Слуховые нейроны головного мозга птиц и млекопитающих специализируются на быстром нейронном кодировании, фундаментальном процессе нормальных слуховых функций. Эти нейроны возникают из разных предшественников эмбрионального заднего мозга. Мы представляем методы, использующие электропорацию для экспрессии генов в заднем мозге куриных эмбрионов для изучения функции генов во время слухового развития.
Электропорация представляет собой метод, который вводит гены, представляющие интерес, в биологически соответствующие организмы, такие как куриный эмбрион. Уже давно установлено, что куриный эмбрион является эффективной исследовательской моделью для изучения основных биологических функций развития слуховой системы. В последнее время куриный эмбрион стал особенно ценным при изучении экспрессии генов, регуляции и функции, связанных с слухом. В ovo электропорация может использоваться для лечения слуховых областей головного мозга, ответственных за высокоспециализированные слуховые функции. Эти области включают ядро цыпленка magnocellularis (NM) и ламинариум ядра (NL). Нейроны NM и NL возникают из разных предшественников ромбомеров 5 и 6 (R5 / R6). Здесь мы приводим в оо электропорации генов, кодируемых плазмидой, для изучения связанных с генами свойств в этих регионах. Мы показываем метод пространственного и временного контроля экспрессии генов, который способствует либо усилению, либо потере функционального фенотипаэс. Ориентируясь на слуховые области нервных предшественников, связанные с R5 / R6, мы показываем трансфекцию плазмид в NM и NL. Временная регуляция экспрессии генов может быть достигнута путем применения векторной системы tet-on. Это лекарственная индуцибельная процедура, которая выражает гены, представляющие интерес в присутствии доксициклина (Dox). Методика электропорации в ovo – вместе с биохимическими, фармакологическими и / или in vivo функциональными анализами – обеспечивает инновационный подход к изучению развития слухового нейрона и связанных с ним патофизиологических явлений.
Быстрое нейронное кодирование звука имеет важное значение для обычных слуховых функций. Они включают в себя возможности локализации звука 1 , речь в шумовой дискриминации 2 и понимание других поведенческих релевантных сигналов связи. 3 . Аналогичные нейроны, расположенные в слуховом стволе мозга как у птиц, так и у млекопитающих, являются высокоспециализированными для быстрого нейронного кодирования 4 . К ним относятся ядра цыпленка magnocellularis (NM), ламинарины ядра (NL) и их аналогов млекопитающих, антевровентральное кохлеарное ядро (AVCN) и медиальная превосходная оливковая (MSO), соответственно 5 . Однако механизмы развития, регулирующие быстрое нейронное кодирование, плохо изучены в слуховом стволе мозга. Поэтому выгодно изучать специфические гены, которые ответственны за быстрое нейронное кодирование, чтобы лучше понять их выражение, регуляцию и функцию в auРазвитие.
Развивающийся куриный эмбрион является эффективным и хорошо зарекомендовавшим себя инструментом исследования для изучения основных биологических вопросов развития слуховой системы 6 , 7 . Недавние молекулярные успехи затронули эти биологические вопросы у развивающегося куриного эмбриона, выразив или сбив гены, представляющие интерес, для анализа генных функций in vivo 8 , 9 . Изучение регуляторной роли конкретных генов является значительным продвижением в понимании патологий, связанных с слуховым дефицитом. Здесь мы представляем в электроэлектронике генов, кодируемых плазмидой, в слуховой мозг мозга курицы, где происходит быстрое нейронное кодирование звука 10 . Ориентируясь на слуховые области нервных предшественников, связанные с ромбомерами 5 и 6 11 , 12 (R5 /R6), мы показываем пространственный контроль трансфекции плазмиды в NM и NL. Кроме того, мы показываем временную регуляцию выражения, применяя векторную систему tet-on. Это лекарственная индуцируемая процедура, которая выражает гены, представляющие интерес, в присутствии доксициклина (Dox) 8 .
В ovo электропорация представляет собой метод выражения или сбивания генов, представляющих интерес, для анализа функции гена vivo 8 , 9 . В курином эмбрионе это инновационный метод для экспрессии генов, кодированных плазмидой, в разные области слухо…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить доктора. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria и Mrs. Ximena Optiz-Araya за начальную помощь в установлении протокола и предоставлении плазмид. Эта работа была поддержана грантом NJH / NIDCD DC013841 (JTS).
Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3-16.1° C (56-61° F) | |
Incubator | Hova-Bator | 37.8° C (100° F), ~50% humidity | |
Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |