Summary
שיטות המאפשרות אפיון ובידוד של אוכלוסיות תאי גזע מדגימות ביולוגיות הן קריטיות לקידום טיפולים מוכווני תאי גזע בסרטן ומעבר לו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גזע סרטניים באמצעות פנוטיפ האוכלוסייה בצד מופעלות בצד.
Abstract
סרטן הוא מחלה מונעת בתאי גזע וביעור תאים אלה הפך למטרה טיפולית חשובה. פענוח פגיעויות של תאי גזע סרטניים (CSCs) וזיהוי מטרות מולקולריות מתאימות מסתמך על שיטות המאפשרות אפליה ספציפית שלהם דגימות הטרוגניות כגון שורות תאים ו vivo רקמת הגידול. זרימת cytometry / FACS היא טכנולוגיה רבת עוצמה רב פרמטרי לנתח דגימות ביולוגיות ברמת התא בודד הוא עד כה את שיטת הבחירה לשחזר תאים חיים עבור ניתוחים במורד הזרם. סמנים פני השטח כגון CD44 ו CD133, כמו גם זיהוי של פעילות אנזימטית aldehyde dehydrogenase שימשו לעתים קרובות כדי להגדיר ולמיין CSCs מדגימות הגידול על ידי FACS. גישה משלימה, המתוארת כאן בפירוט מתודולוגי, עושה שימוש שחול פונקציונלי לצבוע על ידי מובילי סמים ABC, אשר מזהה אוכלוסייה ברורה של תאים פלואורסצנטי עמום המכונה בדרך כלל האוכלוסייה בצד (SP). SPתאים סרטניים מציגים מאפיינים של תאי גזע קנוניים וניתנים לביטול ואימות פונקציונלי באמצעות סוכנים המעכבים את טרנספורטר התרופה הסוחטת (לרוב ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 ו- ABCG2 / Bcrp1 / CD338). יתר על כן, אסאי SP תואם עם הערכות cytometric זרימה אחרים כגון מכתים של אנטיגנים פני השטח, זיהוי dededrogenase aldehyde ואפליה התא המת ( למשל , עם 7-AAD או propidium יודיד (PI)). לכן, אנו מתארים שיטה בעלת ערך ויישום נרחב עבור זיהוי CSC, בידוד ותת אפיון מכני מבוסס על פונקציונלי, ולא פנוטיפי פרמטר. למרות שבוצע במקור עם Hoechst 33342 כמו צבע מפעילה, אנחנו כאן להתמקד האחרונה יותר צבע ויולט צבע מבוססי פנוטיפ כי הוא solutionvable על כל cytometer זרימה מצויד עם מקור לייזר סגול.
Introduction
היעילות של טיפולים ראשוניים בסרטן השתפרה באופן משמעותי במהלך העשור האחרון, בשל ההתקדמות המשכנעת בהבנה הגנטית והמולקולרית של המחלה ובפיתוח תרופות ממוקדות כגון נוגדנים טיפוליים ומעכבי מולקולה קטנים. לעומת זאת, מחלה גרורתית וחוזרת ונשנית עדיין חשוכת מרפא, ותחלואה ותמותה נותרו גבוהות במסגרות קליניות אלו. CSCs מייצגים subpopulation ברורים בתוך גידולים והם ניחן תכונות תא גזע קנוני כגון clonogenicity / tumorigenicity, התנגדות מרובה סמים חלוקת תאים אסימטרי 1 , 2 . לפיכך, CSCs לא רק להניע התקדמות גרורה והטרוגניות הגידול, אלא גם להתמיד במהלך הטיפול כדי מראש את החולה כדי להישנות. טיפול CSC טיפולית היא לפיכך צורך רפואי חשוב כדי למנוע הישנות המחלה ולאפשר תרופה ארוכת טווח של סרטן 3
זיהוי הפגיעויות והבהרת האסטרטגיות לביעור CSCs תלוי במידה רבה בשיטות המאפשרות טיהורן מדגימות ביולוגיות עבור פרופיל הביטוי הבא ו / או חקירה תפקודית. בתורו, שיטות כאלה מסתמכים על פני השטח, תאיים או סמנים פונקציונליים ספציפיים עבור תאים אלה. סמנים פנימיים של CSC כוללים, אך אינם מוגבלים, CD44, CD133, CD24 ו- CD90, והם שימשו לזיהוי אוכלוסיות CSC במגוון גידולים סרטניים, כולל סרטן השד וסרטן המעי הגס. סמן נוסף, אלדהיד dehydrogenase (ALDH), מראה