Summary
Métodos que permitem a caracterização e isolamento de populações de células estaminais a partir de amostras biológicas são fundamentais para o avanço de células-tronco-alvo tratamentos em câncer e além. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de células estaminais do câncer usando o fenótipo de população lateral desencadeada por corante.
Abstract
O câncer é uma doença causada por células-tronco e a erradicação dessas células tornou-se um importante objetivo terapêutico. A decifração de vulnerabilidades de Células-Tronco de Câncer (CSCs) e a identificação de alvos moleculares adequados baseiam-se em métodos que permitem a sua discriminação específica em amostras heterogéneas, tais como linhas celulares e tecido tumoral ex vivo . Citometria de fluxo / FACS é uma tecnologia poderosa para multi-parametricamente dissecar amostras biológicas no nível de célula única e é até à data o método de escolha para recuperar células vivas para análises a jusante. Os marcadores de superfície tais como CD44 e CD133, bem como a detecção de actividade enzimática de aldeído desidrogenase, têm sido frequentemente utilizados para definir e separar CSCs de amostras de tumor por FACS. Uma abordagem complementar, aqui descrita em detalhe metodológico, utiliza a extrusão de corante funcional por transportadores de fármacos ABC, que identifica uma população distinta de células fluorescentes-dim vulgarmente designadas por população lateral (SP). SP, As células de cancro exibem características de células estaminais canónicas e podem ser anuladas e confirmadas funcionalmente utilizando agentes que inibem o transportador de fármaco de extrusão de corantes (mais frequentemente ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Além disso, o ensaio SP é compatível com outras avaliações de citometria de fluxo, tais como coloração de antigénios de superfície, detecção de aldeído desidrogenase e discriminação de células mortas ( por exemplo , com 7-AAD ou iodeto de propídio (PI)). Assim, descrevemos um método valioso e amplamente aplicável para identificação, isolamento e sub-caracterização de CSC mecanisticamente baseado em um parâmetro funcional, e não fenotípico. Embora inicialmente realizado com Hoechst 33342 como corante desencadeante, aqui focalizamos o mais recente Violeta corante baseada em fenótipo SP que é resolvível em qualquer citómetro de fluxo equipado com uma fonte de laser violeta.
Introduction
A eficácia das terapias primárias contra o cancro melhorou substancialmente durante a última década devido aos avanços convincentes na compreensão genética e molecular da doença e ao advento de fármacos direccionados tais como anticorpos terapêuticos e inibidores de moléculas pequenas. Em contraste, a doença metastática e recorrente ainda é tipicamente incurável, ea morbidade e mortalidade permanecem altas nestes cenários clínicos. As CSCs representam uma subpopulação distinta dentro dos tumores e são dotadas de propriedades de células estaminais canónicas tais como clonogenicidade / tumorigenicidade, resistência a múltiplos fármacos e divisão celular assimétrica 1 , 2 . Assim, as CSCs não apenas conduzem à progressão metastática e à heterogeneidade tumoral, mas também persistem durante o tratamento para predispor o paciente a recaída. Terapêutica CSC eliminação é, portanto, uma importante necessidade médica para prevenir a recorrência da doença e permitir a longo prazo cura do câncer 3
A identificação de vulnerabilidades e elucidação de estratégias para erradicar CSC depende fortemente de métodos que permitam a sua purificação a partir de amostras biológicas para posterior perfil de expressão e / ou investigação funcional. Por sua vez, tais métodos dependem de marcadores de superfície, intracelulares ou funcionais que são específicos para estas células. Os marcadores de superfície específicos para CSC incluem, mas não estão limitados a, CD44, CD133, CD24 e CD90 e foram utilizados para identificar populações de CSC numa variedade de entidades tumorais incluindo cancro da mama e cancro do cólon 4 . Outro marcador, a aldeído desidrogenase (ALDH), apresenta localização intracelular e pode ser detectado funcionalmente proporcionando um substrato respectivo cuja conversão enzimática produz luz. Utilizando este teste, as populações CSC foram também identificadas em diversas entidades tumorais 5 . Um método complementar, comumente referido como análise SP e retratado aqui em m Detalhe etodológico, aproveita o efluxo de corante ativo por transportadores de droga ABC para identificar pequenas populações de células fluorescentes dim-stem-like 6 , 7 , 8 . Para conseguir isto, uma determinada amostra é incubada na presença de um fluoróforo de ligação ao ADN lipófilo que penetra em todas as células através de difusão passiva e alveja ADN nuclear e mitocondrial para ligação. Os não-CSCs desprovidos de expressão de transportador de droga ABC acumulam o corante resultando em fluorescência brilhante, ao passo que os CSCs extrudem activamente o corante que reduz a fluorescência. A inibi�o farmacol�ica da actividade do transportador de f�maco anula e confirma funcionalmente o fen�ipo de SP e deve ser utilizada para fins de controlo. As populações de CSC que exibem características de SP foram reveladas, entre outras, no cancro do ovário 9 , 10 , cancro da próstata 11 ,> 12, cancro da mama 13 , cancro do pulmão 14 , cancro endometrial 15 , glioma 16 , 17 e sarcoma ósseo 18 . Importante, o ensaio de SP é compatível com ambas as linhas celulares de cancro e tecido de tumor primário, embora o material primário apresente desafios adicionais tais como a exigência de uma estratégia de discriminação de células tumorais específicas (certas populações de células hospedeiras também podem exibir características de SP) 19 , 20 .
Os dois transportadores de fármaco que conferem SP mais estabelecidos são ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; No entanto, outros transportadores de droga podem ser um determinante molecular do fenótipo SP também ( por exemplo , ABCB5) 22 . ABCB1Pode ser eficazmente bloqueada com verapamil enquanto que a actividade de ABCG2 pode ser especificamente revogada com fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . Uma força particular da análise de SP é que ela pode ser combinada com outras colorações ( por exemplo , marcadores de superfície e ALDH) e que permite a recuperação de células vivas sendo assim compatível com investigações funcionais a jusante. Além disso, a detecção de SP é amplamente aplicável devido à alta conservação de transportadores de droga ABC entre as populações CSC 9 , 23 .
Originalmente, a detec�o SP foi realizada utilizando Hoechst 33342 como um corante desencadeante 24 . Este corante atinge uma resolução excelente, mas requer a excitação do laser ultravioleta; Daí a sua aplicabilidade é naturalmente limitada a instrumentos de citometria de fluxo high-end. O advento do DyeCycle Violet (DCV) 25 abriu nova avenidaEs para análise de SP e estendeu a aplicabilidade deste método aos instrumentos de citometria de fluxo padrão sem fonte de laser ultravioleta (uma fonte de laser violeta é suficiente para resolver as células DCV-SP). Importante, Hoechst 33342 e DCV compartilham especificidades de bomba comuns, indicando que qualquer corante deve identificar as mesmas populações de células.
Aqui, fornecemos um protocolo experimental detalhado de análise de SP baseada em DCV para reprodução rápida e fácil em laboratórios independentes. Assim, percebemos nosso artigo como um recurso para os pesquisadores da CSC que deve contribuir para a otimização e padronização deste útil método biológico-celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo está em total conformidade com as diretrizes padrão do Conselho Institucional de Revisão Ética. Se o tecido humano ou animal for investigado usando o protocolo descrito aqui, os pesquisadores são obrigados a ter aprovação do conselho de revisão relevante de sua instituição ou país.
Cuidado: As precauções padrão para o manuseio seguro de amostras biológicas aplicam-se a este protocolo. Isso inclui usar luvas e um jaleco, e realizar o trabalho sob um gabinete de biossegurança sempre que possível.
1. Preparação de Células
- Linhas de células cancerosas
- Cultura de uma respectiva linha celular de cancro humana ou murina a 37 ° C em 10-30 mL de meio apropriado ( por exemplo , RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM e penicilina / estreptomicina 1x) e colheita As células em sub-confluência ( ie 70-90%) usando digestão com tripsina-EDTA a 0,05% ou algum outro de-attProcedimento. Determine a contagem de células e verifique a viabilidade usando uma câmara de contagem e coloração com azul de tripano. A fracção de células viáveis deve exceder 85%.
NOTA: Exemplos de linhas celulares de cancro humanas que abrigam compartimentos SP incluem MCF7 / HTB-22 e SKBR3 / HTB-30 (cancro da mama), A2780 e SKOV-3 / HTB-77 (cancro do ovário) e A549 (cancro do pulmão) 26 .
- Cultura de uma respectiva linha celular de cancro humana ou murina a 37 ° C em 10-30 mL de meio apropriado ( por exemplo , RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM e penicilina / estreptomicina 1x) e colheita As células em sub-confluência ( ie 70-90%) usando digestão com tripsina-EDTA a 0,05% ou algum outro de-attProcedimento. Determine a contagem de células e verifique a viabilidade usando uma câmara de contagem e coloração com azul de tripano. A fracção de células viáveis deve exceder 85%.
- Tecido tumoral ex vivo
- Tome uma amostra de tumor cirúrgico fresco ou, em alternativa, recolha o tecido tumoral de um modelo de tumor de rato transplantado ou geneticamente modificado. Tomar 200-1000 mg de tecido e gerar uma única suspensão celular por desagregação mecânica ( por exemplo , usando tesoura ou um bisturi) e digestão enzimática ( por exemplo , usando colagenase / dispase / DNase cocktail).
- Filtrar a amostra através de um filtro de corte de 70 μm. Determinar a contagem de células e verificar a viabilidade usando uma câmara de contagem e trypan blUe coloração.
NOTA: Os coquetéis de digestão contêm freqüentemente 200 μg / mL de colagenase P, 0,8 U / mL de dispase e 25 μg / mL de DNase I, e os tempos de incubação variam tipicamente entre 20 e 50 min. Idealmente, a desagregação tecidual é realizada de acordo com um protocolo otimizado para o tecido sob investigação 27 , 28 , 29 .
2. Amostras de teste
- Ajustar a concentração de células para 1 x 10 6 células / mL em meio de cultura fresco (um veículo contendo nutrientes é importante, uma vez que a extrusão do corante é um processo que consome energia). Finalmente, transfira 1 mL da amostra para um tubo de fundo redondo de citometria de fluxo / FACS (rotulado como "teste").
NOTA: Para obter resultados óptimos, pode ser necessário que a concentração das células seja titulada (por exemplo 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 células / mL), mas uma concentração de células mais baixaUma maior resolução 19 . Apenas para aplicações de classificação onde um número máximo de células SP deve ser recuperado, recomenda-se aumentar a concentração celular até 1 x 10 7 células / mL. - Adicionar 10 μM de DCV à amostra e misturar bem, quer por vortexação suave ou ressuspensão durante 3-5x. Proceder aos controlos de inibição.
NOTA: Os resultados óptimos podem depender da titulação do corante desencadeante (por exemplo 2,5; 5; 10; 20 uM), mas uma concentração de corante mais elevada geralmente produz uma resolução mais elevada 19 .
3. Controles de inibição
- Transferir 250 μL da suspensão de células contendo corante para um novo tubo de fundo redondo de citometria de fluxo / FACS (marcado como "controlo"). Adicionar 50 μM de verapamil ou 20 μM de FTC e misturar bem por pipetagem.
NOTA: Verapamil e FTC são os inibidores mais bem estabelecidos para a análise SP, mas têm especificidade de bomba de efluxo diferenteY: Verapamil inibe vários transportadores de droga ABC, incluindo ABCB1 e ABCB5, enquanto FTC é específico para ABCG2 6,19. Se o estado de SP de uma amostra individual for desconhecido, recomenda-se, portanto, usar tanto verapamil quanto FTC em tubos separados.
4. Coloração
- Capa ambos os tubos "teste" e "controle" e incuba-los a 37 ° C no escuro por 90 min, com agitação suave a cada 15 min. A maior parte da extrusão de corante em células SP ocorrerá dentro dos primeiros 45 min, mas a acumulação de corante em células não SP (contribuindo para a resolução) é apenas máxima após 75-90 min 19 .
- Após a coloração estar completa, lavar as células em 3-4 mL de PBS gelado e ressuspender o sedimento num volume de 100 μL (PBS também). Manter as células no escuro e refrigeradas em gelo, e proceder à coloração de marcadores adicionais. Alternativamente, execute diretamente citometria de fluxo anaLise.
5. Costura para outros marcadores
- Adicionar um painel desejado de anticorpos conjugados com fluorocromo às células coradas com DCV, misturar bem e incubar as células a 4 ° C no escuro durante 20-30 min. Lavar as células em 3-4 mL de PBS gelado e proceder à discriminação de células mortas.
NOTA: Os formatos de anticorpos que são facilmente compatíveis com DCV e praticamente não requerem compensação incluem PerCP ou PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 e BV786 . Formatos que são compatíveis com DCV, mas podem exigir compensação incluem FITC, Alexa Fluor 488, PE e BV650. Os formatos que não são praticamente compatíveis com DCV incluem BV421, V450 e V500. - Adicionar 7-AAD (ou PI) às células coradas com DCV à concentração recomendada pelo fabricante em particular e incubar as amostras durante 5-10 min no escuro. Filtrar as amostras através de filtros de corte de 70 μm e proceder à análise citométrica de fluxo.
6. Análise de Citometria de Fluxo
NOTA: Recomenda-se ligar o respectivo instrumento de citometria de fluxo durante o processo de coloração, de modo que tudo seja ajustado assim que as amostras estiverem prontas. Isso inclui também procedimentos de manutenção padrão, como monitoramento do desempenho do sistema e reabastecimento do tanque.
- Adquirir as células no citómetro de fluxo e portá-los em um gráfico de pontos bivariada FSC / SSC (Figura 1B). Excluir dupletos e agregados, comparando os diferentes sinais de FSC ( ie altura, largura, área) (Figura 1C).
- Se um marcador de células mortas foi incluído, o portão na fracção de célula viável ( eg , 7-AAD-negativo) ( Figura 1D ). Visualize as células de singuleto viáveis num gráfico bivariado de pontos para emissão de DCV 'azul' e 'vermelho'. Para este fim, exibir o canal de fluorescência "azul" no eixo y ( por exemplo , 450/50) e o canal 'Vermelho "no eixo x ( eg , 525/50).
- Mude os dois canais para o modo linear e ajuste as tensões do detector correspondentemente para que o SP se posicione no lado do gráfico no quadrante inferior esquerdo. Por outro lado, o não SP localiza-se no quadrante superior direito do gráfico, reflectindo a distribuição do ciclo celular (G1 e G2). Porta o SP e parar a aquisição ( Figura 1E ).
NOTA: As células SP definidas por DCV podem ser detectadas utilizando instrumentos de citometria de fluxo equipados com uma fonte de excitação de laser violeta ( ie uma linha a laser de 405 nm). É uma análise específica da SP que a fluorescência emitida é medida em modo linear e em dois canais separados exibidos numa trama de pontos bivariada. A emissão "azul" de DCV é medida a aproximadamente 450 nm ( por exemplo , com um filtro padrão 450/40) e a emissão "vermelha" de DCV é medida a aproximadamente 510-585 nm ( por exemplo , com um 510/50, um 525/50 ou um filtro 585/15) 19 . Devido à química particular do ensaio, a separação entre células SP e não SP é geralmente mais elevada no canal de fluorescência "vermelho" 19 .
