Summary
Мы представляем протокол, который объединяет изоляцию клеток и запись цельноклеточного патч-зажима для измерения электрических свойств первичных диссоциированных эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы. Этот протокол позволяет исследовать функциональные свойства первичных эпидидиальных эпидиальных клеток для дальнейшего выяснения физиологической роли эпидидимиса.
Abstract
Эпидидимис является важным органом для созревания спермы и репродуктивного здоровья. Эпидидиальный эпителий состоит из сложно связанных типов клеток, которые отличаются не только молекулярными и морфологическими особенностями, но и физиологическими свойствами. Эти различия отражают их разнообразные функции, которые вместе создают необходимую микросреду для развития постпикулярных сперматозоидов в эпидидимальном просвете. Понимание биофизических свойств эпидидиальных эпителиальных клеток имеет решающее значение для выявления их функций в области спермы и репродуктивного здоровья как в физиологических, так и в патофизиологических условиях. Хотя их функциональные свойства еще не полностью выяснены, эпидидиальные эпителиальные клетки могут быть изучены с использованием метода патч-зажима, инструмента для измерения клеточных событий и мембранных свойств отдельных клеток. Здесь мы описываем методы изоляции ячеек и записи патч-зажима цельной ячейки в meaЧто электрические свойства первичных диссоциированных эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы.
Introduction
Эпидидимом в мужском репродуктивном тракте является орган, облицованный слоем эпителиальных клеток мозаики. Как и в других эпителиальных тканях, различные клеточные типы эпидидиального эпителия, включая основные клетки, прозрачные клетки, базальные клетки и клетки иммунологических и лимфатических систем, работают согласованным образом, чтобы действовать как барьер на фронте трубочки и как Поддерживающие клетки для созревания спермы и физиологии 1 , 2 , 3 . Таким образом, эти эпителиальные клетки играют важную роль в репродуктивном здоровье.
Эпителиальные клетки, как правило, рассматриваются как невосприимчивые клетки, которые неспособны генерировать все или ничтожные потенциалы действия в ответ на деполяризующие стимулы из-за отсутствия каналов Na + или Ca 2+ с напряжением 4 , 5 . Однако эпителиальные клетки экспрессируют uniНаборов ионных каналов и транспортеров, которые регулируют их специализированные физиологические роли, такие как секреция и транспортировка питательных веществ 6 . Поэтому различные эпителиальные клетки обладают характерными электрическими свойствами. Например, основные клетки экспрессируют CFTR для переноса жидкости и хлора и экспрессируют TRPV6 для реабсорбции кальция, тогда как прозрачные клетки экспрессируют V-АТФазу протонового насоса для люминальной подкисления 1 , 7 , 8 , 9 . Сообщалось о некоторых перевозчиках и ионных каналах, которые регулируют физиологические особенности эпидиальных эпителиальных клеток, но функциональные свойства эпидиальных эпидиальных клеток в значительной степени еще не поняты 10 , 11 , 12 , 13 .
белыйOle-cell patch-clamp - это хорошо зарекомендовавший себя метод для изучения внутренних свойств как возбудимых, так и невосприимчивых клеток, и особенно полезен для изучения функций прежде всего диссоциированных клеток в образцах гетерогенных клеток; Напряжение-зажим используется для измерения пассивных свойств мембраны и ионных токов отдельных ячеек 14 , 15 . Пассивные свойства мембраны включают входное сопротивление и емкость. Первый параметр указывает на внутреннюю проводимость мембраны, в то время как последняя подразумевает площадь поверхности клеточной мембраны (фосфолипидный бислой, где расположены ионные каналы и транспортеры, который служит в качестве тонкого изолятора, разделяющего внеклеточные и внутриклеточные среды). Мембранная емкость прямо пропорциональна площади поверхности клеточной мембраны. Вместе с сопротивлением мембраны, отражаемым входным сопротивлением, постоянная времени мембраны, wПоказывает, насколько быстро потенциал клеточной мембраны реагирует на поток токов ионного канала, можно определить. В связи с этим, комбинируя текущие характеристики отклика от серии этапов напряжения, применяемых к клеткам, определяются биофизическая кинетика и свойства клеток 15 , 16 , 17 , 18 .
В настоящей статье мы описываем процедуры выделения эпителиальных клеток из эпидидимиса кауды крысы и шаги для измерения мембранных свойств различных типов клеток в диссоциированной клеточной смеси с использованием цельноклеточного пластыря. Мы показываем, что основные эпидидимальные клетки проявляют отличные мембранные электрофизиологические свойства и что проводимости можно легко идентифицировать из других типов клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному уходу и использованию животных Университета Шанхая, которые отвечают местным и международным требованиям.
1. Экспериментальные животные
- Используйте взрослых самцов крыс Sprague-Dawley (~ 300-450 г) в возрасте 8-12 недель. В этом возрасте у крыс сперма попала в кауда эпидидимиды.
2. Выделение эпителиальных клеток из крысиных эпидадимидов
ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги выполняются в неасептических условиях, если не указано иное.
- Подготовка инструментов для вскрытия и реагентов
- Дезинфицируйте инструменты для вскрытия путем погружения в 70% этанола и дайте им высохнуть на воздухе.
- Включите нагревательную ванну (32 ° C); Подготовьте и предварительно подогрейте 500 мл 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) с добавлением 1% (об. / Об.) Антибиотика(100 мкг / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) и помечены как «RPMI (+ P / S 1: 100)». Выполните этот шаг на чистой рабочей станции с контролируемым воздушным потоком.
- Приготовление и предварительное нагревание 1 × 500 мл модифицированной среды Ивальсона (IMDM), содержащей незаменимые аминокислоты (0,1 мМ) и пирувата натрия (1 мМ), и дополненную 5-α-дигидротестостероном (1 нМ), 10% эмбриональной бычьей Сыворотка, 1% (об. / Об.) Антибиотиков (100 ед. / Мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) и помечены как «Full-IMDM». Создавайте аликвоты по 50 мл и герметизируйте парафильмом; Хранить при температуре 4 ° C. Используйте асептические условия.
- Подготовьте раствор для расщепления фермента коллагеназы путем растворения коллагеназы типа I и коллагеназы типа II в RPMI (+ P / S 1: 100), что приводит к 1 мг / мл каждой коллагеназы в растворе. Фильтруют через мембрану 0,22 мкм и маркируют как «раствор коллагеназы». Хранить при комнатной температуре (RT) до использования. Отрегулируйте объем раствора на основе ферментаПо весу фермента; Минимальный объем, необходимый для обоих кауда-эпидидимидов у одной крысы, составляет 2 мл.
- Заполните 35-миллиметровое блюдо RPMI (+ P / S 1: 100).
- Рассечение эпидидимидов кауды крысы
- Жертвуйте животным либо с помощью пентобарбитала натрия 85 мг / кг внутрибрюшинно, либо с использованием камеры изофлюрана до тех пор, пока животное не ответит на раздражение хвоста; Следует за цервикальной дислокацией.
- Дезинфицируйте нижнюю часть живота, протирая 70% этанолом, осторожно подтолкните два семенника к нижней части живота, а затем откройте нижний живот около мошонки.
- Возьмите эпидидимальный жир, вырежьте все репродуктивные органы (яички, эпидидимиды и семявыносящие семена) и погрузите в блюдо с RPMI (+ P / S 1: 100).
- Перенесите репродуктивные органы в блюдо с RPMI (+ P / S 1: 100) на асептическую рабочую станцию.
- Вырезать кауда-эпидидимиды из соединительных и жировых тканей и эпиДидимальная капсула. Поместите один эпидидимис с ~ 0,2 мл раствора коллагеназы в пробирке объемом 1,5 мл. Проведите этот шаг на чистой рабочей станции с контролируемым потоком воздуха.
- Диссоциация отдельных клеток из крысиных кауда-эпидидимидов
- Разрежьте эпидидимиды в растворе коллагеназы, используя тонкие ножницы, пока ткань не станет пастообразной жидкостью. Промойте ножницы осторожно с остальным (~ 0,8 мл) раствором фермента в пробирке 1,5 мл.
- Поместите трубку на металлический термомиксер в течение 30 мин при 37 ° С со скоростью встряхивания 1000 об / мин.
- Центрифугируйте смесь фермент-ткань при 30 мкг при комнатной температуре в течение 3 мин и декантируйте липкий супернатант, который содержит в основном сперму.
- Ресуспендируют гранулу в 1 мл Full-IMDM для гашения всей ферментативной активности. Перенесите клеточную суспензию в 50 мл пробирку, содержащую 49 мл RPMI (+ P / S 1: 100).
ПРИМЕЧАНИЕ. Необязательно фильтруйте клеточную суспензию через сетчатую мембрану 100 мкм с постоянным тритуратомЧтобы избежать крупных, клеточных агрегатов. Однако не используйте сетчатый фильтр, если необходима клеточная суспензия для выращивания монослоев клеток. - Центрифугировать клеточную смесь при 30 мкг при комнатной температуре в течение 10 мин; Декантируют супернатант.
- Ресуспендируют гранулу в 1 мл Full-IMDM с нежным растиранием в течение по меньшей мере 5 минут для диссоциации отдельных клеток из ферментативно обработанных смесей эпидидимальной ткани.
