Summary
Vi utvecklade en ny teknik i elektronmikroskopi, "flash-och frys" som möjliggör visualisering av membrandynamiken med ms tidsupplösning. Denna teknik kombinerar optogenetic stimulering av nervceller med högtrycks frysning. Här visar vi de förfaranden och beskriva protokollen i detalj.
Abstract
Celler ständigt förändras deras membran arkitektur och distribution protein, men det är extremt svårt att visualisera dessa händelser på en tidsmässig och rumslig upplösning i storleksordningen ms och nm, respektive. Vi har utvecklat en tidsupplöst elektronmikroskopi teknik "flash-och frys" som inducerar cellulära händelser med optogenetik och visualiserar de resulterande membrandynamiken genom frysning celler vid definierade tidpunkter efter stimulering. För att demonstrera denna teknik, uttryckte vi channelrhodopsin, en ljuskänslig katjonkanal, i mus hippocampusneuroner. En ljusblixt stimulerar neuronal aktivitet och inducerar neurotransmitterfrisättning från synaptiska terminaler genom fusion av synaptiska vesiklar. Den optogenetic stimulering av neuroner kopplas med högtrycksfrysning att följa morfologiska förändringar under synaptisk transmission. Med hjälp av en kommersiell instrument, fångade vi fusion av synaptiska blåsor och återvinning av synaptic vesikelmembranet. Att visualisera sekvensen av händelser, genererades stora datamängder och analyseras blint, eftersom morfologiska förändringar följdes i olika celler över tiden. Ändå tillåter flash-och-frys visualisering av membrandynamiken i elektronmikrofotografier med ms tidsupplösning.
Introduction
Visualisera membran och proteindynamik inom en cell är ett viktigt steg mot att förstå cellbiologin för speciella processer. Dynamisk människohandel händelser kan fångas med hjälp av ljus eller fluorescensmikroskopi. Dock är den subcellulära sammanhang i stort sett saknas i sådana bilder eftersom subcellulära strukturer kan inte vara helt "målade" av färgämnen eller fluorescerande prober och lösas spatialt och spektralt 1, 2. Å andra sidan, medan elektronmikroskopi kan avgränsa subcellulär arkitektur i utsökt detalj, kan det inte fånga cellulära dynamik, eftersom proverna måste fastställas före avbildning. Sålunda är det typiskt inte tillräcklig för att fullständigt förstå cellulära dynamik med hjälp av endast en avbildningsmodalitet.
Att övervinna begränsningarna av ljus och elektronmikroskopi, har korrelativa mikroskopitekniker utvecklats. Korrelat ljus- och elektronmikroskopi(CLEM) visualiserar intracellulära dynamik med hjälp av Ijusmikroskopi och underliggande subcellulära strukturer med elektronmikroskopi. I CLEM, celler som deltar i olika processer, såsom cytokines och endocytos 3, 4, 5, 6, är färsk avbildas och bearbetas sedan för elektronmikroskop. Även CLEM fångar vissa aspekter av intracellulära dynamik finns det fyra faktorer som begränsar nyttan av detta tillvägagångssätt. Först, den temporala upplösningen begränsas av hur snabbt cellerna kan immobiliseras, vilket typiskt tar s - min på grund av den långsamma diffusion och reaktion av fixativ 7. För det andra är den subcellulära arkitektur observerade efterhand 8; Således kan de dynamiska morfologiska förändringar inte tagits med denna metod. Tredje, fluorescens- och elektronmikrofotografier kan inte exakt inriktade på grund av vävnads shrinkage orsakas av uttorkning under provberedning för elektronmikroskopi 9, 10. För det fjärde gör händelser som cytokines och endocytos inte ske samtidigt i varje cell 5, 11, och därmed måste en viss cell som är engagerad i händelse identifieras från en stor population av celler. Denna process är ofta tidskrävande. Således, är det nödvändigt med en ny metod för att inducera specifika händelser i varje cell och för att fånga de resulterande cellulära dynamik genom den snabba immobilisering av celler vid definierade tidpunkter.
På senare tid har flera verktyg tagits fram för att framkalla särskilda cellulära dynamik med hjälp av ljus (optogenetik). Channelrhodopsin är en ljuskänslig, icke-selektiv katjonkanal isolerats från Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. När channelrhodopsin uttrycks i neuronal-membran, en kort ljusblixt inducerar ett inflöde av natriumjoner in i neuroner och utlöser en aktionspotential 14, 15. Aktionspotentialen utbreder sedan in i de synaptiska terminaler, där synaptiska vesiklar smälter inom millisekunder 16, 17, 18 Därför inducerar channelrhodopsin neuronal aktivitet. Att följa membrandynamiken vid synaptiska terminaler, måste nervceller immobiliseras vid definierade tidpunkter efter stimulering med ms precision.
Att fånga membrandynamiken efter inducering av nervaktivitet, kopplade vi ljus stimulering med högtrycks frysning 17, 18, 19. Högtrycks frysning möjliggör nästan ögonblicklig immobilisering av celler med nedsatt iskristallbildning 20. Iskristaller can brista membran och störa den subcellulära arkitekturen 21. Genom att variera tidsintervallen mellan stimulering och frysning, var membranet trafficking inom synaptiska terminaler fångade efter induktion av en aktionspotential.
Här visar vi experimentella procedurer med användning av en kommersialiserad högtrycks frys som kopplar en ms temporal kontroll av ljus stimulering med högtrycks frysning. Till skillnad från andra instrument som kräver en extern enhet för att styra ljus stimulans och frysning är lätt stimulering helt integrerat i detta system och kan appliceras med ms precision 19. Denna process innebär flera steg. 1) Mus hippocampala neuroner odlas på safir diskar och infekterades med lentivirus som bär en expressionsvektor för channelrhodopsin 18. 2) Neuroner stimuleras och frystes vid definierade tidpunkter efter stimulering. 3) Den förglasade vattnet är substitutd med ett organiskt lösningsmedel, medan lipider och proteiner är tvärbundna genom fixativ för att bevara den intracellulära arkitektur. 4) Proverna infiltreras och inbäddas i epoxiharts. 5) Ultratunna sektioner uppsamlas med användning av en ultramikrotom. 6) Tunna sektioner avbildas på ett transmissionselektronmikroskop. 7) Bild insamling och analys utförs blint med avseende på tidpunkter eller genotyper. Cellulära dynamik kan bestämmas genom rekonstruktion av tidsupplösta bilder 17, 18. Provberedning (steg 2-5 ovan) kräver en vecka, men den efterföljande bildanalys kräver månader till ett år.
Protocol
Alla experimenten utfördes enligt de regler och förordningar av animaliskt användning av National Institutes of Health. Protokollet godkändes av Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Johns Hopkins School of Medicine.
1. Isolering och odling av mus hippocampus nervceller
- Dissekera cortex från en postnatal dag 0 - dag 2 (P0 - 2) mushjärna 18. Isolera astrocyter från cortex.
OBS! Mushjärna isolerades efter halshuggning. Astrocyter tjäna som matarskikt för hippocampusneuroner. - Behandla cortex med 800 mikroliter av 0,05% trypsin-EDTA under 15 min vid 37 ° C för att dissociera de astrocyter.
- Kultur astrocyterna i en T-75-kolv med 13 ml DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 0,2% penicillin-streptomycin i en vecka vid 37 ° C och 5% CO2.
- Placera en syratvättade och steriliserade 18 mm glastäckglas per brunn i en 12-brunnsplatta.
- Tvätta snabbt två 6 mm kolbelagda safir skivor i 70% etanol och placera dem på toppen av varje glastäckglas.
- Förbereda Poly-D-lysin (PDL) lösning genom blandning av 3 ml 17 nM ättiksyra med 1 ml av råttsvanskollagen och en ml PDL (1 mg / ml). Applicera 200 | il av PDL lösning på safir diskar och täckglas för 5 min vid RT.
- Avlägsna PDL lösningen och lufttorka. Före användning, sterilisera plattan som framställts i steg 1,4-1,6 för 30 minuter under ultraviolett ljus.
- Ympa astrocyter från steg 1,3 i 2 ml DMEM vid en densitet av 5x10 4 celler / brunn i plattan som framställts i steg 1,4 - 1,6. Odla dem vid 37 ° C och 5% CO2 under en vecka.
- Lägga 20 mikroliter av fluor-deoxiuridin (slutkoncentration: 80 | iM) till varje brunn under åtminstone några timmar innan odling av nervceller.