לוקליזציה תאיים וניתן לזהות פונקציונלית לספק מצע בהתאמה אשר המרה אנזימטית מייצרת אור. באמצעות בדיקה זו, אוכלוסיות CSC זוהו גם אצל גידולים מגוונים. שיטה משלימה, המכונה בדרך כלל ניתוח SP ותיארו כאן מ בפירוט דינמי, רתמות פעילה לצבוע על ידי מובילים סמים ABC לזהות אוכלוסיות קטנות של פלואורסצנטי אפל כמו בתאים 6 , 7 , 8 . כדי להשיג זאת, מדגם נתון מודגרת בנוכחות של fluorophore DNA lipophilic מחייב אשר מזין את כל התאים באמצעות דיפוזיה פסיבית מטרות DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי מחייב. שאינם CSCs נטול ביטוי ABC סמים transporter לצבור את הצבע וכתוצאה מכך הקרינה בהירים, ואילו CSCs פעיל extrude צבע אשר מפחית הקרינה. עיכוב תרופתי של פעילות טרנספורטר התרופה מבטל ומאשר פונקציונלית SP פנוטיפ SP ויש להשתמש בו לצורך שליטה. אוכלוסיות CSC המציגות מאפייני SP נחשפו, בין היתר, בסרטן השחלות 9 , 10 , סרטן הערמונית 11 ,> 12, סרטן השד 13 , סרטן ריאה 14 , סרטן רירית הרחם 15 , גליומה 16 , 17 ו סרקומה עצם 18 . חשוב לציין, את assay SP תואמת הן שורות תאים סרטניים ורקמת הגידול הראשוני, למרות שהחומר העיקרי מציב אתגרים נוספים כגון הדרישה לאסטרטגיה ספציפית אפליה תא הגידול (אוכלוסיות תאים מסוימים המארח יכול להפגין תכונות SP גם כן) 19 , 20 .
שני הוקמה ביותר SP-conferring סמים מובילים הם ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 ו ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; עם זאת, מובילי סמים אחרים יכולים להיות מקדם מולקולרי של פנוטיפ SP מדי ( למשל , ABCB5) 22 . ABCB1ניתן לחסום ביעילות עם verapamil ואילו הפעילות של ABCG2 ניתן לבטל במיוחד עם fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . כוח מסוים של ניתוח SP הוא כי זה יכול להיות משולב עם כתמים אחרים ( למשל , סמנים פני השטח ALDH) וכי זה מאפשר התא התא התא לחיות ובכך להיות תואם עם החקירות הפונקציונליות במורד הזרם. יתר על כן, זיהוי SP רלוונטי בעיקר בשל שימור גבוה של ABC סמים מובילי בקרב אוכלוסיות CSC 9 , 23 .
במקור, SP זיהוי בוצעה באמצעות Hoechst 33342 כמו צבע מפעילה 24 . צבע זה משיג רזולוציה מעולה אך דורש עירור לייזר אולטרא סגול; ולכן תחולתו מוגבלת באופן טבעי למכשירים cytometric זרימה גבוהה. הופעתו של DyeCycle ויולט (DCV) 25 פתחה avenu חדשEs לניתוח SP והרחיב את תחולתה של שיטה זו למכשירים cytometric זרימה סטנדרטי חסר מקור לייזר אולטרה סגול (מקור לייזר סגול מספיק כדי לפתור תאים DCV-SP). חשוב לציין, Hoechst 33342 ו DCV לשתף ספציפיות משאבה משותפת, המציין כי גם צבע צריך לזהות את אוכלוסיות תאים אותו.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול ניסיוני מפורט של DC מבוססי ניתוח SP עבור רבייה מהירה וקלה במעבדות עצמאיות. לכן אנו רואים במאמר שלנו משאב לחוקרי CSC, אשר אמור לתרום לאופטימיזציה ולתקינה של שיטה תאית-ביולוגית שימושית זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה עומד בקנה אחד עם תקן מוסדי המוסרי סקירה מועצת המנהלים הנחיות. אם רקמות אנושיות או חיות נחקרות באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, החוקרים מחויבים לקבל אישור מהמועצה לביקורת הרלוונטית של המוסד או המדינה שלהם.
