Summary
Metoder, der muliggør karakterisering og isolering af stamcellepopulationer fra biologiske prøver, er kritiske for fremskridtet af stamcelle-målrettede behandlinger i kræft og videre. Her tilvejebringer vi en detaljeret protokol for kræft stamcelle isolation ved hjælp af den farve-udløst side befolkning fænotype.
Abstract
Kræft er en stamcelledrevet sygdom, og udryddelse af disse celler er blevet et stort terapeutisk mål. Dekryptere sårbarheder af kræftstamceller (CSC'er) og identificering af egnede molekylære mål er baseret på metoder, der tillader deres specifikke diskrimination i heterogene prøver, såsom cellelinier og ex vivo tumorvæv. Flowcytometri / FACS er en kraftfuld teknologi til multiparametrisk dissektering af biologiske prøver på enkeltcelleniveau, og til dato er den valgte metode til at genoprette levende celler til downstream-analyser. Overflademarkører som CD44 og CD133 samt påvisning af aldehyddehydrogenase-enzymatisk aktivitet er ofte blevet anvendt til at definere og sortere CSC'er fra tumorprøver af FACS. En komplementær tilgang, der er afbildet her i metodologiske detaljer, gør brug af funktionel farvestofekstrudering af ABC-lægemiddeltransportører, som identificerer en tydelig population af fluorescensdimceller, der almindeligvis betegnes som sidepopulation (SP). SPCancerceller udviser kanoniske stamcelleegenskaber og kan ophæves og funktionelt bekræftes ved anvendelse af midler, der hæmmer farvestrålende ekstruderende lægemiddeltransportør (oftest ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 og ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Desuden er SP-assayet kompatibelt med andre flowcytometriske evalueringer, såsom farvning af overfladeantigener, aldehyddehydrogenase-detektion og dødcelleforskelsbehandling ( f.eks . Med 7-AAD eller propidiumiodid (PI)). Således beskriver vi en værdifuld og bredt anvendelig metode til CSC-identifikation, isolering og underkarakterisering mekanisk baseret på en funktionel, snarere end en fænotypisk parameter. Selvom det oprindeligt blev udført med Hoechst 33342 som udløsende farvestof, fokuserer vi her på den nyere Violet-farvestofbaserede SP-fænotype, der kan løses på ethvert flowcytometer udstyret med en violet laser kilde.
Introduction
Virkningen af primære kræftterapier er forbedret væsentligt i løbet af det sidste årti på grund af overbevisende fremskridt inden for den genetiske og molekylære forståelse af sygdommen og fremkomsten af målrettede lægemidler, såsom terapeutiske antistoffer og små molekylinhibitorer. I modsætning hertil er metastatisk og tilbagevendende sygdom stadig typisk uhelbredelig, og morbiditet og dødelighed forbliver høje i disse kliniske indstillinger. CSC'er repræsenterer en særskilt subpopulation inden for tumorer og er udstyret med kanoniske stamcelleegenskaber, såsom klonogenicitet / tumoregenicitet, multilægemiddelresistens og asymmetrisk celledeling 1 , 2 . CSC'er driver således ikke kun metastatisk progression og tumor heterogenitet, men vedvarer også under behandling for at predisponere patienten for at komme tilbage. Terapeutisk CSC-eliminering er derfor et vigtigt medicinsk behov for at forhindre sygdomstilfælde og tillade langvarig kurbehandling af kræft 3
Identifikation af sårbarheder og belysning af strategier til udryddelse af CSC'er er stærkt afhængig af metoder, der gør det muligt at rense dem fra biologiske prøver til efterfølgende ekspressionsprofilering og / eller funktionel undersøgelse. Til gengæld er sådanne metoder afhængige af overflade-, intracellulære eller funktionelle markører, der er specifikke for disse celler. CSC-specifikke overflademarkører indbefatter, men er ikke begrænset til, CD44, CD133, CD24 og CD90 og er blevet anvendt til at identificere CSC-populationer i en række tumor-enheder, herunder brystkræft og tykktarmscancer 4 . En anden markør, aldehyddehydrogenase (ALDH), viser intracellulær lokalisering og kan påvises funktionelt, hvilket tilvejebringer et respektivt substrat, hvis enzymatiske omdannelse giver lys. Ved hjælp af denne test er CSC-populationer også blevet identificeret i forskellige tumor-enheder 5 . En komplementær metode, der almindeligvis omtales som SP-analyse og afbildet her i m Etodologisk detaljer, udnytter aktivt farvestof udstrømning af ABC lægemiddeltransportører for at identificere små populationer af fluorescensdæmpede stamlignende celler 6 , 7 , 8 . For at opnå dette inkuberes en given prøve i nærværelse af et lipofilt DNA-bindende fluorophore, der kommer ind i alle celler gennem passiv diffusion og målretter atom- og mitokondrielt DNA til binding. Ikke-CSC'er uden ABC-lægemiddeltransportudtryk akkumulerer farvestoffet, hvilket resulterer i lys fluorescens, medens CSC'er ekstruderer farvestoffet aktivt, der reducerer fluorescens. Farmakologisk inhibering af lægemiddeltransportaktivitet ophæver og funktionelt bekræfter SP-fænotypen og bør anvendes til kontrolformål. CSC-populationer, der udviser SP-egenskaber, er blevet beskrevet blandt andet i ovariecancer 9 , 10 , prostatacancer 11 ,> 12, brystcancer 13 , lungekræft 14 , endometriecancer 15 , gliom 16 , 17 og knoglesarkom 18 . Det er vigtigt, at SP-analysen er kompatibel med både kræftcellelinier og primært tumorvæv, selv om primærmateriale udgør yderligere udfordringer, såsom kravet om en specifik tumorcelleforskelsestrategi (visse værtscellepopulationer kan også udvise SP-egenskaber) 19 , 20 .
De to mest etablerede SP-overførende lægemiddeltransportører er ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 og ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Andre lægemiddeltransportører kan imidlertid også være en molekylær determinant for SP-fænotypen ( f.eks . ABCB5) 22 . ABCB1Kan effektivt blokeres med verapamil, mens aktiviteten af ABCG2 kan ophæves specifikt med fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . En særlig styrke i SP-analyse er, at den kan kombineres med andre farvninger ( fx overflademarkører og ALDH), og at det gør det muligt at genoprette levende celle således at være kompatibel med downstream funktionelle undersøgelser. Desuden er SP-detektering bredt anvendelig på grund af den høje bevarelse af ABC-lægemiddeltransportører blandt CSC-populationer 9 , 23 .
Oprindeligt er SP-detektion blevet udført ved anvendelse af Hoechst 33342 som et udløsende farvestof 24 . Dette farvestof opnår fremragende opløsning, men kræver ultraviolet laser excitation; Derfor er dets anvendelighed naturligt begrænset til high-end flowcytometriske instrumenter. Adventen af DyeCycle Violet (DCV) 25 har åbnet ny avenuEs til SP analyse og udvidede anvendeligheden af denne metode til standard flowcytometriske instrumenter, der mangler en ultraviolet laser kilde (en violet laser kilde er tilstrækkelig til at løse DCV-SP celler). Det er vigtigt, at Hoechst 33342 og DCV deler fælles pumpespecifikationer, hvilket indikerer, at enten farvestoffer skal identificere de samme cellepopulationer.
Her giver vi en detaljeret forsøgsprotokol af DCV-baseret SP-analyse til hurtig og nem reproduktion i uafhængige laboratorier. Vi opfatter således vores artikel som en ressource for CSC-forskere, der skal bidrage til optimering og standardisering af denne nyttige cellebiologiske metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er i fuld overensstemmelse med standardinstitutionelle retningslinjer for etisk review. Hvis menneske- eller dyrevæv undersøges ved hjælp af den her beskrevne protokol, er forskerne forpligtet til at få godkendelse fra den relevante revisionskort i deres institution eller land.
Forsigtig: Standard forholdsregler for sikker håndtering af biologiske prøver gælder for denne protokol. Dette omfatter iført handsker og et lab coat, og udfører arbejdet under et biosikkerhedsskab, når det er muligt.
1. Fremstilling af celler
- Cancercellelinjer
- Kultur en respektiv human eller murin cancercellelinie ved 37 ° C i 10-30 ml egnet medium ( f.eks . RPMI 1640 suppleret med 10% ( vol / vol ) FBS, 2 mM L-glutamin og 1x penicillin / streptomycin) og høst Cellerne ved subkonfluens ( dvs. 70-90%) ved anvendelse af fordøjelse med 0,05% trypsin-EDTA eller nogle andre de-attAchment procedure. Bestem celleantalet og kontroller for levedygtighed ved brug af et tællekammer og trypanblåt farvning. Fraktionen af levedygtige celler skal overstige 85%.
BEMÆRK: Eksempler på humane cancercellelinjer med SP-rum omfatter MCF7 / HTB-22 og SKBR3 / HTB-30 (brystkræft), A2780 og SKOV-3 / HTB-77 (ovariecancer) og A549 (lungekræft) 26 .
- Kultur en respektiv human eller murin cancercellelinie ved 37 ° C i 10-30 ml egnet medium ( f.eks . RPMI 1640 suppleret med 10% ( vol / vol ) FBS, 2 mM L-glutamin og 1x penicillin / streptomycin) og høst Cellerne ved subkonfluens ( dvs. 70-90%) ved anvendelse af fordøjelse med 0,05% trypsin-EDTA eller nogle andre de-attAchment procedure. Bestem celleantalet og kontroller for levedygtighed ved brug af et tællekammer og trypanblåt farvning. Fraktionen af levedygtige celler skal overstige 85%.
- Ex vivo tumorvæv
- Tag en frisk kirurgisk tumorprøve eller alternativt høst tumorvæv fra en transplanterbar eller genetisk manipuleret mustumormodel. Tag 200-1.000 mg væv og generere en enkeltcellesuspension ved mekanisk disaggregering ( f.eks. Ved anvendelse af en saks eller en skalpel) og enzymatisk fordøjelse ( f.eks. Ved anvendelse af en collagenase / dispase / DNase-cocktail).
- Filtrer prøven gennem en 70 μm cut-off filter. Bestem celleantalet og kontroller for levedygtighed ved hjælp af et tællekammer og trypan blUe farvning.
BEMÆRK: Digestion cocktails indeholder ofte 200 μg / ml collagenase P, 0,8 U / ml dispase og 25 μg / ml DNase I, og inkubationstider ligger typisk fra 20-50 min. Ideelt set udføres vævsopdeling i overensstemmelse med en protokol optimeret for vævet under undersøgelse 27 , 28 og 29 .
2. Testprøver
- Juster cellekoncentrationen til 1 x 106 celler / ml i frisk dyrkningsmedium (et næringsholdigt vehikel er vigtigt, da farveekstrudering er en aktiv energiforbrugende proces). Endelig overfør 1 ml prøve til et almindeligt flowcytometri / FACS rundbundet rør (mærket 'test').
BEMÆRK: For optimale resultater kan det være nødvendigt at cellekoncentrationen titreres (fx 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 celler / ml), men en lavere cellekoncentration genereltLy giver en højere opløsning 19 . Kun til sortering af applikationer, hvor maksimalt antal SP-celler skal udvindes, anbefales det at øge cellekoncentrationen op til 1 x 107 celler / ml. - Tilsæt 10 μM DCV til prøven og bland godt, enten ved forsigtig vortexing eller resuspendering i 3-5x. Fortsæt til inhiberingskontrol.
BEMÆRK: Optimale resultater kan afhænge af titrering af det udløsende farvestof (fx 2,5; 5; 10; 20 μM), men en højere farvestofkoncentration giver generelt en højere opløsning 19 .
3. Inhiberingskontrol
- Overfør 250 μL af den farvestofholdige celle suspension til et nyt flowcytometri / FACS rundbundet rør (mærket 'kontrol'). Tilsæt 50 μM verapamil eller 20 μM FTC og bland godt ved pipettering.