OBS: fluor-deoxiuridin stoppar astrocyternas division. - Ändra mediet till 1,5 ml av neuronala basal-medium (se tabell of Materials) innehållande 1% L-alanyl-L-glutamin (se tabell of Materials), 2% serumfritt tillägg för neuronala celler (se tabell of Materials), och 0,2% penicillin-streptomycin .
- Förbereda papain lösning genom tillsats av 20 enheter av papain till 5 ml av enzymlösning (1,65 mM cystein, 1 mM CaCl2, och 0,5 mM EDTA i DMEM). Surgöra lösningen genom att passera CO 2-gas under 20 min. Filter-sterilisera med en 0,22 um filter.
- Harvest hjärnan från en P0 - 2-mus 18. Omedelbart överföra hjärnan till iskall Hanks'-balanserade saltlösning (HBSS). Dissekera hippocampi under ett stereomikroskop, hålla vävnaden nedsänkt i HBSS.
- Placera de två hippocampi i 1 ml av papain lösning som framställts i steg 1,11. Inkubera under 1 h på en Thermomixer vid 37 ° C och 750 rpm.
- Ersätta papain med 1 ml av inaktiverande lösning innehållande2,5 mg trypsininhibitor och 0,5 mg albumin per ml DMEM. Inkubera i 5 min vid 37 ° C. Sug bort inaktive lösningen.
- Lägga 200 mikroliter av neuronal basmedium (se tabell of Materials) till den isolerade hippocampus. Triturera med användning av en 200 mikroliter pipettspets för att dissociera cellerna. Vänta tills icke dissocierade cellerna avsätts i botten. Försiktigt bort mediet med celler från toppen.
- Upprepa steg 1,15 3x. Pool alla dissocierade celler i en ny 1,5 ml centrifugrör.
- Räkna antalet celler med användning av en hemocytometer. Platt neuroner vid en densitet av 6,5 x 10 4 celler / brunn på toppen av astrocyt skiktet som framställts i steg 1.1 - 1,10.
- Infektera nervceller med lentivirus uttrycker channelrhodopsin vid DIV 3 (3 d in vitro) 18.
- Utföra flash-och-frysning av DIV 14, såsom beskrivs i stegen 2.1 - 2,5, nedan.
2. Flash-and-Freeze
- Framställning av Fixative
- Enligt en kemisk huv, lägga till följande ämnen till ett koniskt rör för att förbereda fixativ: 2,5 ml glutaraldehyd (10% stock i aceton), 0,25 g osmiumtetroxid, 0,25 ml vatten, och 22,25 ml vattenfri aceton.
OBS: Den slutliga koncentrationen av varje komponent bör vara 1% i aceton. Glutaraldehyd tillsättes för att bevara de proteinstrukturer under fryssubstitution. VARNING: Den akuta toxiciteten av osmiumtetroxid är hög. Exponering för ångor kan skada hornhinnan i ögat. Det bör hanteras endast i en certifierad kemisk huva. - Alikvot 1 ml av fixativ till numrerade kryogena flaskor (2 ml). Håll fixerings fryst i flytande kväve fram till användning.
OBS: Osmiumtetroxid och glutaraldehyd korsreagerar och utfällning; sålunda, en gång blandats, alikvot omedelbart, mössa rören, och dränka de kryorör i flytande kväve för att frysa fixativ. Använd en penna för att numrera Cryogena flaskor, kan sedan aceton tvätta bort markörer.
- Enligt en kemisk huv, lägga till följande ämnen till ett koniskt rör för att förbereda fixativ: 2,5 ml glutaraldehyd (10% stock i aceton), 0,25 g osmiumtetroxid, 0,25 ml vatten, och 22,25 ml vattenfri aceton.
- Framställning av Fysiologisk saltlösning
- Göra fysiologisk saltlösning genom blandning Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM) och glukos (10 mM).
OBS: Dessa värden är slutkoncentrationer. Cryo-skyddsmedel används inte för monolagerkulturer. Emellertid en ordentlig kryo-skyddsmedel som krävs för exemplar tjockare än 5 um. Användning av 20% BSA typiskt rekommenderas. Jäst pasta och E. coli OP50 kan även användas som kryo-skyddsmedel för fluglarver eller C. elegans. - Lägga CaCl2 vid 4 mM och MgCl2 vid 1 mM slutkoncentrationer.
