ovo elektroporasjon av plasmidkodede gener inn i kylling-auditiv hjernestammen, hvor rask nervekoding av lyd forekommer 10 . Ved å målrette auditiv nevrale progenitorregioner assosiert med rombomerer 5 og 6 11 , 12 (R5 /R6), viser vi romlig kontroll av plasmidtransfeksjon i NM og NL. I tillegg viser vi temporal regulering av uttrykk ved å vedta et tet-on vektorsystem. Dette er en medisininducerbar prosedyre som uttrykker genene av interesse i nærvær av doxycyklin (Dox) 8 .
I ovo elektroporation er en metode for å uttrykke eller slå ned gener av interesse for å analysere in vivo genfunksjon 8 , 9 . I kyllingembryoen er det en nyskapende metode for å uttrykke plasmidkodede gener i forskjellige auditive hjernestammeområder 8 . For å sikre optimal uttrykk, er det nødvendig med flere kritiske trinn. Først injiser bare embryoer hvis otocystene er tydelige. Hvis otocytter ikke er synlige,…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria og Fru Ximena Optiz-Araya for førstehjelp med protokolloppsett og for å levere plasmider. Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIDCD grant DC013841 (JTS).
Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3-16.1° C (56-61° F) | |
Incubator | Hova-Bator | 37.8° C (100° F), ~50% humidity | |
Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |