Summary
Vi præsenterer en protokol, der kombinerer cellisolering og fuldcelle patch-clamp-optagelse til måling af de primære dissocierede epitelcellers elektriske egenskaber fra rotte-cauda-epididymiderne. Denne protokol tillader undersøgelse af de primære epididymepitelcellers funktionelle egenskaber for yderligere at belyse epididymis fysiologiske rolle.
Abstract
Den epididymis er et vigtigt organ for sædmodning og reproduktiv sundhed. Det epididymale epitel består af intricately forbundne celletyper, der adskiller sig ikke kun i molekylære og morfologiske træk, men også i fysiologiske egenskaber. Disse forskelle afspejler deres forskellige funktioner, som sammen skaber det nødvendige mikromiljø for udviklingen i post-testikulær sæd i det epididymale lumen. Forståelsen af de epididymale epitelcellers biofysiske egenskaber er kritisk for at afsløre deres funktioner i sæd og reproduktiv sundhed under både fysiologiske og patofysiologiske forhold. Selv om deres funktionelle egenskaber endnu ikke er fuldt udklaret, kan de epididymale epithelceller undersøges ved anvendelse af patch-clamp-teknikken, et værktøj til måling af cellernes hændelser og membranegenskaber for enkeltceller. Her beskriver vi metoderne til celleisolering og fuldcelle-patch-clamp-optagelse til meaSikker på de elektriske egenskaber hos primære dissocierede epitelceller fra rotte cauda-epididymiderne.
Introduction
Den epididymis i den mandlige reproduktive kanal er et organ foret med et lag af mosaikepitelceller. Som i andre epitelvæv arbejder de forskellige celletyper af det epididymale epithelium, herunder hovedceller, klare celler, basale celler og celler fra de immunologiske og lymfesystemer, på en samordnet måde for at fungere som barrieren ved tubulens frontlinie og som Understøttende celler til sædmodning og fysiologi 1 , 2 , 3 . Disse epithelceller spiller således en vigtig rolle i reproduktiv sundhed.
Epitelceller betragtes almindeligvis som ikke-exciterbare celler, der ikke er i stand til at generere alle eller ingen aktionspotentialer som reaktion på depolariserende stimuli på grund af manglende spændingsgatede Na + eller Ca 2+ kanaler 4 , 5 . Imidlertid udtrykker epithelceller uniKø sæt af ionkanaler og transportører, der regulerer deres specialiserede fysiologiske roller, såsom sekretion og næringsstoftransport 6 . Forskellige epithelceller har derfor karakteristiske elektriske egenskaber. For eksempel udtrykker de primære celler CFTR til væske- og chloridtransport og udtrykker TRPV6 til calciumreabsorption, medens de klare celler udtrykker protonpumpen V-ATPase til luminal forsuring 1 , 7 , 8 , 9 . Nogle transportører og ionkanaler, der regulerer de fysiologiske egenskaber af de epididymale epithelceller, er blevet rapporteret, men de funktionelle egenskaber af epididymepitelceller er stort set endnu ikke forstået 10 , 11 , 12 , 13 .
WhOle-celle-patch-clamp-optagelse er en veletableret teknik til at undersøge de indre egenskaber hos både excitere og ikke-excitere celler og er særlig nyttig til at studere funktionerne af primært dissocierede celler i heterogene celleprøver; Spændingsklemmen anvendes til måling af de passive membranegenskaber og ionstrømmene af enkeltceller 14 , 15 . De passive membranegenskaber omfatter indgangsbestandighed og kapacitans. Den tidligere parameter indikerer den indre membrankonduktans, mens sidstnævnte indebærer overflademængden af cellemembranen (et phospholipid-dobbeltlag, hvor ionkanaler og transportører er placeret, der tjener som en tynd isolator, der adskiller ekstracellulært og intracellulært medium). Membrinkapacitansen er direkte proportional med cellemembranets overfladeareal. Sammen med membranmodstanden, der reflekteres af inputmodstanden, vil membrantidskonstanten, wDer angiver, hvor hurtigt cellemembranpotentialet reagerer på strømmen af ionkanalstrømme, kan bestemmes. I denne henseende bestemmes den biofysiske kinetik og egenskaber af cellerne ved at kombinere de aktuelle responskarakteristika fra en serie af spændingstrin, der påføres cellerne, 15 , 16 , 17 , 18 .
I det foreliggende papir beskriver vi procedurerne for isolering af epithelceller fra rotte cauda-epididymis og trinene til måling af membranegenskaberne af forskellige celletyper i den dissocierede celleblanding under anvendelse af helcelle-patch-klemmen. Vi viser, at de epididymale hovedceller udviser særskilte membranelektrofysiologiske egenskaber, og at konduktanserne let kan identificeres fra andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg udføres i overensstemmelse med retningslinjerne fra Instituttet for dyrepleje og brug af ShanghaiTech University, der opfylder de lokale og internationale krav.
1. Eksperimentelle dyr
- Brug voksne Sprague-Dawley-hanrotter (~ 300-450 g) mellem 8-12 uger gamle. Ved denne alder i rotterne er sædene ankommet til cauda-epididymiderne.
2. Isolering af epithelceller fra rotte-cauda-epididymider
BEMÆRK: Følgende trin udføres under ikke-aseptiske forhold, medmindre andet er angivet.
- Fremstilling af dissektionsinstrumenter og reagenser
- Desinficere dissektionsværktøjerne ved nedsænkning i 70% ethanol og lad dem lufttørre.
- Tænd opvarmningsbadet (32 ° C); Forbered og forvar 500 mL 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) suppleret med 1% (v / v) antibioTics (100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin-slut) og mærket som "RPMI (+ P / S 1: 100)". Udfør dette trin i en ren luftstrømskontrolleret arbejdsstation.
- Forbered og forvarm 1x 500 mL Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), der indeholder ikke-essentielle aminosyrer (0,1 mM) og natriumpyruvat (1 mM) og suppleret med 5-a-dihydrotestosteron (1 nM), 10% føtalt bovint Serum, 1% (vol / vol) antibiotika (100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin-slut) og mærket som "Full-IMDM". Lav 50 ml alikvoter og forsegle med parafilm; Opbevares ved 4 ° C. Brug aseptiske forhold.
- Forbered en kollagenaseenzymfordøjelsesopløsning ved at opløse kollagenase type I og kollagenase type II i RPMI (+ P / S 1: 100), hvilket resulterer i 1 mg / ml af hver kollagenase i opløsningen. Filtre gennem en 0,22 μm membran og markere som "collagenase løsning". Opbevares ved stuetemperatur (RT) indtil brug. Juster volumenet af enzymopløsningen baseretPå vægten af enzymet Det minimale volumen, der kræves for begge cauda-epididymider fra en enkelt rotte, er 2 ml.
- Fyld en 35 mm skål med RPMI (+ P / S 1: 100).
- Dissektion af rotte cauda epididymider
- Opdræt dyret ved enten at anvende natriumpentobarbital 85 mg / kg ip eller ved anvendelse af et isoflurankammer, indtil dyret ikke reagerer på hale-klemningstimulering; Følg ved cervikal dislokation.
- Desinficer underlivet ved at tørre med 70% ethanol, skub forsigtigt de to testikler ned til underunderlivet, og åbn derefter underlivet i nærheden af pungen.
- Pluk det epididymale fedt op, dissekér hele reproduktive organer (testikler, epididymider og vas deferens) og nedsænk i skålen med RPMI (+ P / S 1: 100).
- Overfør de reproduktive organer i skålen med RPMI (+ P / S 1: 100) til en aseptisk arbejdsstation.
- Dissect cauda epididymides fra bindevæv og fedtvæv og epiDidymalkapsel. Anbring en epididymis med ~ 0,2 ml kollagenaseopløsning i en 1,5 ml rør. Formæt dette trin i en ren luftstrømskontrolleret arbejdsstation.
- Dissociering af enkeltceller fra rotte cauda-epididymider
- Skær epididymiderne i collagenaseopløsningen ved hjælp af fin saks, indtil vævet bliver en pastalignende væske. Skyl sakse forsigtigt med resten af (~ 0,8 ml) enzymopløsning i 1,5 ml rør.
- Anbring røret på en metaltermomixer i 30 minutter ved 37 ° C med en omrystningshastighed på 1000 rpm.
- Centrifuger enzymvævsblandingen ved 30 xg ved stuetemperatur i 3 minutter, og dekanter den klæbrige supernatant, der sædvanligvis indeholder sædcellerne.
- Resuspender pelleten i 1 ml Full-IMDM for at slukke for all den enzymatiske aktivitet. Overfør cellesuspensionen til et 50 ml rør indeholdende 49 ml RPMI (+ P / S 1: 100).
BEMÆRK: Filtreres suspensionen eventuelt via en 100 μm mesh membran med konstant trituratIon for at undgå store celleaggregater. Brug dog ikke et meshfilter, hvis der kræves cellesuspension til dyrkning af cellemonolag. - Centrifug den cellulære blanding ved 30 xg ved stuetemperatur i 10 minutter; Dekanterer supernatanten.
- Resuspender pelleten i 1 ml fuld IMDM med forsigtig triturering i mindst 5 minutter for at dissociere enkelte celler fra de enzymatisk behandlede epididymvævblandinger.
- Separation af epitelceller fra andre celler under aseptiske forhold
- Kultur cellesuspensionen på en 10 cm petriskål indeholdende fuld IMDM i mindst 8 timer eller natten over i en inkubator ved 32 ° C i 5% CO2.
- Forbered sterile coverlips på forhånd ved nedsænkning i 100% alkohol. Lufttørre og dypp i et lille volumen af dyrkningsmediet. Placér dækslisterne i 6 cm kogeplader eller i enkeltbrønde på en 24-brønds plade.
- Næste morgen høst de dissocierede epithelceller ved forsigtigt at indsamle cellestoppetSion fra petriskålen, som hovedsagelig består af epithelceller. Centrifuge cellesuspensionen ved 30 xg ved stuetemperatur i 5 minutter, og dekanter derefter supernatanten.
- Resuspender cellepellet i ~ 2 ml Full IMDM.
- Sæd 0,2 ml af den høstede cellesuspension på midten af hver steril coverlip.
- Lad cellesuspensionen sætte sig i væskedråben i mindst 10 minutter for at tillade celler løst at klæbe til glasdækslerne. Tilsæt forsigtigt 1 mL Full IMDM ved kanten af 10 cm skål eller 0,3 mL Full IMDM til hver brønd på en 24-brønds plade; Forstyr ikke cellerne.