OBS: Koncentrationerna av CaCl2 och MgCb 2 varierar beroende på experiment. För att säkerställa infångning av exocytiska intermediärer, är 4 mM kalcium används för dessa speciella experiment för att öka frisättningen sannolikheten för vesiklar 18. - Kollaosmolaritet med användning av en osmometer. Se till att det är 300 ± 5 mOsm.
- Lägga AMPA-receptorantagonist (NBQX) till en slutlig koncentration av 3 uM och GABA-receptorantagonist (bikukullin) till en slutlig koncentration av 30 uM.
OBS: Neurotransmitter receptorantagonister tillsättes för att undvika återkommande nätverksaktivitet efter neuronal stimulering 18. - Värma upp den fysiologiska koksaltlösning till 37 ° C för användning.
- Göra fysiologisk saltlösning genom blandning Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM) och glukos (10 mM).
- Beredningen av Specialized Högtrycks Frys och en Automated Freeze Substitution Unit
- Före högtrycks frysning, svalna en automatiserad fryssubstitution enhet till -90 ° C genom att fylla tanken med flytande kväve.
- Svalna aceton i en liten kopp till -90 ° C genom att placera den inuti provkammaren.
- Fylla flytande dewar kväve och lagring dewar av högtrycks frys (se tabell of Materials) med flytande nitroallm.
- Ställ upp ljuset stimulans protokollet med hjälp av pekskärm.
- Namn programmet genom att klicka på "Redigera" bredvid "Programnamn" på ljus stimulans fönstret. Ett annat fönster kommer att dyka upp.
- Inrätta ett program genom att skriva "15.000 ms" i "mörka fasen", "100 ms" i "period", "10 ms" i "puls" och "1" i "antalet perioder" för en enda stimulus av 10 Fröken. Frysa cellerna 90 ms senare (Figur 1C).
OBS: "mörka fasen" tillåter cellerna att återhämta sig från ljusexponering under provladdning. "Period" definierar stimuleringsfrekvensen. Till exempel om den stimulans bör appliceras vid 20 Hz, denna kolumn bör sättas till 50 ms. "Pulse" definierar varaktigheten av ljuset stimulans. Slutligen "antalet perioder" definierar det totala antalet stimuli tillämpas. För att inrätta en högfrekvent stimulering, se
- För en "ingen stimulering" kontroll, typ "15 s" i "mörka fasen," "0 ms" i "period", "1 ms" i "puls" och "0" i "antalet perioder" i ljuset stimulering inställningsfönstret, såsom beskrivs i steg 2.3.4.
OBS: Som standard "puls" måste vara minst 1 ms. - På huvudskärmen, se till att rutan för ljusstimulering kontrolleras.
- Ställ in lagringsprotokoll genom att klicka på "forvaring" på huvudskärmen. Klicka på "Edit". I följande fönster, använd "+" eller "-" för att välja "2" för att lagra 2 diskar i varje kanal (3 kanaler totalt). Kontrollera "Storage LN2 aktiverad."
- Prov Lastning och frysning i Högtrycks Frys
OBS: All prov monterings- och laststegen sker under ett stereomikroskop med en 7.5-60X förstoringsområdet. En tweezer används i steg 2.4.1 - 2.4.4 att manipulera proverna. Experiment måste utföras vid fysiologisk temperatur.- Placera en safirskiva, cell-sidan uppåt, i brunnen av den svarta, mellanplattan (Figur 1B).
- Placera en 100 | im distansring över safir skivan (Figur 1B).
- Placera en tom safirskiva över distansringen (Figur 1B) efter doppning en sida av skivan i den förvärmda saltlösning från steg 2,2. Se till att inga luftbubblor fastnar mellan de två safir diskar.
- Placera en annan 100 ^ m distansring och en 400 ^ m distansring (Figur 1B). Ta bort den extra vätska med användning av filterpapper.
- Placera aggregatet från steg 2.4.3 mellan de två transparenta halvcylindrar (Figur 1A). Stäng den övre röda locket för att initiera frysprocessen.
OBS: Den förinställda protokollet körs automatiskt när luckan är stängd. Provet förblir i samma orientering i fryskammaren, och en blixt av ljus appliceras från toppen av provenheten. Den röda locket dyker upp igen automatiskt när frysprocessen är klar. - Förvara provet i lagrings dewar.