זהירות: אמצעי זהירות סטנדרטיים לטיפול בטוח של דגימות ביולוגיות חלות על פרוטוקול זה. זה כולל ללבוש כפפות חלוק מעבדה, וביצוע העבודה תחת הממשלה biosafety בכל הזדמנות אפשרית.
1. הכנת תאים
- שורות תאים סרטניים
- תרבות האדם בהתאמה או Murine קו תאים סרטניים ב 37 מעלות צלזיוס ב 10-30 מ"ל של המדיום המתאים ( למשל , RPMI 1640 בתוספת 10% ( V / V ) FBS, 2 מ"מ L- גלוטמין ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין) ומסיק התאים ב sub-confluency ( כלומר 70-90%) באמצעות עיכול עם 0.05% טריפסין- EDTA או אחרת de-attכאבים. לקבוע את ספירת התאים לבדוק את הכדאיות באמצעות ספירה קאמרית מכתים כחול טריפאן. השבר של תאים קיימא צריך לחרוג 85%.
הערה: דוגמאות לתאי תאים סרטניים של בני אדם המאופיינים בתאי SP כוללים MCF7 / HTB-22 ו- SKBR3 / HTB-30 (סרטן השד), A2780 ו- SKOV-3 / HTB-77 (סרטן השחלות) ו- A549 (סרטן ריאה) 26 .
- תרבות האדם בהתאמה או Murine קו תאים סרטניים ב 37 מעלות צלזיוס ב 10-30 מ"ל של המדיום המתאים ( למשל , RPMI 1640 בתוספת 10% ( V / V ) FBS, 2 מ"מ L- גלוטמין ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין) ומסיק התאים ב sub-confluency ( כלומר 70-90%) באמצעות עיכול עם 0.05% טריפסין- EDTA או אחרת de-attכאבים. לקבוע את ספירת התאים לבדוק את הכדאיות באמצעות ספירה קאמרית מכתים כחול טריפאן. השבר של תאים קיימא צריך לחרוג 85%.
- Ex vivo רקמת הגידול
- קח דגימה טריים כירורגי חדש או לחילופין, קציר גידול רקמה מן transplantable או מהונדסים גנטית מודל העכבר. קח 200-1000 מ"ג של רקמה וליצור השעיה תא בודד על ידי הפרדה מכנית ( למשל , באמצעות מספריים או אזמל) ו עיכול אנזימטי ( למשל , באמצעות collagenase / dispase / קוקטייל DNase).
- סנן את המדגם דרך מסננת 70 מיקרומטר לחתוך את. לקבוע את ספירת התאים לבדוק את הכדאיות באמצעות תא ספירה ו trypan blUe מכתים.
הערה: קוקטיילים עיכול לעתים קרובות מכילים 200 μg / מ"ל collagenase P, 0.8 U / מ"ל dispase ו 25 מיקרוגרם / מ"ל DNase אני, פעמים הדגירה בדרך כלל נע בין 20 - 50 דקות. באופן אידיאלי, הפרדת רקמות מבוצעת על פי פרוטוקול אופטימיזציה עבור הרקמה תחת חקירה 27 , 28 , 29 .
