Yöntem makalesi
Sıçan kauda epididimidlerinden primer dissosiye epitel hücrelerinin elektriksel özelliklerini ölçmek için hücre izolasyonunu ve tam hücreli yama klemp kayıtlarını birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, primer epididimal epitel hücrelerinin işlevsel özelliklerinin araştırılmasına ve epididimin fizyolojik rolünün aydınlatılmasına izin verir.
Epididimis, sperm olgunlaşması ve üreme sağlığı için vazgeçilmez bir organtır. Epididimal epitel, moleküler ve morfolojik özelliklerde değil aynı zamanda fizyolojik özelliklerde de farklı olan karmaşık bağlanmış hücre tiplerinden oluşur. Bu farklılıklar, epididimal lümende post-testiküler sperm gelişimi için gerekli mikro ortamı birlikte kuran çeşitli işlevlerini yansıtmaktadır. Epididimal epitel hücrelerinin biyofiziksel özelliklerinin anlaşılması, hem fizyolojik hem de patofizyolojik koşullar altında sperm ve üreme sağlığında işlevlerini ortaya çıkarmak açısından önemlidir. Fonksiyonel özellikleri henüz tam olarak aydınlatılamamış olsa da, epididimal epitel hücreleri hücresel olayları ve tekli hücrelerin zar özelliklerini ölçmek için kullanılan bir araç olan patch-clamp tekniği kullanılarak incelenebilir. Burada, hücre izolasyonu ve mezaya tüm hücre yama-kelepçe kayıt yöntemlerini anlatacağızSıçan kauda epididimitlerinden primer dissosiye epitel hücrelerinin elektriksel özelliklerini kontrol edin.
Erkek üreme kanalındaki epididim, bir mozaik epitel hücresi tabakasıyla kaplı bir organtır. Diğer epitel dokularında olduğu gibi, epididimal epitelin çeşitli hücre tipleri, temel hücreler, berrak hücreler, bazal hücreler ve immünolojik ve lenfatik sistemlerdeki hücreler de dahil olmak üzere, uyumlu bir şekilde çalışırlar ve tüp ön hattında bariyer olarak işlev görürler. Sperm maturasyonu ve fizyolojisi için destekleyici hücreler 1 , 2 , 3 . Böylece, bu epitel hücreleri üreme sağlığında önemli bir rol oynamaktadır.
Epitelyal hücreler, voltaj kapıl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tüm hayvan deneyleri, yerel ve uluslararası gereklilikleri yerine getiren ŞangayTech Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülür.
1. Deney Hayvanları
2. Rat Cauda Epididimidlerinden Epitelyal Hücrelerin İzolasyonu
NOT: Aksi belirtilmedikçe, aşağıdaki adımlar, aseptik olmayan koşullar altında gerçekleştirilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sıçan kauda epididimitlerinden epitel hücrelerinin izolasyonu için tarif edilen enzimatik sindirim prosedürü önceki çalışmalarımızdan 9 , 12'deki modifiye edilmiş bir protokoldür. Bu yöntem% 90'ın üzerinde canlılığı olan ve yüzey kabarmaları veya şişmiş hücre hacmi olmayan tek hücreli bir karışım üretir. Heterojen hücre kanşımı, daha önce anlattığımız gibi esasen ana hücrelerden, berrak hücrelerden ve bazal hücrelerden ol.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu protokolde sıçan kauda epididimidlerinin enzimatik dağılımı sürekli olarak sağlıklı epitel hücreleri vermiştir. Yama-kelepçe deneyleri için epididimal epitel hücrelerinin kalitesi protokolde birkaç kritik adıma bağlıdır. Örneğin, düşük bir santrifüj kuvveti (30 xg) ile hücre karışımının santrifüjlenmesi, spermatozoa ve epididimal luminal içeriğin giderilmesi için önemlidir; Epididimal epitel hücreleri, hücre kültüründe spermatozoa varlığında sağlıksız hale gelir. Ek olarak, birkaç saat süreyle bir Petri kabında ayrış.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Metin hakkında faydalı yorumlar için Dr. Christopher Antos'a teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, ŞangayTech Üniversitesi'nden Winnie Shum'a verilen start-up finansmanı ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (NNSFC 31471370) finansman ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| < güçlü > AXON sisteminin enstrümanı< / güçlü > | |||
| Bilgisayar kontrollü amplifikatör | Moleküler Cihazlar - Axon | Multiclamp 700B yama-kelepçe amplifikatörü | |
| Dijital Toplama sistemi | Moleküler Cihazlar - Axon | Digidata 1550 dönüştürücü | |
| Mikroskop | Olympus | BX-61WI | |
| Mikromanipülatör | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Kayıt odası ve hat içi Isıtıcı | Warner Instruments | TC-324C | |
| HEKA sisteminin aleti | |||
| Yama Kelepçesi amplifikatörü | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB çift | |
| Mikroskop | Olympus | IX73 | |
| Mikromanipülatör | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Kayıt odası ve hat içi Isıtıcı | Warner Instruments | TC-324C | |
| Diğer Alet | |||
| Mikropipet Çektirme | Sutter Aleti | P-1000 | |
| Kayıt Odası | Warner Instruments | RC-26G veya ev yapımı oda | |
| Filamentli borosilikat kılcal cam | Sutter Enstrümanı / Harvard Aparatı | BF150-86-10 | |
| Titreşim izolasyon tablosu | TMC & nbsp; | 63544 | |
| Dijital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| izolasyon için reaktifler< / güçlü > | |||
| RPMI 1640 orta | Gibco | 22400089 | |
| Penisilin / Streptomisin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Kollajenaz I | Sigma | C0130 | |
| Kollajenaz II | Sigma | C6885 | |
| 5-&alfa; -dihidrotestosteron | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal sığır serumu | oğlak | FBS-12A | |
| Mikropipet iç çözeltileri (K+ bazlı çözelti) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/çeşitli | V900068 | |
| MgCl2 ve orta nokta; 6H2O, 2mM | Sigma/çeşitli | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/çeşitli | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/ çeşitli | V900477 | |
| K-glukonat, 100mM | Sigma / çeşitli | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma / Çeşitli | A9187 | |
| < güçlü > Standart harici kayıt fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) < / güçlü > | |||
| NaCl, 140mM | Sigma / çeşitli | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma / çeşitli | V900068 | |
| CaCl2,< / sub> 2.5mM | Sigma / çeşitli | V900266 | |
| MgCl 2< / sub> & middot; 6H < sub > 2 < / sub>O, 1.2mM | Sigma / çeşitli | M2393 | |
| NaH < sub > 2 < / sub>PO4, 1.2mM | Sigma / çeşitli | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma / çeşitli | V900477 | |
| Glikoz, 10mM | Sigma / çeşitli | V900392 | |
| pH ayarlaması için< / güçlü > | |||
| NaOH | Sigma / çeşitli | V900797 | Saflık > =% 97 |
| KOH | Sigma / çeşitli | 60371 | Saflık > =% 99.99 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste