Summary
الطرق التي تسمح بتوصيف وعزل السكان الخلايا الجذعية من العينات البيولوجية هي حاسمة لنهوض العلاجات المستهدفة الخلايا الجذعية في السرطان وما بعدها. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الجذعية السرطانية باستخدام النمط الظاهري الجانب الصبغة أثارت الصبغة.
Abstract
السرطان هو مرض يحركها الخلايا الجذعية والقضاء على هذه الخلايا أصبح هدفا علاجيا رئيسيا. فك رموز الضعف في الخلايا الجذعية للسرطان (سسس) وتحديد الأهداف الجزيئية المناسبة تعتمد على الطرق التي تسمح للتمييز محددة في عينات غير متجانسة مثل خطوط الخلايا والأنسجة الورم خارج الجسم الحي . التدفق الخلوي / فاكس هو تقنية قوية ل متعدد بارامتريكالي تشريح العينات البيولوجية على مستوى الخلية واحد، وحتى الآن طريقة الاختيار لاسترداد الخلايا الحية لتحليلات المصب. وكثيرا ما استخدمت علامات السطح مثل CD44 و CD133 وكذلك الكشف عن نشاط الأنزيمية نازعة ألدهيد لتحديد وفرز الخلايا الجذعية السرطانية من عينات الورم من قبل فاكس. نهج تكميلي، هو موضح هنا في التفاصيل المنهجية، يجعل من استخدام قذف الصبغة وظيفية من قبل ناقلات المخدرات أبك، والذي يحدد مجموعة متميزة من الخلايا مضان خافت عادة ما يشار إلى السكان الجانب (سب). SP؛ الخلايا السرطانية تحمل خصائص الخلايا الجذعية الكنسي ويمكن إلغاؤها وأكد وظيفيا باستخدام العوامل التي تمنع نقل المخدرات صبغة البثق (في كثير من الأحيان ABCB1 / P- سكري بروتين / MDR1 / CD243 و ABCG2 / Bcrp1 / CD338). وعلاوة على ذلك، فإن فحص سب متوافق مع غيرها من التقييمات سايتوميتريك تدفق مثل تلطيخ المستضدات السطحية، كشف ألدهيد نازعة والتمييز الخلايا الميتة (على سبيل المثال ، مع 7-آد أو يوديد بروبيديوم (بي)). وهكذا، فإننا تصف طريقة قيمة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحديد كسك والعزلة وتوصيف الفرعي ميكانيكيا على أساس وظيفية، بدلا من المعلمة المظهرية. على الرغم من أن يؤدي أصلا مع هويشت 33342 كما اثار الصبغة، ونحن هنا التركيز على أحدث النمط الظاهري صبغة البنفسجي سب التي يمكن حلها على أي تدفق مقياس التدفق الخلوي مجهزة مصدر الليزر البنفسجي.
Introduction
وقد تحسنت فعالية العلاجات السرطانية الأولية بشكل كبير على مدى العقد الماضي بسبب التقدم الجذري في الفهم الجيني والجزيئي للمرض وظهور الأدوية المستهدفة مثل الأجسام المضادة العلاجية ومثبطات جزيء صغير. وعلى النقيض من ذلك، لا يزال المرض المنتشر والمتكرر غير قابل للشفاء عادة، ولا تزال معدلات الاعتلال والوفيات مرتفعة في هذه الأوضاع السريرية. الخلايا الجذعية السرطانية تمثل شريحة فرعية متميزة داخل الأورام، وهبت مع خصائص الخلايا الجذعية الأساسية مثل كلونوجينيسيتي / توموريجنيسيتي، ومقاومة متعددة المخدرات وتقسيم الخلايا غير المتماثلة 1 ، 2 . وبالتالي، الخلايا الجذعية السرطانية ليس فقط دفع تطور النقيلي وتغير الورم، ولكن أيضا تستمر خلال فترة العلاج لتهدئة المريض إلى الانتكاس. ولذلك فإن التخلص من كسك العلاجي هو حاجة طبية هامة لمنع تكرار المرض والسماح للعلاج على المدى الطويل من السرطان 3
ويتوقف تحديد مواطن الضعف وتوضيح الاستراتيجيات الرامية إلى القضاء على الخلايا الجذعية السرطانية بشكل كبير على الطرق التي تسمح بتنقيتها من العينات البيولوجية لتصنيف التعبير اللاحق و / أو التحقيق الوظيفي. في المقابل، تعتمد هذه الأساليب على علامات سطحية أو داخل الخلايا أو وظيفية محددة لهذه الخلايا. وتشمل علامات سطح كسك الخاصة، على سبيل المثال لا الحصر، CD44، CD133، CD24 و CD90، وقد استخدمت لتحديد سكان الخلايا الجذعية السرطانية في مجموعة متنوعة من كيانات الورم بما في ذلك سرطان الثدي وسرطان القولون 4 . علامة أخرى، ألدهيد نازعة (ألد)، ويظهر توطين الخلايا ويمكن الكشف وظيفيا توفير الركيزة منها التي تنتج التحويل الأنزيمي الضوء. باستخدام هذا الاختبار، تم تحديد السكان كسك في كيانات الورم متنوعة وكذلك 5 . طريقة تكميلية، ويشار إليها عادة باسم تحليل سب وتصوير هنا في م تفاصيل إيثودولوجيكال، تسخير إفلوكس صبغ نشط من قبل ناقلات المخدرات أبك لتحديد مجموعات صغيرة من الخلايا مضان خافت الجذعية مثل 6 ، 7 ، 8 . لتحقيق ذلك، يتم حضانة عينة معينة في وجود فلوراوفور ملزم للدهون الحمض النووي الذي يدخل جميع الخلايا من خلال نشر السلبي ويستهدف الحمض النووي النووي والميتوكوندريا لالتزام. غير الخلايا الجذعية السرطانية خالي من التعبير أبك نقل المخدرات تتراكم الصبغة مما أدى إلى مضان مضيئة، في حين أن الخلايا الجذعية السرطانية قذف بنشاط الصبغة التي تقلل مضان. تثبيط الدوائية من نشاط نقل المخدرات يلغي ويؤكد وظيفيا النمط الظاهري سب ويجب أن تستخدم لأغراض التحكم. وقد تم الكشف عن السكان كسك المعرضة خصائص سب، من بين أمور أخرى، في سرطان المبيض 9 ، 10 ، سرطان البروستاتا 11 ،> 12، سرطان الثدي 13 ، سرطان الرئة 14 ، سرطان بطانة الرحم 15 ، الورم 16 و 17 والساركوما العظام 18 . الأهم من ذلك، فحص سب متوافق مع كل من خطوط الخلايا السرطانية والأنسجة الورم الأولية، على الرغم من أن المواد الأولية يطرح تحديات إضافية مثل شرط لاستراتيجية محددة لتمييز الخلايا السرطانية (بعض السكان خلية المضيف يمكن أن يحمل خصائص سب كذلك) 19 ، 20 .
إن اثنين من أكثر ناقلات المخدرات المخدرة من نوع سب هي: ABCB1 / P-غليكوبروتين / MDR1 / CD243 و ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 ، 9 ، 21 ؛ ومع ذلك، يمكن أن ناقلات المخدرات الأخرى يكون محدد الجزيئي للنمط الظاهري سب أيضا (على سبيل المثال ، ABCB5) 22 . ABCB1يمكن أن تكون معزولة بكفاءة مع فيراباميل في حين أن نشاط ABCG2 يمكن إلغاؤها على وجه التحديد مع فومترمورجين C (فتس) 6 ، 19 . قوة معينة من تحليل سب هو أنه يمكن دمجها مع تلطيخ أخرى (على سبيل المثال ، علامات السطح و ألد) وأنه يسمح استعادة الخلية الحية وبالتالي تتوافق مع التحقيقات الوظيفية المصب. وعلاوة على ذلك، كشف سب ينطبق على نطاق واسع بسبب ارتفاع حفظ ناقلات المخدرات أبك بين السكان لجنة كسك 9 ، 23 .
في الأصل، تم إجراء الكشف سب باستخدام هويشت 33342 باعتباره صباغة اثار 24 . هذا الصبغة يحقق قرار ممتاز ولكنه يتطلب الإثارة الليزر فوق البنفسجية. وبالتالي تطبيقه يقتصر بطبيعة الحال إلى الصكوك تدفق سايتوميتريك الراقية. وقد افتتح ظهور دييكل البنفسجي (دكف) 25 أفينو جديدةإس لتحليل سب وتوسيع نطاق تطبيق هذه الطريقة إلى الصكوك تدفق سايتوميتريك القياسية تفتقر إلى مصدر ليزر الأشعة فوق البنفسجية (مصدر الليزر البنفسجي يكفي لحل الخلايا دكف-سب). الأهم من ذلك، هويشست 33342 و دكف حصة الخصائص مضخة مشتركة، مشيرا إلى أن إما صبغ يجب تحديد نفس السكان الخلية.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول تجريبي مفصل من تحليل سب القائم على دكف لسرعة وسهولة الاستنساخ في مختبرات مستقلة. وبالتالي فإننا نرى مقالنا كمورد للباحثين كسك التي ينبغي أن تسهم في تحسين وتوحيد هذه الطريقة البيولوجية البيولوجية مفيدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول هو في الامتثال الكامل مع المبادئ التوجيهية مجلس مراجعة الأخلاقية المؤسسية القياسية. إذا تم التحقيق في الأنسجة البشرية أو الحيوانية باستخدام البروتوكول الموصوف هنا، والباحثين ملزمون الحصول على موافقة من مجلس المراجعة ذات الصلة من مؤسستهم أو بلدهم.
تنبيه: تنطبق الاحتياطات القياسية للتعامل الآمن مع العينات البيولوجية على هذا البروتوكول. وهذا يشمل ارتداء القفازات ومعطف المختبر، وأداء العمل تحت خزانة السلامة الأحيائية كلما كان ذلك ممكنا.
1. إعداد الخلايا
- خلايا الخلايا السرطانية
- ثقافة خط الخلايا السرطانية البشرية أو الفئران منها في 37 درجة مئوية في 10-30 مل من الوسط المناسب (على سبيل المثال ، رمي 1640 تستكمل مع 10٪ ( الخامس / الخامس ) فبس، 2 ملي L- الجلوتامين والبنسلين 1X / الستربتومايسين) والحصاد الخلايا في شبه كونفلنسي ( أي 70-90٪) باستخدام الهضم مع 0.05٪ التربسين-إدتا أو بعض الآخر دي-أتإجراء أشمنت. تحديد عدد الخلايا والتحقق من البقاء على قيد الحياة باستخدام غرفة العد وتلوين الأزرق تريبان. وينبغي أن تتجاوز نسبة الخلايا القابلة للحياة 85٪.
ملاحظة: أمثلة على خطوط الخلايا السرطانية البشرية التي تؤوي مقصورات سب تشمل MCF7 / هتب-22 و SKBR3 / هتب-30 (سرطان الثدي)، A2780 و سكوف-3 / هتب-77 (سرطان المبيض)، و A549 (سرطان الرئة) 26 .
- ثقافة خط الخلايا السرطانية البشرية أو الفئران منها في 37 درجة مئوية في 10-30 مل من الوسط المناسب (على سبيل المثال ، رمي 1640 تستكمل مع 10٪ ( الخامس / الخامس ) فبس، 2 ملي L- الجلوتامين والبنسلين 1X / الستربتومايسين) والحصاد الخلايا في شبه كونفلنسي ( أي 70-90٪) باستخدام الهضم مع 0.05٪ التربسين-إدتا أو بعض الآخر دي-أتإجراء أشمنت. تحديد عدد الخلايا والتحقق من البقاء على قيد الحياة باستخدام غرفة العد وتلوين الأزرق تريبان. وينبغي أن تتجاوز نسبة الخلايا القابلة للحياة 85٪.
- السابقين الجسم الحي الأنسجة الورم
- أخذ عينة الورم الجراحي جديدة أو بدلا من ذلك، حصاد الأنسجة الورم من نموذج الورم زرع أو وراثيا هندسيا. خذ 200-1،000 ملغ من الأنسجة وتوليد تعليق خلية واحدة عن طريق التفكيك الميكانيكي (على سبيل المثال ، باستخدام مقص أو مشرط) والهضم الأنزيمي (على سبيل المثال ، باستخدام كوكاج كولاجيناز / ديسباس / دناز كوكتيل).
- تصفية العينة من خلال مصفاة قطع 70 ميكرون. تحديد عدد الخلايا والتحقق من البقاء على قيد الحياة باستخدام غرفة العد و تريبان بلإي تلطيخ.
ملاحظة: الكوكتيلات الهضم غالبا ما تحتوي على 200 ميكروغرام / مل كولاجيناز P، 0.8 U / مل ديسباس و 25 ميكروغرام / مل دناز الأول، وأوقات الحضانة تتراوح عادة من 20 - 50 دقيقة. من الناحية المثالية، يتم إجراء فرز الأنسجة وفقا لبروتوكول الأمثل للأنسجة قيد التحقيق 27 ، 28 ، 29 .
2. عينات الاختبار
- ضبط تركيز الخلية إلى 1 × 10 6 خلايا / مل في وسط ثقافة جديدة (المركبات التي تحتوي على المغذيات مهم كما قذف الصبغة هو عملية نشطة للطاقة). وأخيرا، ونقل 1 مل من العينة إلى التدفق الخلوي العادي / فاكس أنبوب جولة القاع (المسمى 'اختبار').
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، يمكن أن يكون من الضروري أن يكون تركيز الخلية معاير (على سبيل المثال 5 × 10 5 -1 × 10 6 -2.5 × 10 6 خلايا / مل)، ولكن تركيز الخلية أقل عمومالي يعطي أعلى دقة 19 . فقط لفرز التطبيقات حيث يجب استرداد الحد الأقصى لعدد الخلايا سب، فمن المستحسن لزيادة تركيز الخلية لتصل إلى 1 × 10 7 خلية / مل. - إضافة 10 ميكرومتر من دكف للعينة وتخلط جيدا، إما عن طريق فورتيكسينغ لطيف أو ريسوسبندينغ لمدة 3-5X. انتقل إلى ضوابط تثبيط.
ملاحظة: قد تعتمد النتائج المثلى على معايرة الصبغة اثار (على سبيل المثال 2.5؛ 5؛ 10؛ 20 ميكرومتر)، ولكن تركيز صبغ أعلى عموما ينتج دقة أعلى 19 .
3. تثبيط الضوابط
- نقل 250 ميكرولتر من تعليق خلية تحتوي على صبغ إلى التدفق الخلوي جديد / فاكس أنبوب جولة القاع (المسمى 'السيطرة'). إضافة 50 ميكرومتر من فيراباميل أو 20 ميكرومتر من فتس وتخلط جيدا عن طريق بيبتينغ.
ملاحظة: فيراباميل و فتس هي المثبطات الأكثر راسخة لتحليل سب ولكن لديها مختلف مضخة إفوكس سبيسيفيكيتذ: فيراباميل يمنع العديد من الناقلين المخدرات أبك بما في ذلك ABCB1 و ABCB5، في حين أن فتس هو محدد ل ABCG2 6 ، 19 . إذا كان حالة سب من عينة فردية غير معروف، فمن المستحسن استخدام كل من فيراباميل و فتس في أنابيب منفصلة.
4. تلطيخ
- كاب على حد سواء 'اختبار' و 'السيطرة' أنابيب واحتضان لهم في 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 90 دقيقة، مع الإثارة لطيف كل 15 دقيقة. معظم قذف صبغة في الخلايا سب سوف تحدث في غضون 45 دقيقة الأولى، ولكن تراكم الصبغة في الخلايا غير سب (المساهمة في القرار) هو فقط القصوى بعد 75-90 دقيقة 19 .
- بعد تلطيخ كاملة، وغسل الخلايا في 3-4 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني و ريسوسبيند بيليه في حجم 100 ميكرولتر (بس كذلك). الحفاظ على الخلايا في الظلام والبرد على الجليد، والشروع في تلطيخ علامات إضافية. بدلا من ذلك، أداء مباشرة تدفق سايتوميتريك آناتحلل.
5. كوستينينغ ل علامات أخرى
- إضافة لوحة المطلوب من الأجسام المضادة مترافق فلوريوكروم إلى الخلايا الملطخة دكف، وتخلط جيدا واحتضان الخلايا في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 20-30 دقيقة. غسل الخلايا في 3 - 4 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني والشروع في التمييز الخلايا الميتة.
ملاحظة: تنسيقات الأجسام المضادة التي هي متوافقة بسهولة مع دكف وتكاد لا تتطلب تعويض بيركب أو بيركب-Cy5.5، بي-Cy7، أبك، اليكسا فلور 647، أبك-Cy7، أبك-H7، BV711، اليكسا فلور 750 و BV786 . الأشكال التي تتوافق مع دكف ولكن قد تتطلب تعويض تشمل فيتس، اليكسا فلور 488، بي و BV650. الأشكال التي لا تتوافق تقريبا مع دكف تشمل BV421، V450 و V500. - إضافة 7-آد (أو بي) إلى الخلايا الملطخة دكف في التركيز الموصى بها من قبل مصنع معين واحتضان العينات لمدة 5-10 دقيقة في الظلام. تصفية العينات من خلال 70 ميكرون قطع مصافي والانتقال إلى تدفق تحليل سايتوميتريك.
6. تدفق تحليل سايتوميتريك
ملاحظة: فمن المستحسن للتبديل على كل منها تدفق سايتوميتريك الصك خلال عملية تلطيخ بالفعل بحيث يتم تعيين كل شيء في أقرب وقت العينات جاهزة. ويشمل ذلك أيضا إجراءات الصيانة القياسية مثل تتبع أداء النظام وإعادة تعبئة الخزانات.
- الحصول على الخلايا على مقياس التدفق الخلوي وبوابة لهم على ثنائي الاتجاه فسك / سك نقطة مؤامرة (الشكل 1B). استبعاد دوبلتس والمجمعات بمقارنة الإشارات المختلفة من فسك ( أي الارتفاع والعرض والمنطقة) (الشكل 1C).
- إذا تم تضمين علامة خلية ميتة، بوابة على جزء الخلية قابلة للحياة (على سبيل المثال ، 7-آد سلبية) ( الشكل 1D ). تصور خلايا القميص قابلة للحياة على مؤامرة نقطة ثنائية المتغير ل "الأزرق" و "الأحمر" الانبعاثات دكف. تحقيقا لهذه الغاية، عرض "الأزرق" قناة مضان على المحور ص (على سبيل المثال ، 450/50) و "الأحمر "على محور س (على سبيل المثال ، 525/50).
- تبديل كل القنوات إلى الوضع الخطي وضبط الفولتية كاشف المقابلة بحيث سب يقع إلى جانب المؤامرة في الربع السفلي الأيسر. على العكس من ذلك، يقع غير سب إلى الربع الأيمن العلوي من المؤامرة التي تعكس توزيع دورة الخلية (G1 و G2). بوابة سب ووقف الاستحواذ ( الشكل 1E ).
ملاحظة: يمكن الكشف عن الخلايا سب المحددة دكف باستخدام أدوات التدفق سايتوميتريك مجهزة مصدر الإثارة الليزر البنفسجي ( أي خط ليزر 405 نانومتر). وهو واحد محدد من تحليل سب أن مضان المنبعثة يقاس في الوضع الخطي وفي قناتين منفصلتين عرضت على مؤامرة نقطة ثنائية المتغير. ويقاس الانبعاث "الأزرق" من دكف بنحو 450 نانومتر (على سبيل المثال ، مع مرشح 450/40 القياسية) ويقاس الانبعاثات الحمراء "دكف في حوالي 510 - 585 نانومتر (على سبيل المثال ، مع 510/50، و 525/50 أو فلتر 585/15) 19 . نظرا للكيمياء الخاصة للمقايسة، والفصل بين سب وخلايا غير سب هو عموما أعلى في "أحمر" قناة مضان 19 .
- تحميل السيطرة تثبيط (ق) والحصول على البيانات. وقد اختفت الآن الخلايا سب أو يتم تخفيض بشكل كبير ( الشكل 1F ). إذا لزم الأمر، صقل بوابة سب استنادا إلى هذه البيانات.
- للتحقيق في التعبير علامة سطح من قبل خلايا سب، وترك مضان "أحمر" دكف على المحور س وعرض قناة مضان منها على المحور ص في وضع لوغاريتمي (على سبيل المثال ، أبك). ضبط الفولتية كاشف المقابلة وبوابة جزء من الخلايا سب تلطيخ إيجابية للعلامة التحقيق (ق) ( الشكل 1G ). التعبير المشترك لعلامة معينة من قبل الخلايا سب ينتج إشارة منها في الربع الأيسر العلوي من المؤامرة 30 .