BEMÆRK: Verapamil og FTC er de mest veletablerede hæmmere til SP analyse, men har forskellige effluxpumpespecifikkeY: Verapamil hæmmer adskillige ABC-lægemiddeltransportører, herunder ABCB1 og ABCB5, mens FTC er specifik for ABCG2 6 , 19 . Hvis SP-status for en individuel prøve er ukendt, anbefales det derfor at anvende både verapamil og FTC i separate rør.
4. Farvning
- Hæt både test- og kontrolrørene og inkubér dem ved 37 ° C i mørke i 90 minutter med forsigtig omrøring hvert 15. minut. Størstedelen af farvestoffekstrudering i SP-celler vil forekomme inden for de første 45 minutter, men farvestofakkumulering i ikke-SP-celler (bidrager til opløsning) er kun maksimal efter 75-90 min. 19 .
- Efter farvning er færdig, vask cellerne i 3-4 ml iskold PBS og resuspender pelleten i et volumen på 100 μl (også PBS). Hold cellerne i mørke og kølet på is, og fortsæt til farvning af yderligere markører. Alternativt udfører direkte flowcytometrisk analysis.
5. Costaining for andre markører
- Tilsæt et ønsket panel af fluorochrom-konjugerede antistoffer mod de DCV-farvede celler, bland godt og inkuber cellerne ved 4 ° C i mørke i 20-30 minutter. Vask cellerne i 3-4 ml iskold PBS og fortsæt til dødcelleforskelsbehandling.
BEMÆRK: Antistofformater, der er let kompatible med DCV og stort set ikke kræver kompensation, omfatter PerCP eller PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 og BV786 . Formater, der er kompatible med DCV, men som kan kræve kompensation, omfatter FITC, Alexa Fluor 488, PE og BV650. Formater, der næsten ikke er kompatible med DCV, omfatter BV421, V450 og V500. - Tilsæt 7-AAD (eller PI) til DCV-farvede celler ved den koncentration, som den pågældende producent anbefaler, og inkuber prøverne i 5 - 10 minutter i mørke. Filtrer prøverne gennem 70 μm afskæringsspoler og fortsæt til flowcytometrisk analyse.
6. Flowcytometrisk analyse
BEMÆRK: Det anbefales at tænde det respektive flowcytometriske instrument under farvningsprocessen, så alting er indstillet, så snart prøverne er klar. Dette omfatter også standardvedligeholdelsesprocedurer, såsom systempræstationssporing og tankpåfyldning.
- Køb cellerne på flowcytometeret og indlæs dem på et bivariat FSC / SSC punktpunkt (Figur 1B). Undgå dubletter og aggregater ved at sammenligne de forskellige signaler fra FSC ( dvs. højde, bredde, areal) (figur 1C).
- Hvis en døde celle markør er inkluderet, gate på den levedygtige cellefraktion ( fx 7-AAD-negativ) ( Figur 1D ). Visualiser de levedygtige singletceller på et bivariat punktpunkt for 'blå' og 'rød' DCV-emission. Til dette formål skal du vise den "blå" fluorescenskanal på y-aksen ( f.eks . 450/50) og 'Rød 'fluorescenskanal på x-aksen ( f.eks . 525/50).
- Skift begge kanaler til lineær tilstand og juster detektorspændingerne tilsvarende, så SP'en lokaliserer til siden af plottet i den nedre venstre kvadrant. Omvendt lokaliserer non-SP'en til den øverste højre kvadrant af plottet, der afspejler cellecyklusfordelingen (G1 og G2). Port SP og stop købet ( Figur 1E ).
BEMÆRK: DCV-definerede SP-celler kan detekteres ved hjælp af flowcytometriske instrumenter udstyret med en violet laser excitationskilde ( dvs. en 405 nm laserlinie). Det er en specifik af SP-analyse, at den udsendte fluorescens måles i lineær tilstand og i to separate kanaler, der vises på en bivariate punktplot. Den "blå" emission af DCV måles ved ca. 450 nm ( f.eks . Med et 450/40 standardfilter) og den "røde" emission af DCV måles til ca. 510 - 585 nm ( f.eks . Med en 510/50, en 525/50 eller 585/15 filter) 19 . På grund af den specifikke kemi af analysen er separationen mellem SP og ikke-SP-celler generelt højere i den "røde" fluorescenskanal 19 .