- Opbevar de isolerede enkeltceller på coverglas i inkubatoren ved 32 ° C i 5% CO 2 indtil patch-clamp eksperimenterne.
3. Optagelsesløsninger og mikropipetter
BEMÆRK: Brug patch-clamp eksperimenterne med de bedste kemikalier og løsninger.
- Fremstilling af stamopløsninger
- Autoklaver alle flaskerne til lageropbevaring og filtrer alle lageropløsningerne (undtagen de ætsende opløsninger) og filtrer gennem 0,22 μm membraner før brug.
- Forbered alle lageropløsninger i forvejen ved stuetemperatur, og opbevar ved 4 o C: 5 M NaCl; 1 M KCl; 100 mM MgCl2; 100 mM CaCl2; 200 mM NaH 2PO 4; 100 mM EGTA (pH 7,0 med KOH). Håndter 5 M NaOH, 1 M HCI og 1 M KOH lager som ætsende opløsninger.
- Forberedelse af standard ekstern registrering fysiologisk saltopløsning (PSS)
- Varm lageropløsningerne til RT om morgenen af patch-clamp-optagelsen.
- Pipette ingredienserne fra hver bestand med de ønskede slutvolumen, undtagen CaCl2, fx til fremstilling af 500 ml PSS: 140 mM NaCl = 14 ml 5M; 5 mM KCI = 2,5 ml 1M; 1,2 mM MgCl2 = 6 ml 100 mM; 1.2 mM NaH 2 PO4 = 3 ml 200 mM.
- Tilføj dobbeltdestillerede vand (ddH2O) til slutvolumen på 400 ml og tempereres.
- Vejes 0,9 g glucose og 1,19 g HEPES og opløses fuldstændigt i opløsningsblandingen.
- Tilsæt CaCl2-stamopløsning (2,5 mM = 12,5 ml 100 mM) under omrøring.
- Tilføj op til 99% af slutvolumenet.
- Juster pH til 7,4 ved anvendelse af NaOH eller HCI.
- Kontroller osmolariteten og juster om nødvendigt med 5 M NaCl eller glucose.
- Tilføj ddH2O til slutvolumenet på 500 ml i en cylinder.
- Fremstilling af mikropipette interne opløsninger (lave EGTA K + -baserede opløsninger)
- Veje eller pipette det korrekte volumen af reagenserne fra hver bestand med de ønskede slutvolumen og koncentration, fx til fremstilling af 50 ml lav EGTA K + -baseret intracellulær opløsning til et volumen på ~ 30 ml ddH2O: 100 mM K-gluconat = 1,17 g; 35 mM KCI = 1,75 ml 1 M; 2 mM MgCl2 = 1 mlPå 100 mM; 0,1 mM EGTA = 0,05 ml 100 mM; 10 mM HEPES = 0,072 g.
- Tilsæt nok vand til ~ 95% af slutvolumenet og lad opløsningen ligestille ved RT. Sørg for, at løsningen er klar.
- Mens opløsningen konstant omrøres, justeres pH til 7,2 ved anvendelse af KOH.
- Væg og tilsæt 0,078 g Mg-ATP til opløsningen, indtil det er helt opløst.
- Anbring opløsningen på is og brug en lille alikvot til måling af osmolaritet; Normalt måler opløsningerne ~ 290 mOsmol og behøver ikke justering. Hvis osmolariteten afviger betydeligt fra 280-295 mOsmol, skal du tilberede en ny løsning.
- Tilføj ddH2O til endeligt volumen.
- Opdel opløsningen i 500 μl alikvoter, filtrer med et 0,2 μm sprøjtefilter, tæt forsegling og opbevar straks ved ≤ -20 ° C.
- På datoen for patch-clamp-eksperimentet optøes en alikvot af intracellulær opløsning på is og opbevares kølet under patch-clamp-eksperimentet tilForhindre nedbrydning.
- Træk patchpipetterne ud af glaskapillærerne (efter brugsanvisningen til pipettehåndtag) for at opnå mikropipettestørrelser med en resistens på 5-10 M, når de er fyldt med intracellulær opløsning.
4. Opsætning af patch-clamp-eksperimentet og etablering af helcellekonfiguration med celler
- Opsætning af patch-clamp-eksperimentet
- Tænd patch-clamp setup (computer, computerstyret forstærker, digitizer osv. )
- Åbn patch-clamp software ( f.eks. AXON pCLAMP10 eller HEKA PatchMaster) og indstille protokollerne til elektrofysiologiske optagelser. Indstil filteret for signalet til lavpas ved 1-3 kHz og digitalisereren ved 10-20 kHz.
- Tænd for kameraet, mikromanipulatoren og lyskilden.
- Når den computerstyrede forstærker er tændt, skal du forsøge at kaste eksperimentets krop ved at røre ved hånden den patch-clamp rig, der er jordet,Før du rører hovedet, for at beskytte det mod elektriske stød.
- Overfør dyrkningspitelcellerne på glasdækslet til optagekammeret fyldt med ~ 1 ml standard PSS ved stuetemperatur. Forsigtigt ændrer bade PSS mindst to gange ved hjælp af en pipette inden nogen patch-clamp eksperimenter.