- Carregar o (s) controle (s) de inibição e adquirir os dados. As células SP têm agora desaparecido ou são substancialmente reduzidas ( Figura 1F ). Se necessário, refine o gate SP com base nesses dados.
- Para investigar a expressão do marcador de superfície por células SP, deixe a fluorescência "vermelha" de DCV no eixo x e exiba um respectivo canal de fluorescência no eixo y no modo logarítmico ( por exemplo , APC). Ajustar as tensões do detector correspondentemente e mostrar a fração de células SP com coloração positiva para o (s) marcador (s) investigado (s) ( Figura 1G ). A co-expressão de um marcador particular por células SP produz um sinal respectivo no quadrante superior esquerdo do gráfico 30 .
- Registre oDados e / ou classificar as células SP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ï¿½proporcionada uma an�ise SP espec�ica de c�ulas A2780, uma linha de c�ulas de cancro do ov�io humano anteriormente mostrada para abrigar um SP que representa menos de 1% de c�ulas 9 . As células foram cultivadas a 37 ° C em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM e 1x penicilina / estreptomicina e colhidas a 85% de confluência utilizando tratamento com tripsina-EDTA a 0,05%. As c�ulas foram lavadas em PBS e filtradas atrav� de filtros de corte de 70 �. A contagem de células foi determinada utilizando uma câmara de contagem e coloração com azul de tripano e 1 x 106 células / mL (meio fresco) foram coradas com DCU 10 μM durante 90 min a 37 ° C no escuro. Em paralelo, incubou-se uma alíquota do mesmo na presença de 20 mM de FTC sob exactamente as mesmas condições. As células foram lavadas em 4 mL de PBS e um anticorpo conjugado com APC contra ABCG2 foi adicionado ao tubo "de teste" a uma concentração pré-titulada. Após incubaçãoDurante 25 min a 4 ° C, as células foram lavadas em PBS, e adicionou-se 7-AAD para marcar as células mortas. As amostras foram arrefecidas em gelo e analisadas num instrumento FACS. A estratégia de bloqueio representada é mais ou menos universalmente aplicável a outras amostras, embora material altamente heterogéneo, tal como amostras de amostras de tecido, possa requerer a pré-definição da fracção de células alvo utilizando marcadores de superfície específicos ( por exemplo , EpCAM, CD45, CD31). Os resultados mostrados servem como referência para a detecção de SP baseada em DCV em outros laboratórios. Assim, as localizações relativas das populações de células investigadas devem ser aproximadamente comparáveis, mas certamente não idênticas, àquelas obtidas por outros pesquisadores com amostras biológicas independentes.
Figura 1: Fluxo de Trabalho e Resultados Representativos. (A) Fluxograma principal para a detec�o de SP utilizando DCV staininG. A coleta de marcadores adicionais é opcional, mas a discriminação de células mortas é altamente recomendada. ( BG ) Análise de SP representativa de células de cancro do ovário humano A2780 realizadas num instrumento FACS. As células são fechadas de acordo com as características FSC / SSC (B) e duplicados e agregados são excluídos comparando os diferentes parâmetros de FSC ( eg , altura e largura) ( C ). Em seguida, as células mortas são discriminadas atravessando a fracção de células 7-AAD-negativas (ou PI-negativas) ( D ). As células individuais vivas são então apresentadas num gráfico de pontos bivariados linear para a emissão de DCV azul e vermelha e o SP (e o correspondente não-SP) é fechado ( E ). A mesma análise é agora feita com um respectivo controlo de inibição (neste caso FTC foi utilizado), e isto deve conduzir a um desaparecimento quase completo das células dentro da porta SP ( F ). Finalmente, o SP identificado pode ser caracterizado mais estreitamente, eg , por