OBS: Efter frysning, är provet automatiskt ned i en förvarings dewar fylld med flytande kväve och lagras där tills vidare bearbetning. Lagrings dewar har tre kamrar, och varje kammare kan innehålla upp till 3 prov som mest. Typiskt är två prover frystes under samma stimuleringsbetingelser, och högtrycks frys är programmerad att lagra både i samma kammare. - Upprepa steg 2.4.1 - 2.4.6 för varje prov.
- Gå vidare till steg 2,5 när alla kamrarna är fulla.
OBS: Enheten var inställt på att lagra upp till 6 exemplar i lagrings dewar åt gången. Därför efter varje 6: e prov, steg 2,5 måste utföras. När lossas, upprepa steg 2.4.1 - 2.4.6.
- Provtagning och överföring till ett automatiserat Freeze-substitution Unit
- Öppna dörren till förvarings dewar, som ligger under bordet av högtrycks frys. Ta bort förvarings dewar och placera den på bänk.
- Med användning av händer, avlägsna provkammaren från dewar-kärlet och överföra den i den specialiserade provbricka fylld med flytande kväve. Lås upp ratten för att frigöra provbägaren.
- Avlägsna de transparenta halvcylindrar från provbägaren med hjälp av en pincett efter förkylning spetsarna på pincetten med flytande kväve (~ -196 ° C). Noggrant överföra mitten, svartplåt till en liten kopp innehållande flytande kväve.
OBS: Spetsarna på pincett måste förkyld till temperaturen för flytande kväve. Provet måste hållas under flytande kväve vid alla tillfällen för att förhindra iskristallbildning.
3. Freeze Substitution i Automated Freeze-substitutions Unit
- Med användning av förkylda pincett (tips vid ~ -196 ° C), snabbt överföra mittplattan från steg 2.5.3 till förkyld aceton (-90 ° C).
- Separera safir skivan från mitten plattan genom att försiktigt skaka eller knacka.
OBS: Ibland kan det vara svårt att skilja safir skivan från mellanplattan. I en sådan situation, lämna mittplattan i förväg kyld aceton (-90 ° C) under ett par minuter. Gentle avlyssning med pincett bidrar också till att skilja safir från mitten plattan. - Placera en kryogen flaska innehållande fixativ (steg 2,1) inuti en provkammare av substitutionsenheten. Överför safir disk till kryogeniska flaskan och placera ett lock på flaskan.
- Ställa in fryssubstitution programmet enligt följande: (i) -90 ° C under 5 - 30 h, (ii) -90 - -20 ° C i 14 h (5 ° C / h), (iii) -20 ° C under 12 h, och (iv) -20 ° C - 20 ° C i 4 h (10 ° C / h).
OBS! Duranson av det första steget vid -90 ° C kunde varieras. Den totala varaktigheten av fryssubstitution är inställd på ett sådant sätt att programmet avslutas på morgonen (~ 1,5 d postexperiment) runt 8:00, så att de efterföljande stegen kan utföras under dagtid.
4. Infiltration och Plastic Inbäddning med epoxiharts
- När programmet avslutas, använda handskar på händerna för att överföra de kryogena flaskor innehållande safirskivorna från preparatkammaren av substitutionsenheten till en kemisk huva.
- Med användning av en pipett, tillsätt aceton (rumstemperatur) till varje kryogen ampull och tvätta varje safirskiva 4 - 6x under 1 - 2 timmar.
- Eventuellt, inkubera proverna i 0,1% uranylacetat under 1 h, om det behövs extra kontrast. Tvätta 4 - 6x med aceton under 1 - 2 timmar.
OBSERVERA: OBSERVERA: Det finns risk i samband med intern exponering av inandning av uranylacetat, som orsakar irritation av de övre luftvägarna. Hög exponering kan damage blodkroppar. Arbetet med uranylacetat bör ske under ventilation. Skyddskläder rekommenderas. - Förbereda flytande epoxiharts mediet genom att väga 6,2 g glycerol-polyglycidyleter, 4,4 g bisfenol-A-epoxiharts, och 12,2 g dodecenylbärnstensyraanhydrid (DDSA). Blanda väl och tillsätt 800 | il av bensyldimetylamin (BDMA) under blandning. De-gas under 10 minuter.
- Förbereda 30, 70, och 90% epoxiharts i aceton från 100% epoxiharts som framställts i steg 4,4.
- Lägg 30% epoxiharts till de kryogena flaskor innehållande safir diskar och inkubera i 2 - 3 h vid RT i en omloppsskakanordning vid 120 rpm.