2. מבחן דוגמאות
- התאמת ריכוז התא 1 x 10 6 תאים / מ"ל במדיום תרבות טרי (הרכב המכיל מזין חשוב כמו שחול צבע הוא תהליך פעיל צריכת אנרגיה). לבסוף, להעביר 1 מ"ל של מדגם cytometry זרימה רגילה / FACS צינור בתחתית עגול (שכותרתו "מבחן").
הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, זה יכול להיות צורך כי ריכוז התא הוא טיטרציה (למשל 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2.5 x 10 6 תאים / מ"ל), אבל נמוך ריכוז התא הכלליאני מניב רזולוציה גבוהה יותר 19 . רק למיון יישומים שבהם מספר מרבי של תאים SP יהיה התאושש, מומלץ להגדיל את ריכוז התאים עד 1 x 10 7 תאים / מ"ל. - הוסף 10 מיקרומטר DCV למדגם ומערבבים היטב, או על ידי vortexing עדין או resuspending עבור 3-5x. המשך לבקרת עיכוב.
הערה: תוצאות אופטימליות עשויות להיות קשורות בטיטרציה של הצבע המפעיל (למשל 2.5, 5, 10, 20 מיקרומטר), אך ריכוז צבע גבוה יותר מניב בדרך כלל רזולוציה גבוהה יותר 19 .
3. עיכוב בקרות
- העברת 250 μL של השעיה תא המכילים צבע כדי cytometry זרימה חדשה / FACS צינור בתחתית עגול (שכותרתו "שליטה"). הוסף 50 מיקרומטר של verapamil או 20 מיקרומטר של FTC ומערבבים היטב על ידי pipetting.
הערה: Verapamil ו- FTC הם המעכבים הבולטים ביותר לניתוח SP, אך יש להם משאבת זרימה שונהY: Verapamil מעכב מספר ABC סמים מובילי כולל ABCB1 ו ABCB5, ואילו FTC הוא ספציפי עבור ABCG2 6 , 19 . אם מצב SP של מדגם בודדים אינו ידוע, ולכן מומלץ להשתמש הן verapamil ו FTC בצינורות נפרדים.
4. מכתים
- שווי הן "הבדיקה" ו "בקרה" צינורות דגירה אותם על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 90 דקות, עם תסיסה עדינה כל 15 דקות. רוב שחול צבע בתאים SP תתרחש בתוך 45 דקות הראשונות, אבל הצטברות צבע בתאים שאינם SP (תרומה לפתרון) הוא רק מקסימלי אחרי 75-90 דקות 19 .
- לאחר מכתים מוחלטת, לשטוף את התאים 3-4 מ"ל קר כקרח PBS ו resuspend גלולה בנפח של 100 μL (PBS גם כן). שמור את התאים בחושך וצונן על הקרח, ולהמשיך מכתים של סמנים נוספים. לחלופין, ישירות לבצע זרימת cytometric אנהתְמוּגָה.
5. Costaining עבור סמנים אחרים
- הוסף פאנל הרצוי של נוגדנים fluorochrome מצומדות לתאים מוכתמים DCV, לערבב היטב דגירה התאים ב 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך 20-30 דקות. לשטוף את התאים 3 - 4 מ"ל קר כקרח PBS ולהמשיך אפליה תאים מתים.
הערה: פורמטים נוגדן כי הם בקלות תואם DCV ו כמעט אינם דורשים פיצוי כוללים PerCP או PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, אלקסה פלואור 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, אלקסה פלואור 750 ו BV786 . פורמטים התואמים DCV אבל עשויים לדרוש פיצוי כוללים FITC, אלקסה פלואור 488, PE ו BV650. פורמטים שאינם תואמים כמעט ל- DCV כוללים את BV421, V450 ו- V500. - הוסף 7-AAD (או PI) לתאים מוכתמים DCV בריכוז המומלץ על ידי היצרן בפרט דגירה הדגימות במשך 5-10 דקות בחושך. סינון דגימות דרך 70 מיקרומטר לחתוך את strainers ולהמשיך לזרום ניתוח cytometric.