- Indlæs inhiberingskontrollen (erne) og hent dataene. SP-cellerne er nu forsvundet eller reduceres væsentligt ( figur 1F ). Om nødvendigt skal du afgrense SP-porten ud fra disse data.
- For at undersøge overflademarkertekspression ved hjælp af SP-celler, skal du efterlade den "røde" fluorescens af DCV på x-aksen og vise en respektive fluorescenskanal på y-aksen i logaritmisk tilstand ( f.eks . APC). Juster detektorspændingerne tilsvarende, og gate brøkdelen af SP-celler farvning positivt for den undersøgte markør (r) ( Figur 1G ). Co-ekspression af en bestemt markør ved hjælp af SP-celler giver et respektivt signal i den øvre venstre kvadrant af plottet 30 .
- Optag denData og / eller sortere SP cellerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forudsat er en repræsentativ SP-analyse af A2780-celler, en human ovariecancercellelinie, der tidligere har vist sig at bære en SP, der regner for mindre end 1% af cellerne 9 . Celler blev dyrket ved 37 ° C i RPMI 1640 suppleret med 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-glutamin og 1x penicillin / streptomycin og høstet ved 85% konfluens ved anvendelse af behandling med 0,05% trypsin-EDTA. Celler blev vasket i PBS og filtreret gennem 70 μm afskårne afstrygere. Celleantalet blev bestemt under anvendelse af et tællekammer og trypanblåt farvning og 1 x 106 celler / ml (frisk medium) blev farvet med 10 μM DCV i 90 minutter ved 37 ° C i mørke. Parallelt inkuberedes en portion deraf i nærværelse af 20 μM FTC under nøjagtigt de samme betingelser. Celler blev vasket i 4 ml PBS, og et APC-konjugeret antistof mod ABCG2 blev tilsat til "test" -røret ved en præ-titreret koncentration. Efter inkubatiPå i 25 minutter ved 4 ° C blev cellerne vasket i PBS, og 7-AAD blev tilsat til mærkning af døde celler. Prøver blev afkølet på is og analyseret på et FACS instrument. Den afbildede gatingstrategi er mere eller mindre universelt anvendelig for andre prøver, selvom meget heterogent materiale, såsom prøver fra vævsprøver, muligvis kræver foruddefinition af målcellefraktionen ved anvendelse af specifikke overflademarkører ( f.eks . EpCAM, CD45, CD31). De viste resultater er beregnet til at fungere som reference for DCV-baseret SP-detektion i andre laboratorier. Derfor bør de relative lokaliseringer af de undersøgte cellepopulationer være omtrent sammenlignelige, men sikkert ikke identiske med dem, der opnås af andre forskere med uafhængige biologiske prøver.
Figur 1: Workflow og repræsentative resultater. (A) Hoveddiagram for SP-detektion ved anvendelse af DCV-farveg. Costaining for yderligere markører er valgfrit, men dødcelle diskrimination anbefales stærkt. ( BG ) Repræsentativ SP analyse af A2780 humane ovariecancerceller udført på et FACS instrument. Celler er lukket i henhold til FSC / SSC karakteristika (B) og dubletter og aggregater udelukket ved at sammenligne de forskellige parametre i FSC ( f.eks . Højde og bredde) ( C ). Derefter diskrimineres døde celler ved at gating på den 7-AAD-negative (eller PI-negative) cellefraktion ( D ). Levende enkeltceller vises derefter på en lineær bivariat punktplot til blå og rød DCV-emission, og SP (og den tilsvarende ikke-SP) er indhegnet ( E ). Den samme analyse gøres nu med en respektiv inhiberingskontrol (i dette tilfælde blev FTC brugt), og dette bør føre til næsten fuldstændig forsvinden af celler i SP-porten ( F ). Endelig kan den identificerede SP karakteriseres nærmere, f.eks . Ved deteRmining den ABC-lægemiddeltransportør (r), der kan være ansvarlig for farveekstrudering, og dermed overdrage SP-fænotypen (i dette tilfælde ABCG2, i overensstemmelse med FTC-følsomheden). ( G ). FTC, fumitremorgin C; ALDH, aldehyd dehydrogenase. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremskridt i den kliniske styring af kræft afhænger også af udviklingen af behandlingsmodaliteter, der målretter mod CSC'er. Metoder, der tillader pålidelig isolering af CSC'er fra biologiske prøver, vil fremskynde identificeringen af egnede mål og er derfor af afgørende betydning i denne bestræbelse. SP-analyse er en etableret og værdifuld teknik til at identificere CSC-populationer, der udtrykker ABC-lægemiddeltransportører, og implementeringen af DCV har udvidet dets anvendelighed til standard flowcytometriske instrumenter. Mekanisk udnytter SP-diskrimination aktivt farvestof udstrømning af ABC-lægemiddeltransportører til at detektere CSC'er baseret på lav fluorescens, hvilket medfører en karakteristisk lokalisering ved siden af plotbunden til venstre for den tilsvarende ikke-SP. Det er vigtigt, at DCV-baseret SP-detektion er en robust og ligetil metode, hvor de mest kritiske trin er (i) fremstilling af celler (ii) farvningsprocessen (iii) udvælgelsen af en passende inhibitorItor og (iv) flowcytometrisk analyse. Fordi farve ekstrudering er en aktiv energiforbrugende proces, er det særligt relevant at starte med en god celle levedygtighed; Kun levedygtige (lægemiddeltransporter-udtrykkende) celler kan producere en SP. Desuden er det ofte hensigtsmæssigt at optimere forholdet mellem farvestofkoncentration og celletæthed og derved forøge separationen af SP-celler (dette kræver igen titrering af både DCV og celler). En generel regel er, at både en højere farvestofkoncentration og en lavere cellekoncentration resulterer i forbedret adskillelse 19 . Nøglen til et succesfuldt DCV-eksperiment er den funktionelle validering af SP ved anvendelse af farmakologiske hæmmere af ABC-lægemiddeltransportaktivitet. Som tidligere nævnt er verapamil og FTC blandt de mest etablerede hæmmere til SP-analyse og har forskellige pumpespecificiteter (FTC er specifik for ABCG2, mens verapamil hæmmer adskillige pumper). For prøver med ukendt SP-status anbefales det derfor at bruge beggeInhibitorer i separate rør. En anden mulighed er brugen af pan-ABC-lægemiddeltransporter inhibitor reserpin 4 . Forskerne bør imidlertid være opmærksomme på, at autofluorescens af denne forbindelse potentielt kan interferere med DCV-signalet 19 . Når cellerne er analyseret for blå og rød DCV-emission, skal detektorspændingen justeres, således at begge populationer ( dvs. SP og ikke-SP) er synlige med maksimal adskillelse. Hvis billedet ser mærkeligt ud, kan logaritmisk skalering være årsagen til (i dette tilfælde skifte begge kanaler tilbage til lineær tilstand).
Det er også vigtigt at bemærke, at det DCV-baserede SP-assay hverken er specifikt for kræft eller det oprindeligt er udviklet til anvendelse på onkologi. I stedet er det specifikt for ABC-lægemiddeltransportører, og det letter også detektion og isolering af fysiologiske (væv) stamceller, såsom lineage - Sca-1 + c-kit +Hæmatopoietiske stamceller 25 . Derudover kan differentierede celletyper, der etablerer dedikerede barrierer på afgørende kropssider, også udvise SP karakteristika 20 . Anvendelse af DCV-baseret SP-detektion til primære væv kræver derfor specifik diskrimination af målcellepopulationen ved anvendelse af egnede markører.
