Summary

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em> Xenopus tropicalis</em

Published: May 25, 2017
doi:

Summary

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Abstract

I vasi sanguigni forniscono ossigeno e sostanze nutritive in tutto il corpo, e la formazione della rete vascolare è sotto stretto controllo dello sviluppo. L'efficace visualizzazione in vivo dei vasi sanguigni e la quantificazione affidabile della loro complessità sono fondamentali per comprendere la biologia e la malattia della rete vascolare. Qui forniamo un metodo dettagliato per la visualizzazione dei vasi sanguigni con un colorante fluorescente disponibile in commercio, il complesso di Di-AcLDL lipoproteinico a bassa densità acetilato plasmatico umano (DiI-AcLDL) e per quantificare la loro complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere etichettati con una semplice iniezione di Di-AcLDL nel cuore battente di un embrione ei vasi sanguigni in tutto l'embrione possono essere immaginati in embrioni vivi o fissi. Combinata con la perturbazione del gene mediante la microinezione mirata di acidi nucleici e / o l'applicazione del bagno di reagenti farmacologici, i ruoli di un gene o di un percorso di segnalazione sullo sviluppo vascolare possono essere inveStregata entro una settimana senza ricorrere a sofisticati animali geneticamente modificati. A causa del sistema venoso ben definito di Xenopus e della sua angiogenesi stereotipica, lo spruzzo di vasi preesistenti, la complessità dei vasi può essere quantificata in modo efficiente dopo gli esperimenti di perturbazione. Questo protocollo relativamente semplice dovrebbe servire come strumento facilmente accessibile in diversi settori della ricerca cardiovascolare.

Introduction

La vasculogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni delle cellule endoteliali appena nate e l'angiogenesi, la formazione di nuovi vasi da recipienti preesistenti, sono due processi distinti che formano la vasculatura embrionale 1 . Qualsiasi disregolazione in questi processi provoca diverse malattie cardiache e anomalie strutturali delle navi. Inoltre, la crescita tumorale è associata a una crescita incontrollata dei vasi. Come tali, i meccanismi molecolari che sottendono la vasculogenesi e l'angiogenesi sono oggetto di un'intensa ricerca 2 .

Xenopus e zebrafish sono modelli vertebrati attraenti per studi di vasculogenesi e angiogenesi, per diversi motivi. In primo luogo, i loro embrioni sono piccoli; Pertanto, è relativamente facile immaginare l'intera vascolarizzazione. Secondo, lo sviluppo embrionale è rapido; Ci vorranno solo un paio di giorni per sviluppare l'intera vasculatura, durante il quale la vascul in via di sviluppo Può essere ripresa. Terzo, gli interventi genetici e farmacologici prima e durante la formazione della nave sono facili da eseguire, come per esempio attraverso la microinezione di anticorpi nucleotidi morfologici (MOs) nell'embrione in via di sviluppo o attraverso l'applicazione della droga dei farmaci 3 , 4 , 5 .

Il vantaggio unico di Xenopus sullo zebrafish è che le manipolazioni embriologiche possono essere eseguite poiché Xenopus segue scomponi stereotipari olooblastici e la mappa del destino embrionale è ben definita 6 . Ad esempio, è possibile generare un embrione in cui solo un lato laterale viene manipolato geneticamente iniettando un MO antisenso a una sola cellula a due stadi. È anche possibile trapianto il primordio cardiaco da un embrione all'altro per determinare se il gene esercita la sua funzione da un meccanismo intrinseco o extrinsico a celluleAss = "xref"> 7. Anche se queste tecniche sono state sviluppate per lo più in Xenopus laevis , che è allotetraploide e quindi non è ideale per gli studi genetici, possono essere direttamente applicati a Xenopus tropicalis , una specie diploide strettamente correlata 8 .

Un modo per visualizzare la vascolarizzazione in un embrione live Xenopus è quello di iniettare un colorante fluorescente per etichettare i vasi sanguigni. La lipoproteina a bassa densità acetilata (AcLDL) etichettata con una molecola fluorescente come DiI è una sonda molto utile. A differenza di LDL nonacetilato, AcLDL non si lega al recettore LDL 9 ma è endocitata da macrofagi e cellule endoteliali. L'iniezione di DiI-AcLDL nel cuore di un animale vivo produce l'etichettatura fluorescente specifica delle cellule endoteliali e l'intera vascolarizzazione può essere rappresentata mediante microscopia a fluorescenza in embrioni vivi o fissi 4 .