- Ersätta 30% epoxiharts med 70% epoxiharts genom pipettering och inkubera under 3 - 4 h vid RT i en omloppsskakanordning.
- Med användning av pincett, överföra varje safirskiva, cell-sida-upp, för att locket på en inbäddning kapsel. Lägg 90% epoxiharts till locket. Inkubera O / N vid 4 ° C.
- Nästa dag, gör färskt epoxiharts medium, som i steg 40,4.
- Överföra varje safirskiva, cell-sidan uppåt, till locket av en inbäddning kapsel. Fylla lock med nyberedd 100% epoxiharts. Byt till frisk 100% epoxiharts varje 2 timmar, upprepa tre gånger.
- Placera proven i en ugn vid 60 ° under 48 h för att polymerisera.
5. Monterings Prover
- Placera provet upp och ned på den stereomikroskop så att safirskivan är belägen på toppen av hartsblocket. Ta bort det tunna lagret av epoxiharts från toppen genom att skrapa den med ett rakblad.
- Med användning av ett rakblad, skär en grund linje längs kanten av safir skivan; denna linje hjälper till att separera safirskivan från epoxihartset i steg 5,3.
- Separera safirskivan från epoxihartset genom doppning i flytande kväve under ca 10 s.
OBS: Cellerna kommer att stanna i epoxihartset. - Efter avlägsnande av safir disketten på en dissekera utrymme för att hitta ett område med celler (4-10X förstoring). Skära runt området av intresse (~ 2 x 2 mm) med användning av ett rakblad (tveeggat). För att hålla provet på plats, utföra detta steg medan provet tejpas till ytan av mikroskopet.
- Montera den lilla plastbit (~ 2 x 2 x 5 mm) som innehåller celler med användning av lim innehållande etyl cyanoakrylat på en cylindrisk presshuvudet framställt av epoxiharts. Inkubera blocket vid 60 ° C under 1 h.
6. Sektione
- Använd en ultramicrotome avsnitt provet.
- Trimma ytan av plastinbäddade prov med en glaskniv vid en hastighet av 3 mm / s och en tjocklek av 200 nm / sektion. Klipp 4 - 5 sektioner från ytan där astrocyterna är belägna.
- Växla till en diamantkniv och sektionen med en hastighet av 0,8 mm / s och en tjocklek av 40 nm / sektion. Skär 20 - 25 avsnitt.
- Samla band av sektioner på singel-slot koppargaller täckt med 0,7% polyvinylacetat (setabellen Materials).
7. Imaging Med användning av en transmissionselektronmikroskop (TEM)
- Före TEM avbildning, fläcka sektionen med 2,5% uranylacetat i metanol under 5 min.
- Tvätta galler 15x i 50% metanol. Då, tvätta i ultrarent vatten 15x, med varje tvätt varade 30 s.
- Kort luft-torka sektionen och placera gallret in i en provhållare hos TEM.
- Bild på 93,000X förstoring.
- Hämta bilder.
OBS: Imaging görs vanligtvis blinda för de tidpunkter eller genotyper, och typiskt ~ 200 bilder samlas / tidpunkt.
8. Bildanalys
- Analysera bilder med hjälp av en programvara (t.ex. ImageJ) med en anpassad makro (Watanabe, Davis och Jorgensen, opublicerad).
OBS: x / y-koordinater registreras från vesiklar, plasmamembranet, den aktiva zonen membranet, och alla andra membranbundna organeller vid synapser. Texten files innehåller den information exporteras till en annan programvara (t.ex. Matlab). Data analyseras vidare med hjälp av egna program.
Representative Results
Användning av det protokoll som beskrivits ovan, utförde vi "flash-och-freeze" experiment i mus hippocampusneuroner uttrycker channelrhodopsin. Dessa neuroner frystes antingen 15 ms eller 100 ms efter ljusigångsättning. Vi har tidigare visat att exocytos och endocytos av synaptiska vesiklar inträffar i de synaptiska ändarna på de 15 ms och 100 ms tidpunkter, respektive 18. Dessa händelser framgångsrikt fångade vid lämpliga tidpunkter (Figur 2), vilket tyder på att blixt-och-frys experiment kan utföras framgångsrikt på den valda specialiserade högtrycks frys (se tabell of Materials).