I lyset af den høje bevarelse af lægemiddeludstrømningspumper blandt CSC-populationer 9 , 23 er DCV-baseret SP-detektering bredt anvendelig, en kendsgerning, der også er eksemplificeret ved dens succesfulde anvendelse på tværs af tumor-enheder, der indbefatter enheder med forskellig kimlags-oprindelse 9 , 17 , 18 . Andre fordele indbefatter, at (i) celler med direkte implikationer i lægemiddelresistens er identificeret (især vigtig for håndtering af klinisk relevante cancercelleundergrupper medierende sygdomsreaktionRence) og at (ii) detekteringen af en funktionel, snarere end en statisk parameter kunne give mere analysespecificitet og forbedre opløsningen 19 , 31 , 32 . Fra den konceptuelle / teknologiske side er DCV-baseret SP-detektion klart adskilt fra antistofmedierede overfladefarvninger: (i) Målstrukturen viser intracellulær lokalisering og repræsenterer nukleinsyre, ikke protein. (Ii) Assayet detekterer proteinaktivitet, ikke blot nærvær eller tæthed. (Iii) Målcellerne er defineret på grund af lav fluorescens, ikke ved et positivt signal. (Iv) DCV er som et DNA-bindende farvestof følsomt for selv små variationer i celle- eller farvestofkoncentrationen under farvning 19 . (V) DCV-fluorescens måles i lineær tilstand, ikke logaritmisk. (Vi) DCV-fluorescens ( dvs. fluorescensen genereret af en enkelt fluorofor) måles i to separate kanaler, nOt i et enkelt bølgelængdeområde. På trods af disse specifikationer er DCV-baseret SP-analyse nem at udføre og udvider åbenbart den flowcytometriske værktøjskasse til CSC-forskning.
DCV-baseret SP-analyse tilbyder også mange muligheder for costaining for andre markører, idet de er kompatible med både konventionelle antistofmedierede overfladefarvninger (talrige formater mulige) og det kommercielle assay, som detekterer ALDH-enzymatisk aktivitet. Men vi fokuserede her på overfladens farvning, og læseren henvises til offentliggjort litteratur 4 for at se metodologiske detaljer om kodning af ALDH-aktivitet. Under alle omstændigheder bør DCV-udløst SP-analyse kombineres med dødcelleforskelsbehandling, og indlysende reagenser til dette formål er 7-AAD og PI.
Bemærk, at DCV-definerede SP-celler (og ikke-SP-kontrolceller) kan renses live ved anvendelse af sorteringsapplikationen af tilsvarende flowcytometriske instrumenter. Fordi SP-analysen registrerer en funktionel paRameter, som kun levedygtige celler kan producere, kan levedygtigheden af de genvundne SP-celler generelt forventes at være høje (undertiden ca. 100%). Hvis der skulle være problemer med post-sort-levedygtighed, kan forskellige tekniske parametre dog kontrolleres, såsom sorteringsdyseens størrelse, buffermiddelets karakter og temperaturen under sorteringen (ved hjælp af en 70 μm dyse har vi aldrig haft problemer med Levedygtighed, men en større dyse kan stadig hjælpe til meget sarte celler). De genvundne celler kan underkastes nedstrømsanalyser, såsom qRT-PCR, Western blotting og global ekspressionsprofilering ( f.eks. Ved anvendelse af genarray eller den nyere RNASeq-teknologi). Desuden kan isolerede SP-celler undersøges for funktionelle stamcelleegenskaber ( fx enkeltcelleklonogenicitet og serietransplantation) eller subkultiveres for at etablere cellelinjer af berigede eller endda rene SP-celler, der kan være stabile i måneder 9 . I voresUndersøgelse brugte vi normale mellemstore og konventionelle 2D plastikflasker til subkultur DCV-definerede CSC'er 9 , men stamcelle-selektive modaliteter som forankringsafhængige / 3D-kulturbetingelser og specialiserede medier vil også være mulige. Vi foreslår, at de mest gunstige betingelser for in vitro ekspansion af et givet SP-rum skal kontrolleres individuelt.
Sammenfattende beskriver vi her den detaljerede eksperimentelle arbejdsgang for CSC-identifikation / isolering ved hjælp af DCV-baseret SP-analyse. Vores papir skal hjælpe CSC-forskere til at gennemføre og etablere denne nyttige metode i deres egne laboratorier, som yderligere bør fremme belysningen af terapeutiske anti-CSC-strategier til forbedret klinisk styring af kræft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære. Der er også ingen involvering i forfatteren i udarbejdelsen af manuskriptet.
Acknowledgments
Maximilian Boesch støttes af Erwin Schrödinger Fellowship i den østrigske videnskabelige fond FWF (bevillingsnummer J-3807).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