Qui, ci aspettiamoI protocolli dettagliati per la visualizzazione e la quantificazione dei vasi sanguigni usando DiI-AcLDL in Xenopus tropicalis ( Figura 1 ). Forniamo punti chiave pratici, con esempi di esperimenti di successo e non riusciti. Inoltre, forniamo un metodo diretto per l'analisi quantitativa della complessità vascolare, che potrebbe essere utile per valutare gli effetti dei fattori genetici e ambientali sulla formazione della rete vascolare.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati conformi ai protocolli approvati dai comitati istituzionali di cura e uso degli animali di Yonsei University College of Medicine. 1. Preparazione degli embrioni di Xenopus tropicalis NOTA: Gli embrioni di Xenopus tropicalis sono stati prodotti come descritto in precedenza 10 , con leggera modifica. Gli embrioni di Xenopus tropicalis sono stati organizzati secondo le tabelle di Nieuwkoo…

Representative Results

Timeline degli esperimenti (figure 1 e 2) Poco dopo la fecondazione, si può eseguire una microinezione mirata per modulare l'espressione genica. Ad esempio, un MO antisensivo che si lega specificamente al codone di iniziazione del mRNA Tie2 endogeno può essere iniettato, inibendo la traduzione del mRNA di bersaglio Tie2 da ostacoli sterici. Un MO può essere coniugato alla fluoresceina per una facile visualizzazione degli e…

Discussion

Il protocollo qui presentato è stato innanzitutto sviluppato da Ali H. Brivanlou e colleghi per indagare gli eventi di sviluppo durante la formazione vascolare in Xenopus laevis 4 , ma, come mostrato in questo manoscritto, può essere applicato ad altri piccoli animali. L'iniezione di tintura nel cuore è semplice da eseguire, e l'intera rete vascolare può essere ripresa in un microscopio di dissezione a fluorescenza, così come un microscopio confocale. Se il colorante viene i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato ispirato dall'opera di Levine et al. , Che descriveva questo metodo sperimentale e forniva una descrizione completa dello sviluppo vascolare in Xenopus laevis. Ringraziamo i membri del nostro laboratorio per il loro contributo. Questo studio è stato sostenuto dall'iniziativa di ricerca futura diretta dell'università di Yonsei 2015 (2015-22- 0095) e dal Programma di Sviluppo Tecnologico Bio & Medical della Fondazione Nazionale di Ricerca (NRF) finanziato dal Ministero della Scienza, delle TIC e del Futuro Pianificazione ( NRF-2013M3A9D5072551)

Materials

35mm Petri dish SPL 10035 Sylgard mold frame
60mm Petri dish SPL 10060 Embryo raising tray
Borosilicate Glass Sutter instrument B100-50-10 Needle for injection
BSA Sigma A3059-10G Coating reagent
CaCl2 D.S.P.GR Reagent 0.1X MBS component
Coverslip Superior HSU-0111520 For confocal imaging
DiI-AcLDL Thermo Fisher Scientific L3484 Vessel staining solution
FBS Hyclone SH.30919.02 For storage of testis
Fiber Optical Illuminator World Precision Instruments Z-LITE-Z Light
Ficoll Sigma F4375 Injection buffer
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter instrument P-97 Injection needle puller
Forcep Fine Science Tool 11255-20 For embryo hatching and
needle tip cutting
Glass Bottom dish SPL 100350 For confocal imaging
hCG MNS Korea For priming of frogs
HEPES Sigma H3375 Buffering agent
Incubator Lab. Companion ILP-02 For raising embryos
KCl DAEJUNG 6566-4400 MBS component
L15 medium Gibco 11415-114 For storage of testis
L-cysteine Sigma 168149-100G De-jellying reagent
MgSO4 Sigma M7506 MBS component
Microtube Axygen MCT-175-C-S For storage of testis
MS222 Sigma E10521 Anesthetic powder
NaCl DAEJUNG 7647-14-5 MBS component
NaOH Sigma S-0899 pH adjusting reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Fixatives
PBS BIOSESANG P2007 Buffer for imaging
pH paper Sigma P4536-100EA For confirming pH
PICO-LITER INJECTOR Waner instruments PLI-100A For injection
Pin Pinservice 26002-10 For incision
Pinholder Scitech Korea 26016-12 For incision
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope World Precision Instruments PZMIII For visual screening
Standard Manual Control Micromanipulator  Waner instruments W4 64-0056 For microinjection
SYLGARD 184 Kit Dow Corning For DiI injection
Transfer pipette Korea Ace Scientific Co. YM.B78-400 For eggs and
embryo collection

References

  1. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
  2. Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
  3. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
  4. Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
  5. Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
  6. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  7. Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
  8. Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
  9. Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
  10. Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
  11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
  12. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  13. Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
  14. Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
  15. Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
  16. Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
  17. Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).

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Cite This Article
Ohk, J., Jung, H. Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis. J. Vis. Exp. (123), e55652, doi:10.3791/55652 (2017).

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