6. זרימת ניתוח cytometric
הערה: מומלץ להחליף את המכשיר cytometric זרימה בהתאמה במהלך תהליך מכתים כבר אז הכל מוגדר ברגע הדגימות מוכנים. זה כולל גם נהלי תחזוקה סטנדרטיים כגון מעקב אחר ביצועי המערכת ומילוי מילוי טנקים.
- לרכוש את התאים על cytometer זרימת שער אותם על pivariate FSC / SSC מגרש נקודה (איור 1 ב). לא לכלול הכפילים אגרגטים על ידי השוואת אותות שונים של FSC ( כלומר גובה, רוחב, שטח) (איור 1 ג).
- אם סמן תא מת נכלל, שער על שבר התא קיימא ( למשל , 7-AAD- שלילי) ( איור 1D ). דמיינו את תאים סינגלט קיימא על מגרש div bivariate עבור "כחול" ו "אדום" DCV פליטה. לשם כך, להציג את ערוץ "כחול" הקרינה על ציר y ( למשל , 450/50) ואת "אדום "פלואורסצנטי על ציר x ( למשל , 525/50).
- החלף את שני ערוצים למצב ליניארי ולהתאים את המתח גלאי בהתאמה כך SP מאתר לצד החלקה ברביע השמאלי התחתון. לעומת זאת, הלא SP מאתר לרביע הימני העליון של העלילה המשקף את חלוקת מחזור התא (G1 ו- G2). שער SP ולהפסיק את הרכישה ( איור 1E ).
הערה: תאי DC מוגדרים על ידי DCV יכולים להיות מזוהים באמצעות מכשירים cytometric זרימה מצויד מקור לייזר עירור סגול ( כלומר 405 ננומטר קו לייזר). זה אחד ספציפי של ניתוח SP כי הקרינה הנפלטת נמדדת במצב ליניארי בשני ערוצים נפרדים המוצגים על מגרש div bivariate. הפליטה הכחולה של DCV נמדדת בכ - 450 ננומטר ( למשל , עם מסנן סטנדרטי של 450/40) והפליטה "האדומה" של DCV נמדדת בכ 510 - 585 ננומטר ( למשל , עם 510/50, 525/50 או מסנן 585/15) 19 . בשל הכימיה בפרט של assay, ההפרדה בין SP ו- SP שאינם תאים הוא בדרך כלל גבוה יותר בערוץ הקרינה "אדום" 19 .
- טען את השליטה עיכוב (ים) ולרכוש את הנתונים. תאים SP נעלמו עכשיו או מופחתים באופן משמעותי ( איור 1F ). במידת הצורך, לחדד את השער SP מבוסס על נתונים אלה.
- כדי לחקור את הביטוי סמן פני השטח על ידי תאים SP, לעזוב את הקרינה "אדום" של DCV על ציר ה- X ולהציג ערוץ פלואורסצנטי בהתאמה על ציר ה- y במצב לוגריתמי ( למשל , APC). התאם את המתח גלאי בהתאמה השער השער של כתמי SP מכתים חיובי עבור סמן שנחקר (ים) ( איור 1G ). ביטוי משותף של סמן מסוים על ידי תאים SP מניב אות בהתאמה ברביע השמאלי העליון של העלילה 30 .