deteRemoção do (s) transportador (es) de fármaco (s) ABC que pode ser responsável pela extrusão do corante conferindo assim o fenótipo SP (neste caso ABCG2, em linha com a sensibilidade FTC). ( G ). FTC, fumitremorgin C; ALDH, aldeído desidrogenase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O progresso no manejo clínico do câncer também depende do desenvolvimento de modalidades de tratamento que visam as CSCs. Métodos que permitem o isolamento fiável de CSCs a partir de amostras biológicas irão acelerar a identificação de alvos adequados e são, portanto, de importância crítica neste esforço. SP é uma técnica estabelecida e valiosa para identificar populações de CSC que expressam transportadores de droga ABC e a implementação de DCV ampliou sua aplicabilidade a instrumentos de citometria de fluxo padrão. Mecanicamente, a discriminação SP aproveita o efluxo de corante activo por transportadores de fármacos ABC para detectar CSCs com base em baixa fluorescência que implicam uma localização característica ao lado do fundo da parcela à esquerda para o correspondente não SP. É importante destacar que a detecção de SP baseada em DCV é um método robusto e direto, sendo as etapas mais críticas (i) a preparação de células (ii) o processo de coloração (iii) a seleção de um inibidor apropriadoItor e (iv) a análise de citometria de fluxo. Uma vez que a extrusão de corantes é um processo de consumo de energia activo, é particularmente relevante começar com uma boa viabilidade celular; Apenas as células viáveis (que expressam transportador de fármaco) podem produzir uma SP. Além disso, faz frequentemente sentido optimizar a razão entre a concentração de corante e a densidade celular e assim aumentar a separação de células SP (por sua vez, isto requer a titulação de DCV e células). Uma regra geral é que tanto uma concentração de corante mais elevada como uma concentração de células mais baixa resultam numa separação melhorada 19 . A chave para uma experiência de DCV bem sucedida é a validação funcional do SP utilizando inibidores farmacológicos da actividade do transportador de fármacos ABC. Como referido anteriormente, verapamil e FTC estão entre os inibidores mais estabelecidos para a análise SP e têm diferentes especificidades de bomba (FTC é específico para ABCG2, enquanto verapamil inibe várias bombas). Para amostras com status de SP desconhecido, recomenda-se usar tantoInibidores em tubos separados. Outra opção é o uso do inibidor pan-ABC droga transportador reserpine [ 4] . No entanto, os investigadores devem estar cientes de que a autofluorescência deste composto pode potencialmente interferir com o sinal DCV 19 . Uma vez que as células são analisadas para a emissão de DCV azul e vermelho, as tensões do detector devem ser ajustadas para que ambas as populações ( ie SP e non-SP) sejam visíveis com a máxima separação. Se a imagem parece estranha, escala logarítmica pode ser a razão (neste caso, mudar ambos os canais de volta para o modo linear).
Também é importante notar que o teste de SP baseado em DCV não é específico para câncer nem foi originalmente desenvolvido para aplicação em oncologia. Em vez disso, é específico para os transportadores de fármacos ABC e assim também facilita a detecção e isolamento de células estaminais fisiológicas (de tecidos), tais como linhagem - Sca-1 + c-kit +Células estaminais hematopoéticas 25 . Além disso, os tipos celulares diferenciados que estabelecem barreiras específicas em sítios corporais cruciais também podem exibir características SP 20 . A aplicação da detecção de SP baseada em DCV em tecidos primários requer, portanto, uma discriminação específica da população de células alvo utilizando marcadores adequados.