- Отделение эпителиальных клеток из других клеток в асептических условиях
- Культуру клеточной суспензии на 10 см чашке Петри, содержащей полный IMDM, в течение по меньшей мере 8 ч или в течение ночи, в инкубаторе при 32 ° С в 5% СО 2 .
- Приготовьте стерильные покровные стекла заранее путем погружения в 100% -ный спирт. Воздух сушат и окунают в небольшой объем культуральной среды. Поместите покровные стекла в 6 см культуральные чашки или в одиночные лунки 24-луночного планшета.
- На следующее утро собирайте диссоциированные эпителиальные клетки, аккуратно собирая клеточную суспензиюSion из чашки Петри, которая состоит в основном из эпителиальных клеток. Центрифугируют клеточную суспензию при 30 мкг при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем декантируют супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в ~ 2 мл Full-IMDM.
- Вылейте 0,2 мл собранной суспензии клеток в центр каждого стерильного покровного стекла.
- Пусть клеточная суспензия оседает в капельке жидкости в течение по меньшей мере 10 минут, чтобы клетки могли свободно прилипать к покровным стеклам. Тщательно добавьте 1 мл Full-IMDM на краю 10 см чашки или 0,3 мл Full-IMDM в каждую лунку 24-луночного планшета; Не беспокоить клетки.
- Держите изолированные одиночные клетки в покровных стеклах в инкубаторе при 32 ° C в 5% CO 2 до тех пор, пока эксперименты с патч-зажимами не будут выполнены.
3. Решения для записи и микропипетки
ПРИМЕЧАНИЕ. Для экспериментов с патч-зажимами используйте химикаты и решения наилучшего качества.
- Подготовка запасных растворов
- Автоклавируйте все бутылки для хранения запасов и отфильтровывайте все исходные растворы (за исключением коррозионных растворов) и фильтруйте через мембраны 0,22 мкм перед использованием.
- Предварительно подготовьте все запасные растворы при комнатной температуре и храните при 4 o C: 5 М NaCl; 1 М KCl; 100 мМ MgCl 2 ; 100 мМ CaCl 2 ; 200 мМ NaH 2 PO 4 ; 100 мМ ЭГТА (pH 7,0 с КОН). Обрабатывать 5 М NaOH, 1 M HCl и 1 M KOH в качестве агрессивных растворов.
- Подготовка стандартного внешнего физиологического раствора соли (PSS)
- Теплые запасы раствора RT в утренние часы записи патч-зажим.
- Внесите ингредиенты из каждого запаса в соответствии с желаемым конечным объемом, за исключением CaCl 2 , например, для приготовления 500 мл PSS: 140 мМ NaCl = 14 мл 5 М; 5 мМ KCl = 2,5 мл 1 М; 1,2 мМ MgCl 2 = 6 мл 100 мМ; 1,2 мМ NaH 2 PO 4 = 3 мл 200 мМ.
- Добавить двойной-дистиллированной воды (ddH 2 O) до конечного объема 400 мл и уравновешивают.
- Взвешивают 0,9 г глюкозы и 1,19 г HEPES и полностью растворяют в смеси растворов.
- Добавьте при перемешивании смесь CaCl 2 (2,5 мМ = 12,5 мл 100 мМ).
- Добавьте до 99% от конечного объема.
- Отрегулируйте рН до 7,4, используя NaOH или HCl.
- Проверьте осмолярность и отрегулируйте с помощью 5 М NaCl или глюкозы, если необходимо.
- Добавить ddH 2 O до конечного объема 500 мл в цилиндре.
- Подготовка внутренних растворов микропипетки (низкие растворы на основе EGTA K + )
- Взвешивают или пипетируют правильный объем реагентов из каждого запаса в соответствии с желаемым конечным объемом и концентрацией, например, для приготовления внутриклеточного раствора на 50 мл с низким содержанием EGTA K + до объема 30 мл ddH 2 O: 100 мМ K-глюконата = 1,17 г; 35 мМ KCl = 1,75 мл 1 М; 2 мМ MgCl 2 = 1 мл100 мМ; 0,1 мМ EGTA = 0,05 мл 100 мМ; 10 мМ HEPES = 0,072 г.
- Добавьте достаточное количество воды для ~ 95% конечного объема и позвольте раствору уравновешиваться при комнатной температуре. Убедитесь, что решение понятное.
- При постоянном перемешивании раствора отрегулируйте pH до 7.2 с помощью KOH.
- Взвесьте и добавьте 0,078 г Mg-ATP в раствор до полного растворения.