- רשום אתנתונים ו / או מיון תאים SP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מסופק הוא ניתוח SP נציג של A2780 תאים, קו תאי סרטן השחלות האנושי בעבר הוכיח לנמל חשבונאות SP עבור פחות מ 1% של תאים 9 . התאים היו מתורבתים ב 37 מעלות צלזיוס ב RPMI 1640 בתוספת 10% ( v / v ) FBS, 2 מ"מ L- גלוטמין ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו שנקטפו ב confluency 85% באמצעות טיפול עם 0.05% טריפסין- EDTA. תאים נשטפו ב PBS ו מסוננים דרך 70 מיקרומטר לחתוך מסננים. ספירת התאים נקבע באמצעות תא ספירה מכתים כחול trypan ו 1 x 10 6 תאים / מ"ל (בינוני טרי) היו מוכתמים DCV 10 מיקרומטר במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. במקביל, aliquot של הודגר בנוכחות של 20 מיקרומטר FTC באותם תנאים בדיוק. תאים נשטפו 4 מ"ל PBS ו נוגדנים APC מצומדות נגד ABCG2 נוספה צינור "בדיקה" בריכוז מראש טיטרציה. אחרי האינקובטיעל 25 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, תאים נשטפו PBS, ו -7 AAD נוספה התווית תאים מתים. דוגמאות היו צוננים על קרח ונותחו על מכשיר FACS. האסטרטגיה gating מתואר פחות או יותר אוניברסלית חלים על דגימות אחרות למרות חומר הטרוגני מאוד כגון דגימות רקמות דגימות עשוי לדרוש מראש הגדרה של שבר התא היעד באמצעות סמני פני שטח ספציפיים ( למשל , EpCAM, CD45, CD31). התוצאות המוצגות נועדו לשמש התייחסות לזיהוי SP מבוסס DCV במעבדות אחרות. לפיכך, הלוקליזציות היחסיות של אוכלוסיות התאים הנחקרות צריכות להיות דומות למדי, אך בוודאי לא זהות, לאלה המתקבלות על ידי חוקרים אחרים עם דגימות ביולוגיות עצמאיות.
איור 1: זרימת עבודה ותוצאות נציג. (א) תרשים זרימה עיקרי לזיהוי SP באמצעות stainin DCVז. Costaining עבור סמנים נוספים היא אופציונלית, אבל אפליית תאים מתים מומלץ מאוד. ( BG ) נציג SP ניתוח של A2780 תאים סרטניים השחלות האדם שבוצעה על מכשיר FACS. תאים הם מגודרים על פי המאפיינים FSC / SSC (B) ו דבלטים ו אגרגטים אינם נכללים על ידי השוואת הפרמטרים השונים של FSC ( למשל , גובה ורוחב) ( ג ). לאחר מכן, תאים מתים מופלים על ידי gating על 7-AAD שלילית (או PI שלילי) שבר התא ( D ). תאים בודדים חיים מוצגים לאחר מכן על חלקה דו-כיוונית של נקודה דו-כיוונית עבור פליטת DCV כחולה ואדומה, ו- SP (וה- non-SP המקביל) נשלטים ( E ). ניתוח זה נעשה כעת עם שליטה עיכוב בהתאמה (במקרה זה FTC שימש), וזה צריך להוביל היעלמות כמעט מוחלטת של תאים בתוך השער SP ( F ). לבסוף, SP מזוהים יכול להיות מאופיין יותר, למשל , על ידי deteRamining את טרנספורטר התרופה ABC (ים) אשר עשוי להיות אחראי על שחול לצבוע ולכן מקנה את הפנוטיפ SP (במקרה זה ABCG2, בקנה אחד עם הרגישות FTC). ( ז ). FTC, fumitremorgin C; ALDH, dededrogenase אלדהיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההתקדמות בניהול הקליני של סרטן תלויה גם בפיתוח של שיטות טיפול המכוונות CSCs. שיטות המאפשר בידוד אמין של CSCs מ דגימות ביולוגיות יאיץ את הזיהוי של מטרות מתאימות ולכן הם בעלי חשיבות קריטית במאמץ זה. ניתוח SP היא טכניקה מבוססת הוקמה כדי לזהות אוכלוסיות CSC המבטאים ABC סוחרי סמים ויישום DCV הרחיב את תחולתו על תקן cytometric זרימת מכשירים. מבחינה מכנית, SP אפליה רותמת פעילה לצבוע פעיל על ידי מובילי סמים ABC לזהות CSCs מבוסס על הקרינה נמוכה כרוכה לוקליזציה אופייני בצד של החלק התחתון