Figur 1. Prov laddas och programmering i Högtrycks frysskåp. A) Provlastbord av hög-pryck frys. Mellanplattan, som visas i den infällda bilden för strukturella detaljer, är placerad i en CLEM holder för laddning av prov. En av halvcylindrarna är placerad vid den nedre delen av provlastbordet, och den andra är fäst med en klämma till den övre luckan. När provet är laddad, är mellanplattan trycks framåt till botten halv-cylinder och locket är stängt för att initiera frysning. B) Prov aggregatet. Safirskiva innehållande neuroner placeras i brunnen i mittplattan, med cellsidan vänd uppåt. En 100 ^ m ringen är placerad direkt ovanför safirskivan inuti brunnen. Då, är en tom safirskiva doppas i fysiologisk saltlösning placeras med lösningen sidan nedåt. Luftbubblor måste undvikas. Slutligen, är ett 100 | am ring och en 400 um ring tätt placerad ovanför. Någon extra vätska avlägsnas med filterpapper. C) Ett tvärsnitt av en inbäddning kapsel med safirskivan nedsänkt i epoxiharts. den Sapphyra skivan är placerad på botten av kapseln, med cell-sidan upp och täckt med epoxiharts för infiltration och inbäddning. D) Programmering högtrycks frys för en enda, 10 ms stimulus. Proverna fryses 90 ms efter det att ljuspulsen. E) Programmering av högtrycks frys under 10 stimuli vid 20 Hz. Proverna fryses 5 ms efter den sista ljuspuls. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Visualisering av Exocytos och Endocytosis i mus hippocampus nervceller. Hippocampus nervceller stimuleras gång och fryses vid de angivna tidpunkterna. Elektronmikrofotografier visar den exocytos av en synaptisk vesikel A) och ultrasnabb endocytos
Discussion
"Flash-och frysning" tillvägagångssätt visualiserar membrandynamiken genom att inducera en specifik cellulär händelse med optogenetik och genom frysning celler vid definierade tidpunkter efter stimulering 19. I denna demonstration använde vi channelrhodopsin, en ljuskänslig katjonkanal, för att stimulera nervceller och fångade fusion och återvinning av synaptiska vesiklar vid de synaptiska ändarna. Under de senaste åren har många optogenetic verktyg tagits fram 22, 23, som alla är kompatibla med blixt och skyddsmedel. Till exempel, kan organell trafficking induceras med användning av Ijusinducerad heterodime av kryptokrom och CIB1 24. På liknande sätt kan lipidkompositionen av plasmamembranet förändras genom ljustranslokation av fosfoinositid fosfataser till plasmamembranet 25. Dessutom små, ljuskänsliga föreningar såsom azobensen change konforma beroende på belysningsvåglängder. Denna konformationsförändring kan användas för att aktivera ligandreglerade kanaler eller för att ändra lipidkomposition i membranet 26, 27. Caged föreningar kan också användas för att inducera cellulär aktivitet. Emellertid kan LED som används i den aktuella installationen inte producerar tillräcklig energi för uncaging; sålunda ytterligare optimeringar av systemet är sannolikt nödvändigt. Ändå tillämpningar av dessa ljus aktiverbara verktyg är flexibla många cellulära händelser kan framkallas av en ljusblixt. "Flash-and-freeze" kan fånga de resulterande membrandynamiken.
Det finns två huvudsakliga begränsningar i "flash-and-freeze" -metoden. Först fångar den "ögonblicksbilder" av en viss händelse från olika celler. Med andra ord är det inte möjligt att följa membrandynamiken i en cell under en tidsperiod. Således för återuppbyggnaden av någon cellulär ävent, måste man förvärva och analysera ett stort antal bilder från varje prov och vid varje tidpunkt. Vidare, i neuroner, är en ännu större antal bilder är nödvändigt, eftersom fusion av synaptiska vesiklar tar bara platser i 20 - 30% av synapserna i mus hippocampusneuroner 18, 28. Analysen av en så stor datamängd kräver enorma mängder tid. I framtiden bildtagning och analys måste automatiseras för att göra strategin mer effektiv 29, 30.