Tendo em vista a alta conservação das bombas de efluxo de fármaco entre as populações CSC 9 , 23 , a detecção de SP baseada em DCV é amplamente aplicável, fato também exemplificado pelo seu uso bem sucedido em entidades tumorais incluindo entidades de diferentes origens 9 , 17 , 18 . Outras vantagens incluem que (i) as células com implicações directas na resistência aos fármacos são identificadas (particularmente importante para a resolução de subgrupos de células cancerígenas clinicamente relevantes que medeiam a recorrência da doença(Ii) a detecção de um parâmetro funcional, em vez de estático, pode conferir mais especificidade de ensaio e melhorar a resolução 19 , 31 , 32 . Do ponto de vista conceptual / tecnológico, a detecção de SP baseada em DCV é claramente distinta das colorações de superfície mediadas por anticorpos: (i) A estrutura alvo apresenta localização intracelular e representa ácido nucleico, não proteína. (Ii) O ensaio detecta a actividade da proteína, não a mera presença ou densidade. (Iii) As células alvo são definidas em virtude de baixa fluorescência, não por um sinal positivo. (Iv) Como um corante que se liga ao ADN, o DCV é sensível a mesmo ligeiras variações na concentração de células ou corantes durante a coloração 19 . (V) A fluorescência DCV é medida em modo linear, não logaritmicamente. (Vi) a fluorescência de DCV ( ie a fluorescência gerada por um único fluoróforo) é medida em dois canais separados, nOt em um intervalo de comprimento de onda único. Apesar destas especificidades, a análise de SP baseada em DCV é fácil de executar e, evidentemente, estende a caixa de ferramentas de citometria de fluxo para pesquisa CSC.
A an�ise de SP baseada em DCV tamb� oferece muitas possibilidades de reter para outros marcadores, sendo compat�el com ambas as colora�es de superf�ie mediadas por anticorpos convencionais (numerosos formatos poss�eis) e o ensaio comercial que detecta a actividade enzim�ica de ALDH. Contudo, aqui focalizamos a coloração superficial e o leitor é referido à literatura publicada 4 para ver detalhes metodológicos sobre a codificação da actividade de ALDH. Em qualquer caso, a análise de SP desencadeada por DCV deve ser combinada com a discriminação de células mortas e reagentes óbvios para esta finalidade são 7-AAD e PI.
De notar, as células SP definidas por DCV (e células de controlo não SP) podem ser purificadas vivas utilizando a aplicação de classificação dos correspondentes instrumentos de citometria de fluxo. Porque o teste de SP detecta um pa funcionalQue as células apenas viáveis podem produzir, a viabilidade das células SP recuperadas pode geralmente ser esperada ser elevada (por vezes, aproximadamente 100%). No entanto, se houver problemas com a viabilidade pós-triagem, podem ser verificados diferentes parâmetros técnicos, tais como o tamanho do bocal de separação, a natureza do agente tampão ea temperatura durante a triagem (usando um bocal de 70 μm nunca tivemos problemas com Viabilidade, mas um bico maior ainda pode ajudar em células muito delicadas). As células recuperadas podem ser submetidas a análises a jusante tais como qRT-PCR, Western blot e perfil de expressão global ( por exemplo , utilizando matriz de genes ou a tecnologia RNASeq mais recente). Al� disso, as c�ulas SP isoladas podem ser investigadas quanto a caracter�ticas de c�ulas estaminais funcionais ( por exemplo , clonogenicidade de uma �ica c�ula e transplanta�o em s�ie) ou subcultivadas para estabelecer linhas celulares de c�ulas SP enriquecidas ou mesmo puras que possam estar est�eis durante os meses 9 . Na nossa, Usamos frascos de plástico 2D convencionais e médios normais para CSCs 9 de subculturas definidas por DCV, mas modalidades seletivas de células-tronco, tais como condições de cultura independentes de ancoragem / 3D e meios especializados também serão viáveis. Propomos que as condições mais favoráveis para a expansão in vitro de um determinado compartimento SP necessitem ser verificadas individualmente.
Em resumo, descrevemos aqui o fluxo de trabalho experimental detalhado de identificação / isolamento de CSC por meio da análise de SP baseada em DCV. Nosso trabalho deve ajudar os pesquisadores da CSC a implementar e estabelecer este método útil em seus próprios laboratórios, o que deve promover a elucidação de estratégias terapêuticas anti-CSC para melhorar o manejo clínico do câncer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar. Também não há envolvimento de não-autor na preparação do manuscrito.
Acknowledgments
Maximilian Boesch é apoiado por uma Erwin Schrödinger Fellowship do Austrian Science Fund FWF (concessão número J-3807).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
