Summary

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Published: June 09, 2017
doi:

Summary

Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz.

Abstract

Elektroporasyon, genleri tavuk embriyo gibi biyolojik açıdan önemli organizmalara tanıtan bir yöntemdir. Tavuk embriyonunun işitsel sistem gelişiminin temel biyolojik işlevlerini incelemek için etkili bir araştırma modeli olduğu uzun zamandır bilinmektedir. Daha yakın zamanlarda, tavuk embriyo, işitme ile ilişkili gen ekspresyonu, düzenlenmesi ve işlevinin incelenmesinde özellikle değerli hale geldi. Ovo elektroporasyonu, son derece uzmanlaşmış işitme işlevlerinden sorumlu işitsel beyin sapı bölgelerini hedeflemek için kullanılabilir. Bu bölgeler tavuk çekirdeği magnocellularis (NM) ve çekirdek laminaris (NL) içerir. NM ve NL nöronları rhombomerlerin 5 ve 6 (R5 / R6) 'nın belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. Burada, bu bölgelerdeki gen ile ilgili özellikleri incelemek için plasmidle kodlanmış genlerin ovo elektroporasyonunda sunuluyoruz. Fonksiyonel fenotipin kazanılmasını veya kaybedilmesini teşvik eden, gen ifadesinin mekânsal ve zamansal kontrolü için bir yöntem gösteriyoruzes. R5 / R6 ile ilişkili işitsel nöral progenitör bölgeleri hedefleyerek, NM ve NL'de plazmid transfeksiyonunu gösteririz. Gen ekspresyonunun zamansal regülasyonu bir tet-on vektör sistemi benimseyerek başarılabilir. Bu, doksisiklinin (Dox) varlığında ilgilenilen genleri ifade eden bir uyuşturucu ile uyarılabilir prosedürdür. İn ovo elektroporasyon tekniği – ya biyokimyasal, farmakolojik ve / veya in vivo fonksiyonel testlerle – birlikte, işitsel nöron gelişimini ve buna bağlı patofizyolojik olayları incelemek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Sesin hızlı sinirsel kodlaması normal işitme işlevleri için gereklidir. Bunlar arasında ses lokalizasyon yetenekleri 1 , gürültü ayırımı 2'deki konuşma ve davranışsal olarak diğer iletişim sinyallerinin anlaşılması 3 bulunur . Hem kuşların hem de memelilerin işitsel beyin sapında bulunan benzer nöronlar, hızlı sinirsel kodlama 4 için son derece uzmanlaşmıştır. Tavuk çekirdeği magnocellularis (NM), çekirdek laminaris (NL) ve bunların memeli analogları, anteroventral koklear çekirdek (AVCN) ve sırasıyla medial superior zeytin (MSO) 5 içerir . Bununla birlikte, hızlı sinirsel kodlamayı düzenleyen gelişim mekanizmaları, işitsel beyin sapında çok az anlaşılmıştır. Bu nedenle, hızlı inal kodlamadan sorumlu belirli genleri au'da ifade, düzenleme ve işlevlerini daha iyi anlamak için incelemek avantajlıdırDitory gelişme.

Gelişmekte olan tavuk embriyo, işitsel sistem gelişiminin temel biyolojik sorularını incelemek için etkili ve köklü bir araştırma aracıdır 6 , 7 . Son moleküler ilerlemeler, gelişmekte olan tavuk embriyosundaki bu biyolojik soruları , in vivo gen fonksiyonunu analiz etmek için ilgi genleri çürüterek veya çürüterek ele almıştır 8,9 . Spesifik genlerin düzenleyici rolünün araştırılması, işitsel açıklarla ilişkili patolojilerin anlaşılmasında önemli bir gelişmedir. Burada, plazmid kodlu genlerin, hızlı nöral ses kodlamasının gerçekleştiği tavuk işitme beyin sapı içine ovo elektroporasyonunda sunuyoruz. 5 ve 6 no.lu rhombomeres 11 , 12 ile birlikte görülen işitsel sinirsel progenitör bölgeleri hedef alarak (R5 /R6), biz NM ve NL plazmid transfeksiyon mekansal kontrol göstermektedir. Buna ek olarak, bir tet-on vektör sistemi benimseyerek ifadenin zamansal düzenlenişini gösteriyoruz. Bu, doksisiklinin (Dox) 8 varlığında ilgilenen genleri ifade eden bir uyuşturucu ile uyarılabilir prosedürdür.