BEMÆRK: Fyld perfusionssystemet med standard PSS eller en anden ekstern løsning i overensstemmelse med det planlagte forsøg. Perfekt det mikroskopmonterede optagekammer (RC-26G eller RC-26GLP) med PSS et par gange med en hastighed på ~ 2 mL / min, før du starter testet med patch-clamp. Sørg for, at der ikke er luftbobler fanget langs perfusionssystemet. - Se og vælg cellerne under et inverteret mikroskop ved hjælp af 10X og 40X målsætninger udstyret med et differential-interferens-kontrast optisk system. Se efter store enkeltstående isolerede celler til optagelse. Identificer de isolerede epididymale epithelceller ved deres sfæriske form med ru mMikrofilli på den ene ende af membranerne og polariseret fordeling af intracellulære indhold ( figur 1 ).
- Ved hjælp af en 1 ml sprøjte (en hjemmelavet ikke-metallisk mikrosprøjtestål) skal du fylde en mikropipette med den interne opløsning (lav EGTA K + -baseret opløsning, se trin 3.3). Sørg for, at der ikke er luftbobler i mikropipetten, hvilket kan øge mikropipettens modstand. Brug tilstrækkelig løsning, så den interne opløsning nedsænker den chloridbelagte sølvtrådelektrode i mikropipetteholderen.
- Monter mikropipetten i elektrodeholderen, og anbring et lavt positivt tryk (~ 0,2 ml sprøjtevolumen). Hold det lave positive tryk kontinuerligt, indtil du rører ved cellemembranen i de senere trin.
- Etablering af helcelle konfiguration med celler til optagelser
- Dyp pipetten ind i badopløsningen ved micromanipulatorens højeste hastighed. Find pipettenTip på skærmen tilsluttet digitalkameraet; Sænk mikromanipulatorhastigheden til mediumhøj tilstand.
- Kontroller hurtigt mikropipettens modstand (5-10 MΩ) ved hjælp af dataopsamlingsgrænsefladekommandoen ( fx "Membrantest" i AXON-systemet) ved at anvende et spændingstrin ( fx 5 mV til 100 ms), der genereres fra den computerstyrede forstærker. Skift til en ny mikropipette, hvis modstanden er markant uden for dette område.
- Begynd at flytte ned objektivet monteret på mikroskopet; Gradvist styre mikropipetten mod den valgte celle. Sænk altid målet først, og sænk derefter mikropipetten til fokusplanet, indtil mikropipetten er over midten af den valgte celle.
- Annuller det flydende forbindelsespotentiale mellem pipette- og badeopløsningerne til nul ved hjælp af kommandoen "pipette offset" i kommandoregrænsefladen for software.
- Indstil den computerstyrede forstærker commAnder til spændingsklemmen og membrantesten til "bad" -tilstanden.
- Fint fokus for et tydeligere billede af cellen, og sænk derefter gradvis mikropipetten ved hjælp af micromanipulatoren ved lavmediumhastigheden.
- Når mikropipetten er tæt på cellen (påvist ved en nedsat strøm, når den udløses af membrantestkommandoen), skal du straks fjerne det lave positive tryk og anvende et svagt negativt tryk (0,1 ml sprøjtevolumen) til dannelse af gigaseal (> 1 GΩ) .
- Overvåg modstanden med membranstesten. Hvis modstanden er> 500 MΩ men <1 GΩ, skal du anvende et negativt potentiale (normalt som holdpotentialet, der er indstillet til -60 mV), som kan hjælpe med at danne gigaseal. Kompensere mikropipettens forbigående kapacitive strøm.
- Hvis forseglingen er> 1 GΩ og stabil (som vist i softwaregrænsefladen), skal du anvende en kort og stærk sug for at bryde cellemembranen. Anvend ikke kompensation for seRies modstand og cellens kapacitans.
- Umiddelbart efter opnåelse af en vellykket helcellekonfiguration anbringes et 10 mV hyperpolariserende trin (5 spor med minimale tidsintervaller, 20 ms varighed, signalprøve ved 20 kHz) fra et holdpotentiale på -60 mV.
- Skift spændingstilstanden til nulstrømstilstanden og markér aflæsningerne fra softwareinterfacet eller udfør en gapfri optagelse (10-60 s) for cellens membranpotentialelæsninger.
- Skift hurtigt tilbage til og forbliver i spændingsmodus og anvend spændingsprotokollerne i henhold til de planlagte eksperimenter og måle de aktuelle reaktioner. Subtraktion anvendes ikke på den intrinsiske lækstrøm under optagelserne.
- Overvåg stabiliteten af svarene under optagelserne eller de forskellige parametre i cellen. Brug f.eks. Kommandolinjen "Membran Test" til at kontrollere inputmodstanden (R i ), seriemodstanden (R s ) og cellenMembrankapacitans ( Cm ) i membranstesten ved "Cell" -tilstanden under omskiftningen af protokoller.
BEMÆRK: Pludselige dråber i indgangsresistens er normalt indicative for en løs patch, og en dramatisk stigning i serieresistensen kan være tegn på mikropipettespids tilstopning af de intracellulære organeller eller membranfragmenter. Under optagelsen skal du regelmæssigt overvåge mikropipettens placering for at kontrollere, om drift sker, hvilket kan medføre tab af plaster. Hvis drift er et problem, løft forsigtigt mikropipetten og patchencellen væk fra bunden af optagekammeret. Dette trin kan nogle gange føre til tab af patchen, i hvilket tilfælde det er nødvendigt at gentage hele-celle patch-clamp procedure.
5. Analyse af passive elektrofysiologiske egenskaber af celler
- Efter at have hentet dataene fra patch-clamp-eksperimenterne, skal du åbne de gapfri data i Clampfit-softwaren og måle det gennemsnitligeVærdi for hvilemembranpotentialet for hver celle. Alternativt kan du bruge værdien som markeret ned fra nulstrømspændingen i den aktuelle tilstand. Korrigér værdierne med det flydende krydspotentiale (12,4 mV i dette studie).
- Åbn dataene fra 10-mV hyperpolariseringstrinnet (AV), der er opnået fra en celle, måle strømforskellen før og under trin (Δ I- trin ) og beregne indgangsresistensen (R i ) ved hjælp af ligningen som:
- Beregn cellekapacitansen ( Cm , i enheden af pF) (brug de samme aktuelle data fra 10-mV hyperpolariseringstrinnet ved at integrere det samlede areal under membrankondensatorstrømmen under den indledende forbigående strømningsstrøm, der er hævet på spændingstrin-triggeren) For at opnå værdien af den samlede akkumulerede ladning (Q, i enheden af pA • ms) af cellen. Brug følgende ligning:
- Beregn værdien af seriemodstanden (R s ) for hver celle ved at montere den indledende forbigående strøm fra det 10-mV negative trin med en standard eksponentiel algoritme for at opnå tidskonstant henfaldsstrømmen ( T , i enheden af ms) og anvende Følgende ligning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne enzymatiske fordøjelsesprocedure til isolering af epithelceller fra rotte cauda-epididymiderne er en modificeret protokol fra vores tidligere undersøgelser 9 , 12 . Denne metode producerer en blanding af enkeltceller med over 90% levedygtighed og uden overfladeblærer eller opsvulmet cellevolumen. Den heterogene celleblanding består hovedsageligt af vigtigste celler, klare celler og basale celler, som vi har beskrevet tidligere 1. I denne protokol kan relativt rene prøver af epididymale epithelceller opnås ved at dyrke de primære dissocierede celler natten over på en petriskål for at tillade adhæsion af de ikke-epitelceller (såsom fibroblaster og glatte celler) på skålen som Vist i figur 1A (før høst). Celletyperne kan derefter foreløbigt skelnes af deres fænotyper under mikroskopetOg kategoriseres i overensstemmelse med deres specifikke passive membranegenskaber. I den dissocierede celleblanding er der en gruppe celler, der har mikrovilli eller en ru membran i den ene ende af deres overflademembran og polariserede cellulære indhold; Disse betegnes de primære celler eller de klare celler ( figur 1B , pile). Disse polariserede epithelceller kan ikke skelnes af deres morfologiske egenskaber, men kan identificeres i overensstemmelse med deres passive membranegenskaber og konduktansresponser opnået fra hele cellepatch-clamp-optagelserne. Den anden gruppe af celler er mindre i størrelse uden stereocilia i den ene ende af membranen og intet indlysende polariseret cellulært indhold; Disse betegnes nej-microvilli-cellerne og består hovedsagelig af basale celler ( figur 1B , asterisker).
De primære epitheliale hovedceller kan skelnes fra andre celler afIr forskellige passive membranegenskaber ( figur 2 ) og aktuelle mønstre ( figur 3 ) som svar på den anvendte spændingsprotokol ved anvendelse af helcelle-patch-klemmeteknikken. Cellers passive membranelektrofysiologiske egenskaber kan bidrage til at vurdere den oprindelige sundhedstilstand for individuelle celler og af celletyper. Et resumé af de enkelte dot plots af membrankapacitansen (Cm), input modstand (Rm) og membranpotentialet (V m) af hver celle gruppe er angivet i figur 2A. Der er ingen forskel i tidskonstanten for membrankapacitansen blandt de forskellige celletyper (~ 0,4 ms) (data er ikke demonstreret i dette manuskript). Ved hjælp af den lave EGTA K + -baserede opløsning er den gennemsnitlige målte membrankapacitans for de primære celler 9,4 0,5 pF (n = 32), og for de klare celler er 9,7 1,9 pF (n = 12). Membran kapacitansen afNej-mikrovilli-cellerne er 5,2 0,8 pF (n = 17), som er statistisk mindre end hovedpersonen og de klare celler membrankapacitans.
Indgangsresistensen af hovedceller i figur 2A (mellempanel) er 1,1 ± 0,2 GΩ (n = 32), og den af clearcellerne er 2,2 ± 0,8 GΩ (n = 12), hvilket er signifikant lavere (P <0,001) end Den for nej-microvilli-cellerne (8,9 ± 2,1 GΩ; n = 17). Som afbildet i figur 2A (højre panel) blev nul-strøm membranpotentiale (dvs. den hvilende membranpotentiale V m) målt kort efter oprettelse af helcellekonfigurationen og anvendt til sammenligning af grupperne efter korrektionen med væskeovergangspotential (12,4 mV). Celler blev rutinemæssigt badet i standard PSS og dialyseret med 0,1 mM EGTA K + -baseret pipetteopløsning indeholdende ATP. MEan-membranpotentialet for de primære celler er -26 ± 2 (n = 28), mellem -51 mV og +1 mV, og middelmembranpotentialet for de klare celler er -30 ± 3 mV (n = 10), Mellem-47 mV og -17 mV. No-microvilli-cellerne har det højeste middelmembranpotentiale med en værdi på -33 ± 5 mV (n = 17) mellem -63 mV og -13 mV.