- سجلالبيانات و / أو فرز الخلايا سب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قدمت هو تحليل سب التمثيلية للخلايا A2780، وهو خط خلية سرطان المبيض الإنسان التي سبق عرضها على إيواء سب وهو ما يمثل أقل من 1٪ من الخلايا 9 . تم استزراع الخلايا في 37 درجة مئوية في رمي 1640 تستكمل مع 10٪ ( V / V ) فبس، 2 ملي L- الجلوتامين و 1 X البنسلين / الستربتومايسين وحصادها في 85٪ كونفلنسي باستخدام العلاج مع 0.05٪ التربسين-إدتا. تم غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني وتصفيتها من خلال 70 ميكرون مصافي قطع. تم تحديد عدد الخلايا باستخدام غرفة العد وتلطيخ الأزرق التريبان و 1 × 10 6 خلايا / مل (وسط الطازجة) كانت ملطخة 10 ميكرومتر دكف لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. في موازاة ذلك، تم حاضنة قسامة منه في وجود 20 ميكرومتر فتس تحت بالضبط نفس الظروف. تم غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 4 مل وأضيفت الأجسام المضادة أبك مترافق ضد ABCG2 إلى أنبوب 'اختبار' في تركيز ما قبل المعايرة. بعد إنكوباتيعلى لمدة 25 دقيقة في 4 درجات مئوية، تم غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني، و 7-عاد تضاف إلى تسمية الخلايا الميتة. تم تبريد العينات على الجليد وتحليلها على أداة فاكس. إن إستراتيجية النابضة المبينة هي أكثر قابلية للتطبيق عالميا على عينات أخرى، على الرغم من أن المواد غير المتجانسة مثل عينات من عينات الأنسجة قد تتطلب تعريف مسبق لجزء الخلية المستهدفة باستخدام علامات سطح محددة (على سبيل المثال ، إبكام، CD45، CD31). وتهدف النتائج المعروضة لتكون بمثابة مرجع للكشف سب المستندة إلى دكف في مختبرات أخرى. وبالتالي، ينبغي أن تكون التجمعات النسبية للسكان الخلية التحقيق قابلة للمقارنة تقريبا، ولكن بالتأكيد ليست متطابقة، لتلك التي حصل عليها باحثون آخرون مع عينات بيولوجية مستقلة.
الشكل 1: سير العمل وممثل النتائج. (A) الرسم البياني تدفق الرئيسي للكشف سب باستخدام دكف ستاينينز. كوستينينغ للحصول على علامات إضافية اختيارية، ولكن من المستحسن تمييز الخلايا الميتة. ( بغ ) تحليل ممثل سب من A2780 خلايا سرطان المبيض البشرية التي أجريت على أداة فاكس. يتم بوابات الخلايا وفقا لخصائص فسك / سك (B) و دوبلتس وتستثنى المجاميع بمقارنة المعلمات المختلفة ل فسك (على سبيل المثال ، الارتفاع والعرض) ( C ). بعد ذلك، يتم تمييز الخلايا الميتة عن طريق النابضة على 7-آد سلبية (أو بي سلبية) جزء الخلية ( D ). ثم يتم عرض خلايا واحدة حية على مؤامرة نقطة ثنائية المتغير الخطية لانبعاث دكف الأزرق والأحمر و سب (والمطابقة غير سب) بوابات ( E ). ويتم التحليل نفسه الآن مع السيطرة على تثبيط كل منها (في هذه الحالة تم استخدام فتس)، وهذا ينبغي أن يؤدي إلى اختفاء شبه كامل من الخلايا داخل بوابة سب ( F ). وأخيرا، يمكن تحديد سب بشكل أوثق، على سبيل المثال ، من قبل ديت(التي قد تكون مسؤولة عن قذف الصبغة وبالتالي إعطاء النمط الظاهري سب (في هذه الحالة ABCG2، وذلك تمشيا مع حساسية فتس). ( زاي ). فتس، فومترمورجين C؛ ألد، هيدروجين ألدهيد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما يعتمد التقدم في الإدارة السريرية للسرطان على تطوير طرائق العلاج التي تستهدف الخلايا الجذعية السرطانية. وستسرع طرق السماح لعزل الخلايا الجذعية السرطانية الموثوق بها من العينات البيولوجية بتحديد الأهداف المناسبة، ولذلك فهي ذات أهمية حاسمة في هذا المسعى. تحليل سب هو تقنية راسخة وقيمة لتحديد السكان كسك التي تعبر عن ناقلات المخدرات أبك وتنفيذ دكف وسعت تطبيقه على الصكوك تدفق سايتوميتريك القياسية. ميكانيكيا، التمييز سب يسخر إفلوكس صبغ نشط من قبل ناقلات المخدرات أبك للكشف عن الخلايا الجذعية السرطانية على أساس مضان منخفضة تنطوي على توطين مميزة في الجانب السفلي المؤامرة اليسار إلى المقابلة غير سب. الأهم من ذلك، كشف سب القائم على دكف هو طريقة قوية ومباشرة، مع الخطوات الأكثر أهمية هي (1) إعداد الخلايا (2) عملية تلطيخ (3) اختيار مثبط المناسبإيتور و (4) تحليل سايتوميتريك التدفق. لأن قذف الصبغة هو عملية نشطة للطاقة، فمن الأهمية خاصة لتبدأ مع بقاء الخلية جيدة. يمكن فقط خلايا قابلة للحياة (معربا عن نقل المخدرات) إنتاج سب. وعلاوة على ذلك، فإنه غالبا ما يكون من المنطقي لتحسين النسبة بين تركيز الصبغة وكثافة الخلايا وبالتالي تعزيز فصل الخلايا سب (بدوره، وهذا يتطلب معايرة كل من دكف والخلايا). والقاعدة العامة هي أن كلا من تركيز صبغة أعلى وانخفاض تركيز الخلية يؤدي إلى تحسين الفصل 19 . مفتاح لتجربة دكف ناجحة هو التحقق من صحة وظيفية ل سب باستخدام مثبطات الدوائية من النشاط الناقل المخدرات أبك. كما ذكر سابقا، فيراباميل و فتس هي من بين مثبطات الأكثر استقرارا لتحليل سب ولها خصائص مضخة مختلفة (فتس هو محدد ل ABCG2، في حين يمنع فيراباميل عدة مضخات). للعينات مع حالة سب غير معروف، فمن المستحسن استخدام كلامثبطات في أنابيب منفصلة. خيار آخر هو استخدام عموم أبك نقل المخدرات مثبط ريزيربين 4 . ومع ذلك، ينبغي أن يكون الباحثون على علم بأن التألق الذاتي لهذا المركب يمكن أن تتداخل مع إشارة دكف 19 . مرة واحدة يتم تحليل الخلايا لانبعاث دكف الأزرق والأحمر، ينبغي تعديل الفولتية كاشف بحيث تكون كل من السكان ( أي سب و غير سب) مرئية مع أقصى فصل. إذا كانت الصورة تبدو غريبة، قد يكون التحجيم اللوغاريتمي السبب (في هذه الحالة، تبديل كل القنوات مرة أخرى إلى الوضع الخطي).
ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن مقايسة سب القائم على دكف ليست محددة للسرطان ولا أنها وضعت أصلا لتطبيقها في علم الأورام. بدلا من ذلك، فإنه هو محدد لنقل أبك المخدرات، وبالتالي يسهل أيضا كشف وعزل الخلايا الجذعية الفسيولوجية (الأنسجة)، مثل النسب - سكا-1 + ج كيت +الخلايا الجذعية المكونة للدم 25 . وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن أنواع الخلايا متباينة إنشاء حواجز مخصصة في مواقع الجسم الحرجة أيضا يحمل خصائص سب 20 . وبالتالي يتطلب الكشف سب القائم على دكف إلى الأنسجة الأولية وبالتالي يتطلب تمييزا محددا من السكان الخلية المستهدفة باستخدام علامات مناسبة.
وبالنظر إلى الحفظ العالي لمضخات تدفق الدواء بين سكان كسك 9 ، 23 ، فإن كشف سب المستندة إلى دكف قابل للتطبيق على نطاق واسع، وهي حقيقة مثبتة أيضا من خلال استخدامه الناجح عبر كيانات الورم بما في ذلك الكيانات من أصل طبقة جرثومية مختلفة 9 ، 17 ، 18 - وتشمل المزايا الأخرى أن (1) الخلايا التي لها آثار مباشرة في مقاومة المخدرات يتم تحديدها (أهمية خاصة لمعالجة مجموعات سرطان الخلايا السريرية ذات الصلة سريريا الوساطة تتكرر المرضرانس) وأن (2) الكشف عن معلمة وظيفية، بدلا من ثابت، قد تمنح المزيد من فحص مقايسة وتحسين القرار 19 ، 31 ، 32 . من الجانب المفاهيمي / التكنولوجي، كشف سب المستندة إلى دكف يختلف بوضوح من تلطيخ السطح بوساطة الأجسام المضادة: (1) يظهر هيكل الهدف توطين الخلايا ويمثل الحمض النووي، وليس البروتين. (2) الفحص يكشف نشاط البروتين، وليس مجرد وجود أو كثافة. (3) يتم تعريف الخلايا المستهدفة بحكم مضان منخفضة، وليس عن طريق إشارة إيجابية. (4) كصبغ ملزمة الحمض النووي، دكف حساسة حتى الاختلافات الطفيفة في الخلية أو تركيز صبغة خلال تلطيخ 19 . (v) يتم قياس مضان دكف في الوضع الخطي، وليس لوغاريتمي. (6) يقاس مضان دكف ( أي مضان ولدت من فلورفور واحد) في قناتين منفصلتين، نأوت في نطاق موجي واحد. على الرغم من هذه الخصائص، تحليل سب القائم على دكف من السهل القيام به ويمتد بشكل واضح تدفق مربع سايتوميتريك لأبحاث كسك.