Protocol

Tüm prosedürler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Ulusal Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberleri Ulusal Enstitüleri uyarınca gerçekleştirilmiştir. 1. Yumurta Taşıma Gübrelenmiş yumurtaları yerel bir satıcıdan satın alın. Kuluçka öncesi en fazla 5 gün boyunca yumurtaları 13 ° C'de bir buzdolabında saklayın. Embriyo canlılığı, 1 hafta sonra belirg…

Representative Results

Ovo elektroporasyonunda normal olarak gelişen bir biyolojik sistemde gen ifadesine izin verdiğini burada gösteriyoruz. Plasmid ile kodlanmış genler, R5 / R6 üzerinde bulunan sinir tüpüne fokal olarak enjekte edilir. Önemli anatomik belirteçlere göre elektrod ve pipet yerleşimlerinin şematik bir örneği Şekil 1A'da gösterilmiştir. Plazmid enjeksiyonunun doğru konumu, elektroporasyondan 24 saat sonra doğrulanır ve Şekil 1B'de</…

Discussion

Ovo elektroporasyonunda in vivo gen fonksiyonunu analiz etmek için ilgi genleri eksprese eden veya yere seren bir yöntem 8 , 9 . Tavuk embriyosunda plazmid kodlu genleri farklı işitsel beyin sapı bölgelerinde ifade etmek için yenilikçi bir yöntem 8 . Optimal ifade sağlamak için birkaç kritik adım gereklidir. İlk olarak, yalnızca otokistleri açıkça görülen embriyolar enjekte edin. Otokistler görünür…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Drs'a teşekkür etmek isteriz. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria ve Bayan Ximena Optiz-Araya, protokol kurulumu ile ilk yardım için ve plazmid sağlamak için. Bu çalışma NIH / NIDCD hibe DC013841 (JTS) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Fertilized white leghorn chicken eggs Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer Parker Hannifin 052-0500-900 Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator Grass Technologies SD9 SD9
Microfil syringe needles World Precision Instruments MF28G67-5 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder Warner Instruments 64-1280 MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode FHC PBSA1075 PBSA1075
Air tank/regulator NU Laboratory Services Air dry 300 CF
Fast green Sigma Aldrich F7258-25G F7258-25G
Clear plastic tape Scotch 191
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D9891-1G
Egg refrigerator Vissani Wine Refrigerator 13.3-16.1° C (56-61° F)
Incubator Hova-Bator 37.8° C (100° F), ~50% humidity
Dissection scope Zeiss 4.35E+15 SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source Zeiss 4.36E+15 CL6000 LED
Micromanipulators Narishige Japan Model: MM-3 2 Micromanipulators
Capillary tubes Sutter Instrument BF150-86-10 Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes 1 mL, 3 mL
Needles BD Precision Glide  27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps Stoelting No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder Custom Made Clay base works as well
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97
Syringe filter Ultra Cruz sc-358811 PVDF 0.22 μm

References

  1. Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
  2. Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
  3. Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
  4. Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
  5. Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
  6. Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
  7. Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
  8. Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  9. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
  10. Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
  11. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
  12. Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
  13. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
  14. Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
  15. Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
  16. Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
  17. Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
  18. Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
  19. Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
  20. Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
  21. Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
  22. Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
  23. Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).

Play Video

Cite This Article
Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).

View Video