De primære cellers lave indgangsresistens antyder, at der er iboende konduktanser i disse celler, men det kan tyde på lækning af tætningen mellem pipetten og patchcellemembranerne. For at imødegå denne bekymring udelukket vi først data fra disse celler med pludselige ændringer (der tyder på tætningslækage) af de elektriske egenskaber under optagelser. Derefter analyserede vi korrelationen mellem tætningsmodstanden ved en tærskel på 1 giga-ohm med indgangsresistensen som vist i figur 2B . Resultatet var en meget lav korrelationsværdi (R 2 ≈ 0,02). Dette tyder på, at tætningsmodstanden har ubetydelig indflydelse på inputmodstanden, og at de rapporterede passive elektriske egenskaber hos de forskellige celler (såsom de primære cellers lave indgangsresistens) er de iboende egenskaber af disse celler.
Figur 3A er den typiske nuværende reaktion registreret fra de primære celler under kvasi-fysiologiske tilstande med cellerne badende i normal fysiologisk saltopløsning (PSS), dialyseret med en lav EGTA K-baseret pipetteopløsning og stimuleret fra et holdpotentiale på -60 mV Til en serie på 500 ms testspændinger (fra -120 mV til +60 mV som angivet i indsatsen i figur 3B ). De to sporinger i figur 3C viser de typiske hvilemembranresponser af en identificeret hovedcelle under nulstrømsklemmen i nærvær af ellerFravær af ATP i pipetteopløsningen. I nærvær af ATP er hvilepotentialet relativt stabilt. Mens der blev observeret en progressiv hyperpolarisering, da celler blev dialyseret med en pipetteopløsning uden ATP. Det oprindelige hvilemembranpotentiale målt ved begyndelsen af celledialyse med pipetteopløsninger viser ingen signifikant forskel i cellerne med eller uden ATP ( Figur 3D ), hvilket tyder på, at de målte værdier stadig var intakte og minimalt påvirket af pipetteopløsningerne.
Figur 1 : Morfologiske træk ved isolerede rotte-cauda-epididymepitelceller. ( A, B ) Eksempler på epithelceller isoleret fra rotte cauda-epididymider før ( A ) og efter ( B ) genindhøstning af oveRnight kultur på parabolen forud for patch-clamp eksperimenter. Pile indikerer mikrovilli-cellerne, som hovedsagelig består af de primære celler og de klare celler. Stjerner angiver nej-microvilli-cellerne. Kun enkeltceller blev valgt til patch-clamp-optagelse. Skalestang = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Passive membranegenskaber af enkeltrotte-cauda-epididymepitelceller. ( A ) Punkter af de passive membranegenskaber af enkeltrotte-cauda-epididymepitelceller. Pipetteopløsning er lav EGTA K + -baseret, og badeopløsning er standard PSS. ( B ) Korrelationsanalyse af input resIstand med cellernes tætningsmodstand. NS : ingen signifikant forskel, * P <0,05, ** P <0,01 *** P <0,001 signifikant forskel versus passende kontroller ved hjælp af envejs ANOVA med Bonferroni post-hoc test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Typiske helcellestrømme i enkelt-epididymale hovedceller. ( A ) Typiske helcellestrømme registreret fra enkelt epididymale epithelceller optaget under kvasi-fysiologiske tilstande ved anvendelse af en pulsefremkaldende protokol som vist i indgangen til panal B. Den stiplede linje angav de nulstrømniveauer. ( B ) Strømspændingsforholdet for det aktuelle responsEs målt ved de angivne tidspunkter som i A. Data er middelværdien ± SEM på otte hovedceller fra mindst tre dyr. ( C ) Repræsentative sporinger af hvilemembranpotentialet hos de primære celler dialyseret med en pipetteopløsning enten med ATP (+ ATP) eller uden ATP (-ATP). ( D ) En stregdiagram, der ikke viser nogen signifikant forskel mellem det initiale hvilemembranpotentiale for + ATP og -ATP. Værdier er middel ± SEM målt på det tidspunkt, der er angivet i panel C. Tall i konsol i stængerne angiver antallet af testede celler fra mindst tre dyr. NS : ingen signifikant forskel. ( E ) Korrelationsanalyser af tætningsmodstanden og indgangsmodstanden for alle cellerne eller kun de primære celler i forhold til hvilemembraner målt ved nulstrømsklemmen kort efter hele celleindretningen og de nuværende størrelser målt ved hyperpolariserende Trin til -100 mV fra at holde pOTENTIELLE. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol gav den enzymatiske dispersion af rotte-cauda-epididymider konsekvent sunde epithelceller. Kvaliteten af de epididymale epithelceller til patch-clamp eksperimenterne er afhængig af et par kritiske trin i protokollen. For eksempel er centrifugeringen af celleblandingen ved en lav centrifugalkraft (30 xg) vigtig for fjernelse af spermatozoer og det epididymale luminale indhold; De epididymale epithelceller bliver usunde i nærvær af spermatozerne i cellekulturen. Desuden er dyrkning af den dissocierede celleblanding på en petriskål i adskillige timer et vigtigt trin for at fjerne fibroblasterne og de glatte muskelceller; De ikke-epitelceller klæber hurtigere på dyrkningsskålen og således forlader epithelcellerne i suspensionen, som kan høstes igen ved forsigtig aspiration. Desuden er kollagenasefordøjelse og triturering med en fin glaspipette de to vigtige trin til frigivelseEnkeltceller under celledissociationproceduren. Endelig er den enzymatiske fordøjelse af de epididymale celler kritisk for patch-clamp-eksperimentet, fordi underfordøjelse ved ineffektiv enzymatisk aktivitet eller overfordøjelse ved langvarig inkubation både kan forstyrre giga-ohm-tætningsdannelsen mellem pipetten og cellemembraner.
I celleblandingerne er cellerne i en større kolonneform med en ru membranbærende stereocili på den ene ende og polariseret fordeling af de intracellulære indhold formodentlig de primære celler eller de klare celler. Andre celler, der ikke har fremtrædende mikrovilli og polariseret celleindhold, kan omfatte basalcellerne og nogle celler fra immunsystemet. Ud over at beskrive grundlæggende morfologiske træk ved epididymale epithelceller anvender denne protokol hele cellepatch-klemmetoden til at måle den passive membranegenskab for hver celle. Disse membranegenskaber tillader indledende sondring afCelletyperne. Denne metode har nogle begrænsninger såsom udvaskning af det intracellulære indhold med pipetteopløsningen og elektroniske variationer i forhold til de cellulære arkitekturændringer under kontinuerlige optagelser 19 , 20 . Vi tilvejebringer kun de parametre, som vi målte umiddelbart efter etableringen af helcellekonfigurationen, hvilket afspejler de oprindelige, relativt intakte betingelser for cellerne. De passive membranegenskaber af hver celle indbefatter membrankapacitansen, indgangsresistensen og hvilemembranpotentialet.
Den specifikke kapacitans af cellemembraner er almindelig enighed om at være 1 uF / cm2 og dette gælder for celler (såsom immunceller og neuroner) med begrænset foldning på deres cellulære membraner 16, 18. Den specifikke kapacitansekonstant har imidlertid tendens til at være større for cellerne wI mere komplekse, cellulære arkitekturer, som epithelcellerne, der har mange cellulære membranfoldninger i forskellige rum. Rapporter indikerer, at MDCK epithelialcellelinieværdierne er 4 μF / cm 2 og 3 μF / cm 2 for henholdsvis den apiske og basale membranspecifikke kapacitans, henholdsvis 17 . I den foreliggende undersøgelse, de målte gennemsnitlige membran capacitances er ~ 8 pF og ~ 12 pF for no-mikrovilli celler gruppe og den vigtigste celler og klar-lignende celler gruppe (dvs. mikrovilli-celler), hhv. Ved anvendelse af den specifikke kapacitans på 1 μF / cm 2 til vores beregninger er de anslåede celleoverfladearealer 500 μm 2 og 1.000 μm 2 for nej-mikrovilli-cellerne og mikrovilli-cellerne, hvilket svarer til diameteren på 13 μm og 18 um. Imidlertid er disse estimater større end forventet baseret på cellestørrelserne under mikroskopet, som er ~ 81, fig m og ~ 12 um for ingen-mikrovilli celler og mikrovilli-celler henholdsvis, og disse celler er omkring 2,4 uF / cm2 og 1,9 uF / cm2 hhv. Vores resultater tyder på, at membranlandskabet af nej-microvilli-celler er mere komplekst end mikroviruscellerne, hvilket er i overensstemmelse med deres sekretions- og transportfunktioner.
Den specifikke kapacitans af cellemembraner er almindelig enighed om at være 1 uF / cm2 og dette gælder for celler (såsom immunceller og neuroner) med begrænset foldning på deres cellulære membraner 16, 18. Den specifikke kapacitansekonstant har imidlertid tendens til at være større for celler med mere komplekse, cellulære arkitekturer, som epithelcellerne, som har mange cellulære membranfoldninger i forskellige rum. Rapporter indikerer, at MDCK epithelial cellelinieværdier er 4 μF / cm 2 og 3 μF / cm 2 17 . I den foreliggende undersøgelse, de målte gennemsnitlige membran capacitances er ~ 8 pF og ~ 12 pF for no-mikrovilli celler gruppe og den vigtigste celler og klar-lignende celler gruppe (dvs. mikrovilli-celler), hhv. Ved anvendelse af den specifikke kapacitans på 1 μF / cm 2 til vores beregninger er de anslåede celleoverfladearealer 500 μm 2 og 1.000 μm 2 for nej-mikrovilli-cellerne og mikrovilli-cellerne, hvilket svarer til diameteren på 13 μm og 18 um. Imidlertid er disse estimater større end forventet baseret på cellestørrelserne under mikroskopet, henholdsvis ~ 8 μm og ~ 12 μm for ikke-mikrovilli celler og mikrovilli-celler, og disse celler er bedre kompatible med en specifik kapacitansværdi 2 uF / cm2. Dette antyder, at membranlandskabet af epididymepitelceller er morE kompleks end andre celletyper, hvilket er i overensstemmelse med deres sekretions- og transportfunktioner.