של המגרש נותר המקביל הלא SP. חשוב לציין, זיהוי DC מבוסס DCV הוא שיטה חזקה ופשוטה, עם הצעדים הקריטיים ביותר להיות (i) הכנת תאים (ii) תהליך מכתים (iii) הבחירה של inhib מתאיםJ ו (IV) ניתוח cytometric זרימה. בגלל שחול לצבוע הוא תהליך פעיל צריכת אנרגיה, זה רלוונטי במיוחד להתחיל עם כדאיות התא טוב; רק viable (התרופה transporter-expressing) תאים יכולים לייצר SP. יתר על כן, לעתים קרובות זה הגיוני כדי לייעל את היחס בין ריכוז צבע וצפיפות התא ובכך לשפר את ההפרדה של תאים SP (בתורו, זה דורש טיטרציה של שני DCV ותאים). כלל כללי הוא שגם ריכוז צבע גבוה יותר ותאי ריכוז תא נמוך יותר הפרדה משופרת 19 . המפתח לניסוי DCV מוצלח הוא האימות הפונקציונלי של ה- SP באמצעות מעכבים תרופתיים של פעילות הטרנספורטר של ABC. כפי שצוין קודם לכן, verapamil ו FTC הם בין המעכבים ביותר שהוקמו עבור ניתוח SP ויש להם תכונות המשאבה שונים (FTC הוא ספציפי עבור ABCG2, בעוד verapamil מעכב משאבות מספר). עבור דגימות עם מצב SP לא ידוע, ולכן מומלץ להשתמש בשנימעכבים בצינורות נפרדים. אופציה נוספת היא השימוש ב- PA-ABC טרנספורטר טרנספורטר מעכב reserpine 4 . עם זאת, החוקרים צריכים להיות מודעים לכך autofluorescence של המתחם הזה יכול להפריע אות DCV 19 . לאחר התאים מנותחים עבור פליטת DCV כחול ואדום, המתחים גלאי צריך להיות מותאם כך ששתי האוכלוסיות ( כלומר SP ו- non-SP) גלויים עם הפרדה מקסימלית. אם התמונה נראית מוזרה, קנה המידה הלוגריתמי עשוי להיות הסיבה לכך (במקרה זה, העבר את שני הערוצים חזרה למצב ליניארי).
חשוב גם לציין כי assay מבוססי DCV DC אינו ספציפי לסרטן ולא פותחה במקור עבור היישום באונקולוגיה. במקום זאת, היא ספציפית עבור ABC סמים מובילי ובכך גם מאפשר זיהוי ובידוד של תאי גזע פיזיולוגיים (רקמות), כגון שושלת - Sca-1 + c- ערכת +תאי גזע המטופויטים 25 . בנוסף, סוגי תאים מובחנים הקמת מחסומים ייעודיים באתרי הגוף חיוני יכול גם להציג SP מאפיינים 20 . יישום DCV מבוסס SP זיהוי לרקמות הראשוניות ולכן דורש אפליה ספציפית של האוכלוסייה היעד היעד באמצעות סמנים מתאימים.
לאור השימור הגבוה של משאבות זרימת התרופה בקרב אוכלוסיות CSC 9 , 23 , SPV מבוססי DC גילוי הוא יישום נרחב, עובדה זו באה לידי ביטוי גם על ידי שימוש מוצלח שלה על פני גופים סרטניים כולל גופים שונים של שכבת גרעין מקור 9 , 17 , 18 . יתרונות נוספים כוללים: (i) תאים עם השלכות ישירות בהתנגדות לתרופות מזוהים (חשוב במיוחד בהתמודדות עם תת תאים קליניים רלוונטיים קליני התיווך המחלה לחזורRence) וכי (ii) זיהוי של פונקציונלי, ולא סטטי, פרמטר עשוי להעניק יותר assay סגול ולשפר את ההחלטה 19 , 31 , 32 . מן הצד הרעיוני / טכנולוגי, זיהוי DC מבוסס DCV הוא בבירור נבדל כתמים פני השטח נוגדנים בתיווך: (i) מבנה היעד מראה לוקליזציה תאיים מייצג חומצה גרעין, לא חלבון. (2) assay מזהה פעילות חלבון, לא רק נוכחות או צפיפות. (ג) תאי המטרה מוגדרים מכוח פלואורסצנציה נמוכה, לא על ידי אות חיובי. (IV) כמו צבע מחייב DNA, DCV הוא רגיש אפילו וריאציות קלות ריכוז התא או צבע במהלך מכתים 19 . (V) הקרינה DCV נמדדת במצב ליניארי, לא logarithmically. (Vi) הקרינה DCV ( כלומר הקרינה שנוצר על ידי fluorophore יחיד) נמדדת בשני ערוצים נפרדים, nOt בטווח גל יחיד. למרות פרטים אלה, ניתוח DC מבוסס DCV קל לבצע ומן הסתם מרחיב את זרימת cytometric ארגז הכלים עבור מחקר CSC.