Den andra begränsning föreligger av naturen hos högtrycksfrysningsteknik. När celler frysa, omlagras cellulär vatten för att bilda iskristaller om fryshastigheten är lägre än 100 K / s 21. Dessa iskristaller kan penetrera membraner eller koncentrera lösta ämnen för att ändra lokala osmotiskt tryck, vilket resulterar i ruptur av membran. För att undvika iskristaller, HIGh tryck (~ 2000 atm) appliceras på provstyckena. På grund av den super-kylningseffekten, är tillräcklig för att förhindra vatten från att bilda iskristaller vid detta tryck 21 en fryshastighet av 100 K / s. I teorin, exemplar så tjockt som 500 | im kan frysas utan iskristaller, men cirka 200 ^ m är sannolikt den praktiska gränsen, såsom kuboidala former av is tenderar att bildas i tjocka vävnad, kompromissa morfologi. Vid bearbetning av prover tjockare än 5 pm, är det nödvändigt att använda en ordentlig kryo-skyddsmedel, såsom BSA. Emellertid kommer BSA ändra lösningens osmolaritet och kan påverka det fysiologiska svaret av celler. Därför är omfattande kontrollexperiment som krävs för att validera användning av BSA i speciella system. Iskristaller kan också bilda efter högtrycks frysning om provbitarna av misstag avlägsnas från bad med flytande kväve. Sålunda är det kritiskt att hålla prover i flytande kväve vid alla tidpunkter och för att använda i förväg kylda pincett tillmanipulera dem.
När du planerar experiment bör följande tre punkter övervägas. För det första är den maximala intensiteten av ljus (den 460 nm-linjen) 5,5-8,0 mW / mm 2. Huruvida denna intensitet är tillräcklig för att inducera aktivitet måste verifieras med levande-cell imaging på ett fluorescensmikroskop före blixt-och-frys experiment. För det andra måste experiment utföras vid fysiologisk temperatur. Stadiet högtrycks frys uppvärmes till 37 ° C under försöken med mus hippocampusneuroner 31. Slutligen måste tidpunkter noggrant valt att fånga membrandynamiken. Inledande studier visade att endocytos är fullständig efter 100 ms av stimulering. Sålunda, ytterligare tre tidpunkter (15, 30, & 50 ms) undersöktes också för att följa membrandynamiken 17, 18. Dessa tidpunkter var nödvändiga för att visualisera membran trafficking händelses under synaptisk transmission. Men kravet på antalet tidpunkter är olika i varje cellulär händelse. Därför bör några tidpunkter samplas före initiering stora dataset samling.
Disclosures
Open Access publicering av denna artikel var sponsrad av Leica Mikrosysteme GmbH.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från Johns Hopkins University (SW). Vi tackar Johns Hopkins School of Medicine Mikroskop Facility för deras tekniska support. Vi tackar Erik Jorgensen och Christian Rosenmund och deras laboratorier för utveckling av tekniken. Vi tackar M. Wayne Davis för utformningen av den ursprungliga enheten. Vi tackar Paul Wurzinger, Cveta Tomova och Delgermaa Luvsanjav för deras tekniskt bistånd. Vi vill också tacka Natalie R. Hamilton och Grant F. Kusick för deras kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-substitution and Low-temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
| High Pressure Freezer - EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
| Osmometer | Gonotec | ||
| Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
| Oven | Blue M | ||
| Razor blade | Personna | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
| Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
| KCl | Sigma | 746436-1KG | |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
| MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
| Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
| Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
| Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
| Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
| Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
| Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
| Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
| Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
| Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
| Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed to 37 °C before use |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo scientific | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
| Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
| Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
| Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
| Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
| Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed to 37 °C before use |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
| Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
| Hanks'-balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
| NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
| Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
| Whatman I filter paper | GE | ||
| Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |
References
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), aab3500 (2015).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. Correlated light microscopy and electron microscopy. Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography. Cell. 150 (3), 508-520 (2012).
- Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution. Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).
- Müller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis. Cellular Electron Microscopy. 79, Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X06790045 101-119 (2007).
- Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).
- Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM. Micron. 88, 77-83 (2016).
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).
- Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. eLife. 2, e00723 (2013).
- Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S. Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution. Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer-Verlag. (1987).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Weitzman, M., Hahn, K. M. Optogenetic approaches to cell migration and beyond. Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).
- Niu, J., Ben Johny,, Dick, M., E, I., Inoue, T. Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects. Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).
- van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Optogenetic control of organelle transport and positioning. Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).
- Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. Optogenetic control of phosphoinositide metabolism. Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).
- Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides. J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).
- Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse. Science. 262 (5134), 754-757 (1993).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).
- Watanabe, S., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