I hele celleoptagelserne bidrog lækagekonduktansen over membranen og tætningen mellem membranen og pipetten både til de målte membranegenskaber. Forseglingen har en signifikant højere modstand end membranen, og den har således minimal indflydelse på målingerne af de passive membranegenskaber, såsom indgangsmodstanden og nulstrømsmembranpotentialet. I overensstemmelse med dette begreb resulterede korrelationsanalysen af tætningsmodstanden ved en tærskel på 1 giga-ohm imod indgangsresistensen af hver celle til en værdi på ~ 0,02, hvilket tyder på en meget svag indflydelse. Yderligere korrelationsanalyser af enten tætningsmodstanden eller indgangsresistensen i forhold til hvilemembranpotentialerne eller den aktuelle størrelse målt ved -100 mV gav også lave værdier for alle testede celler eller kun for de primære celler. Vores resultater deMonstre, at indgangsbestandigheden af de epididymale hovedceller og de klanglignende celler er signifikant lavere end nej-microvilli-cellerne, hvilket således tilvejebringer en foreløbig parameter for dommen for differentiering af celletyperne. Disse resultater tyder på, at den lave inputresistens i de primære celler er en egen fysiologisk egenskab af cellerne. De enkelte epithelceller har også forskellige nuværende mønstre som reaktion på de anvendte protokoller og de eksperimentelle betingelser. Vi observerede, at hver defineret celletype udviser unikke nuværende mønstre under den samme anvendte spændingsprotokol. En i figur 3 viste eksempel viser de typiske strømresponser optaget fra de vigtigste celler under kvasi-fysiologiske betingelser, som vi har rapporteret tidligere 9. De elektrofysiologiske egenskaber for hver specialiseret celletype er let differentierede (data er ikke vist i dette papir). Baseret på disse parametre,De forskellige celletyper kan groft kategoriseres i de primære celler, de klare celler og de ikke-mikrovilli celler, som beskrevet i resultaterne.
Indgangsresistensen er membranmodstanden som reaktion på det påførte potentielle trin (10 mV hyperpolariserende trin i dette studie) fremkaldt fra et holdpotentiale på -60 mV. Dette afspejler omfanget af åben kanalaktivitet som svar på det anvendte potentiale. I denne henseende indebærer en lav modstand en høj indre "lækage" konduktans af cellerne, mens en høj modstand indebærer lukkede kanaler. Den lave inputmodstandsværdi i hovedceller svarer til den fremtrædende membranledningsevne, mens de klare celler, der besidder en lille konduktans ved testmembranpotentialet, indebærer deres moderate konduktans under optagebetingelserne. Den signifikante høje indgangsresistens for nej-microvilli-cellerne indebærer, at de ikke har åbne kanaler i denne status. I nul-cuRrent klemme, er de gennemsnitlige hvile membranpotentialer af de målte isolerede epithelceller i intervallet 26-33 mV for de tre cellegrupper. Disse værdier er sammenlignelige med det rapporterede membranpotentiale (-30 mV) ved anvendelse af mikroelektrodefremgangsmåden 21 . Imidlertid varierer de målte hvilepotentialer bredt i individuelle celler (fra +3 mV til -63 mV) på trods af fraværet af spontane spidspotentialer. Denne variation kan afspejle samspillet mellem forskellige ionkanalaktiviteter i forskellige celletyper, såsom det koblede samspil mellem TRPV6- og TMEM16A-kanaler i de primære celler, som vi har rapporteret for nylig 9 . Det er værd at bemærke, at når celler blev dialyseret med ATP pipetten, observerede vi ingen spontane elektriske potentialer i de primære celler; Dette er i overensstemmelse med klassificeringen af epithelcellerne som ikke-spændende 4 . En progressiv hyperpolarisering, når cellerne blev dialyseret med piPette-opløsning uden ATP kan have afspejlet det gradvise udseende af en ATP-følsom kaliumstrøm. Det er blevet rapporteret, at de ATP-følsomme kaliumkanaler udtrykkes i Golgi-apparatet i de primære celler i rotteepididymis, og at udtømningen af den intracellulære ATP fører til aktiveringen af K ATP- kanalerne 14 , 22 . Denne observation tyder på, at optagelsen af ATP i pipetteopløsningen favoriserer de stabile fysiologiske betingelser for de epididymale hovedceller.
Hele celle patch-clamp teknikken er en veletableret metode, der almindeligvis bruges til at studere elektrofysiologi af excitable celler, såsom neuroner. I dette papir viste vi, at det også er et nyttigt redskab til karakterisering af bioelektriske egenskaber af ikke-excitable celler, såsom epithelceller. Desuden muliggør denne protokol funktionelle undersøgelser af primær isoleret epididymAl epithelceller for yderligere at belyse deres fysiologiske rolle i epididymis. Denne undersøgelse giver nogle foreløbige elektriske egenskaber af epithelcellerne isoleret fra rotte cauda epididymis for at hjælpe fremtidige undersøgelser af de fysiologiske opførsel af disse celler og deres underliggende biologiske relevans i epididymis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Christopher Antos for nyttige kommentarer til teksten. Dette arbejde blev støttet af startskud fra ShanghaiTech University tildelt Winnie Shum og med finansiering fra National Natural Science Foundation of China (NNSFC nr. 31471370).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices - Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices - Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , Elsevier. 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. , Springer. 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. , Humana Press. New Jersey. (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