ניתוח מבוסס DCV מבוסס גם מציע אפשרויות רבות עבור costaining עבור סמנים אחרים, להיות תואם הן נוגדן קונבנציונאלי בתיווך stainings (פורמטים רבים אפשריים) ואת assay מסחרי גילוי פעילות אנזימטית ALDH. עם זאת, אנחנו כאן התמקדו מכתים פני השטח הקורא הוא התייחס לספרות שפורסם 4 כדי לראות פרטים מתודולוגיים על codetection של פעילות ALDH. בכל מקרה, DCV מופעלות SP ניתוח צריך להיות משולב עם אפליה התא המתים ריאגנטים ברור למטרה זו הם 7-AAD ו PI.
שים לב, תאים מוגדרים על ידי DC DC (ולא תאים שליטה SP) ניתן לחיות מטוהרים באמצעות יישום מיון של מכשירים cytometric זרימה המקביל. בגלל assay SP מזהה פונקציונלי הרשותRameter כי רק תאים קיימא יכול לייצר, את הכדאיות של תאים SP התאושש בדרך כלל צפוי להיות גבוה (לפעמים משוער 100%). עם זאת, ניתן לבדוק את הפרמטרים הטכניים השונים, כגון גודל הזרבובית, האופי של הסוכן החוצץ, והטמפרטורה בזמן המיון (באמצעות חריץ 70 מיקרומטר לא היו לנו בעיות עם אבל זרבובית גדולה יותר עשויה עדיין לעזור לתאים עדינים מאוד). התאים התאושש יכול להיות נתון לנתונים במורד הזרם כגון qRT-PCR, המערבי סופג פרופיל הביטוי הגלובלית ( למשל , באמצעות מערך גנים או את הטכנולוגיה האחרונה RNASeq). יתר על כן, תאים בודדים SP ניתן לחקור עבור תפקוד תאי גזע פונקציונליים ( למשל , clonogenicity תא בודד השתלת סדרתי), או תת תרבותית להקים שורות תאים של תאים מועשרים או אפילו טהור SP שיכול להיות יציב במשך חודשים 9 . בשלנובמחקר, השתמשנו בינוני רגיל קונבנציונאלי בקבוקי פלסטיק 2D לתת-תרבות DCV המוגדרים CSCs 9 , אבל גזע תאים סלקטיבי modalities כגון עגינה עצמאית / 3D תנאי תרבות התקשורת המקצועית גם יהיה ריאלי. אנו מציעים כי התנאים הטובים ביותר עבור הרחבה במבחנה של תא SP נתון צריך להיבדק על בסיס אישי.
לסיכום, אנו כאן לתאר את זרימת עבודה ניסיוני מפורט של זיהוי CSC / בידוד באמצעות ניתוח SPV מבוסס SPV. המאמר שלנו יסייע לחוקרי CSC ליישם וליישם שיטה שימושית זו במעבדות שלהם, אשר אמור לקדם את ההבהרה של אסטרטגיות טיפוליות נגד CSC לשיפור הניהול הקליני של סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר. כמו כן, אין כל מעורבות של המחבר בהכנת כתב היד.
Acknowledgments
Maximilian Boesch נתמך על ידי אחוות ארווין Schrödinger של קרן המדע האוסטרי FWF (מענק מספר J-3807).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
