Записи цельного клеточного зажима с изолированными первичными эпителиальными клетками от эпидидимиса

Summary

Мы представляем протокол, который объединяет изоляцию клеток и запись цельноклеточного патч-зажима для измерения электрических свойств первичных диссоциированных эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы. Этот протокол позволяет исследовать функциональные свойства первичных эпидидиальных эпидиальных клеток для дальнейшего выяснения физиологической роли эпидидимиса.

Abstract

Эпидидимис является важным органом для созревания спермы и репродуктивного здоровья. Эпидидиальный эпителий состоит из сложно связанных типов клеток, которые отличаются не только молекулярными и морфологическими особенностями, но и физиологическими свойствами. Эти различия отражают их разнообразные функции, которые вместе создают необходимую микросреду для развития постпикулярных сперматозоидов в эпидидимальном просвете. Понимание биофизических свойств эпидидиальных эпителиальных клеток имеет решающее значение для выявления их функций в области спермы и репродуктивного здоровья как в физиологических, так и в патофизиологических условиях. Хотя их функциональные свойства еще не полностью выяснены, эпидидиальные эпителиальные клетки могут быть изучены с использованием метода патч-зажима, инструмента для измерения клеточных событий и мембранных свойств отдельных клеток. Здесь мы описываем методы изоляции ячеек и записи патч-зажима цельной ячейки в meaЧто электрические свойства первичных диссоциированных эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы.

Introduction

Эпидидимом в мужском репродуктивном тракте является орган, облицованный слоем эпителиальных клеток мозаики. Как и в других эпителиальных тканях, различные клеточные типы эпидидиального эпителия, включая основные клетки, прозрачные клетки, базальные клетки и клетки иммунологических и лимфатических систем, работают согласованным образом, чтобы действовать как барьер на фронте трубочки и как Поддерживающие клетки для созревания спермы и физиологии ^{1 , 2 , 3} . Таким образом, эти эпителиальные клетки играют важную роль в репродуктивном здоровье.

Эпите....

Protocol

Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному уходу и использованию животных Университета Шанхая, которые отвечают местным и международным требованиям.

1. Экспериментальные животные

1. Используйте взрослых самцов крыс Sprague-Dawley (~ 300-450 г) в возрасте 8-12 недель. В этом возрасте у крыс сперма попала в кауда эпидидимиды.

2. Выделение эпителиальных клеток из крысиных эпидадимидов

ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги выполняются в неасептических условиях, если не указано иное.

1. Подготовка ин....

Results

Описанная процедура ферментативного расщепления для выделения эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы представляет собой модифицированный протокол из наших предыдущих исследований ^{9 , 12} . Этот метод дает смесь одиночных клеток с более чем 90% жизнеспособностью и без поверхностных волдырей или объема набухших клеток. Гетерогенная клеточная смесь состоит главным образом из основных клеток, прозрачных клеток и базальных кл.......

Discussion

В этом протоколе ферментативная дисперсия эпидидимидов кауды крысы последовательно давала здоровые эпителиальные клетки. Качество эпидидиальных эпителиальных клеток для экспериментов с патч-зажимами зависит от нескольких критических шагов в протоколе. Например, центрифугирование клеточной смеси при низкой центробежной силе (30 мкг) важно для удаления сперматозоидов и содержимого эпидидимального просвета; Эпидидиальные эпителиальные клетки становятся нездоровыми в присутствии сперматозоидов в клеточной культуре. Кроме то.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B патч-клэмп усилитель
Цифровая система сбора данных	Молекулярные устройства - Axon	Digidata 1550 преобразователь
Микроскоп	Olympus	BX-61WI
Микроманипулятор	Sutter Instruments	MPC-325
Записывающая камера и встроенный нагреватель	Warner Instruments	TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp усилитель	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB двойной
микроскоп	Olympus	IX73
Микроманипулятор	Sutter Instruments	MPC-325
Записывающая камера и встроенный нагреватель	Warner Instruments	TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Записывающая камера	Warner Instruments	RC-26G или самодельная камера
Боросиликатное капиллярное стекло с нитью накала	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
Виброизоляционный стол	TMC	63544
Цифровой камаре	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
сильно>Реагенты для выделения
RPMI 1640 средний	Gibco	22400089
пенициллин/стрептомицин	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Коллагеназа I	Sigma	C0130
Коллагеназа II	Sigma	C6885
5-&альфа;-дигидротестостерон	Medchemexpress	HY-A0120
Фетальная бычья сыворотка	Козерог	FBS-12A
<сильно>Микропипетки внутренние растворы (раствор на основе К+) (pH 7,2, 280-295 мОсм)
KCl, 35 мМ	Sigma/различные	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/различные	M2393
EGTA, 0,1mM	Sigma/различные	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/ различные	V900477
K-глюконат, 100mM	Sigma/различные	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/различные	A9187
Стандартный внешний регистрирующий физиологический раствор соли (PSS) (pH 7,4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/различные	V900058
KCl, 4,7mM	Sigma/различные	V900068
CaCl2, 2,5mM	Sigma/различные	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1,2mM	Sigma/различные	M2393
2PO4, 1,2mM	Sigma/различные	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/различные	V900477
Глюкоза, 10mM	Sigma/различные	V900392
<сильные>Для регулировки pH
NaOH	Sigma/различные	V900797	чистота >=97%
KOH	Sigma/различные	60371	чистота >=99.99%