كما يوفر تحليل سب القائم على دكف العديد من الاحتمالات ل كوستينينغ لعلامات أخرى، كونها متوافقة مع كل من تلطيخ سطح بوساطة الأجسام المضادة التقليدية (العديد من الأشكال الممكنة) والفحص التجاري الكشف عن النشاط الأنزيمي ألد. ومع ذلك، فإننا هنا ركز على تلطيخ السطح والقارئ يشار إلى الأدب المنشورة 4 لمعرفة التفاصيل المنهجية على كوديتكتيون من النشاط ألد. على أي حال، يجب أن يكون جنبا إلى جنب مع تحليل سب سبس جنبا إلى جنب مع تمييز الخلايا الميتة والكواشف واضحة لهذا الغرض هي 7-آد و بي.
وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا سب المحددة (دكف) (وخلايا التحكم غير سب) يمكن أن تكون حية تنقيتها باستخدام تطبيق الفرز من الأدوات المقابلة سايتوميتريك التدفق. لأن فحص سب بالكشف عن وظيفية سنوياالتي يمكن أن تنتج الخلايا القابلة للحياة فقط، يمكن أن يتوقع عموما أن تكون قابلية الخلايا البكتيرية سب المستعادة مرتفعة (أحيانا تقارب 100٪). إذا كان ينبغي أن يكون هناك مشاكل مع ما بعد نوع البقاء على قيد الحياة ومع ذلك، يمكن التحقق من المعلمات الفنية المختلفة مثل حجم فوهة فوهة، وطبيعة عامل التخزين المؤقت، ودرجة الحرارة أثناء الفرز (باستخدام فوهة 70 ميكرون لم يكن لدينا مشاكل مع بقاء، ولكن فوهة أكبر قد لا تزال تساعد لخلايا حساسة جدا). يمكن إخضاع الخلايا المستعادة لتحليلات المصب مثل كرت-ير، النشاف الغربية والتنميط التعبير العالمي (على سبيل المثال ، باستخدام مجموعة الجينات أو التكنولوجيا رناسيق الأحدث). وعلاوة على ذلك، يمكن التحقيق في الخلايا سب المعزولة لخصائص الخلايا الجذعية وظيفية (على سبيل المثال ، خلية كلونوجينيسيتي زرع التسلسلي)، أو شبه المستزرعة لإنشاء خطوط الخلايا من الخلايا المخصبة أو حتى نقية سب التي قد تكون مستقرة لأشهر 9 . في منطقتنا، استخدمنا قوارير بلاستيكية ثنائية و متوسطة و تقليدية ثنائية الأبعاد للثقافة الفرعية الخلايا الجذعية السرطانية (دسف) المعروفة ب دكف 9 ، ولكن الطرائق الانتقائية الخلوية مثل ظروف ثقافة المرسى المستقل / 3D و وسائل الإعلام المتخصصة ستكون ممكنة أيضا. نقترح أن الظروف الأكثر ملاءمة للتوسع في المختبر من مقصورة سب معينة تحتاج إلى التحقق على أساس فردي.
وباختصار، نحن هنا تصور سير العمل التجريبي مفصل لتحديد / عزل كسك عن طريق تحليل سب القائم على دكف. يجب أن تساعد ورقتنا الباحثين كسك لتنفيذ وإنشاء هذه الطريقة المفيدة في المختبرات الخاصة بهم، والتي ينبغي أن تزيد من تعزيز توضيح الاستراتيجيات العلاجية كسك المضادة لتحسين الإدارة السريرية للسرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين ليس لديهم تضارب المصالح للإعلان. ولا توجد أيضا مشاركة غير مؤلفة في إعداد المخطوطة.
Acknowledgments
ويدعم ماكسيميليان بوتش من قبل زمالة إروين شرودنجر من صندوق العلوم النمساوية فوف (رقم المنحة J-3807).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