- Поместите раствор на лед и используйте небольшую аликвоту для измерения осмолярности; Как правило, решения измеряют ~ 290 mOsmol и не нуждаются в корректировке. Если осмолярность значительно отличается от 280-295 мОсмоль, подготовьте новое решение.
- Добавьте ddH 2 O в конечный объем.
- Разделите раствор на аликвоты объемом 500 мкл, фильтр с фильтром для шприца 0,2 мкм, плотно уплотните и сразу же сохраните при ≤ -20 ° C.
- В день эксперимента с использованием патч-зажима оттаивайте одну аликвоту внутриклеточного раствора на льду и продолжайте охлаждать во время эксперимента с зажимамиПредотвращать деградацию.
- Вытяните пипетки патча из стеклянных капилляров (в соответствии с руководством пользователя пипетки), чтобы получить размеры микропипетки с сопротивлением 5-10 М при заполнении внутриклеточным раствором.
4. Настройка эксперимента Patch-Clamp и установление конфигурации цельной ячейки с ячейками
- Настройка эксперимента по патч-зажимам
- Включите установочный патч (компьютер, компьютерный усилитель, дигитайзер и т. Д. ).
- Откройте программное обеспечение patch-clamp ( например, AXON pCLAMP10 или HEKA PatchMaster) и настройте протоколы для электрофизиологических записей. Установите фильтр для сигнала на низкий проход на 1-3 кГц и дигитайзер на 10-20 кГц.
- Включите камеру, микроманипулятор и источник света.
- Когда усилитель с компьютерным управлением включен, заземлите корпус экспериментатора, прикоснувшись руками к заземляющей установке патч-зажима,Прежде чем прикоснуться к головной части, чтобы защитить его от поражения электрическим током.
- Перенесите культуральные эпителиальные клетки на покровное стекло на записывающую камеру, заполненную 1 мл стандартного PSS при комнатной температуре. Аккуратно смените купальный PSS как минимум два раза, используя пипетку перед любыми экспериментами по патч-зажимам.
ПРИМЕЧАНИЕ. При необходимости, заполните систему перфузии стандартным PSS или другим внешним решением в соответствии с запланированным экспериментом. Перфузируйте записывающую камеру на микроскопе (RC-26G или RC-26GLP) с помощью PSS несколько раз со скоростью ~ 2 мл / мин до начала экспериментов с патч-зажимами. Убедитесь, что в системе перфузии нет пузырьков воздуха. - Просмотр и выбор ячеек под инвертированным микроскопом с использованием целей 10X и 40X, оснащенных дифференциальной оптической системой с контрастными помехами. Ищите большие одиночные изолированные ячейки для записи. Идентифицировать изолированные эпидидиальные эпителиальные клетки по их сферической форме с грубым мIcrovilli на одном конце мембран и поляризованное распределение внутриклеточного содержимого ( рис. 1 ).
- Используя 1 мл шприц (самодельную иглу неметаллического микрошара), заполните микропипетку внутренним раствором (с низким раствором EGTA K + , см. Шаг 3.3). Убедитесь, что в микропипетке нет пузырьков воздуха, что может увеличить сопротивление микропипетки. Используйте достаточное количество раствора, чтобы внутренний раствор погрузил в держатель микропипетки покрытый хлоридом серебряный проволочный электрод.
- Установите микропипетку в держатель электрода и нанесите небольшое положительное давление (~ 0,2 мл объема шприца). Поддерживайте низкое положительное давление до тех пор, пока не коснитесь клеточной мембраны на последующих этапах.
- Установление конфигурации целых ячеек с ячейками для записей
- Погрузите пипетку в раствор для ванны с максимальной скоростью микроманипулятора. Найти пипеткуНа экране, подключенном к цифровой камере; Замедлите скорость микроманипулятора до средневысотного режима.
- Быстро проверьте сопротивление микропипетки (5-10 МОм) с помощью команды интерфейса сбора данных ( например, «Мембранный тест» в системе AXON) путем применения шага напряжения ( например, 5 мВ на 100 мс), генерируемого с помощью компьютерного усилителя. Перейдите на новую микропипетку, если сопротивление значительно превышает этот диапазон.
- Начинайте движение вниз по объекту, установленному на микроскопе; Постепенно направляйте микропипетку к выбранной ячейке. Сначала сначала опускайте объектив, а затем опустите микропипетку в плоскость фокусировки, пока микропипетка не окажется над центральной поверхностью выбранной ячейки.
- Отмените потенциал соединения жидкости между пипеткой и растворами ванны до нуля, используя команду «смещение пипетки» в интерфейсе программного обеспечения командира программного обеспечения.
- Установите управляемый компьютером усилительИ к испытанию на напряжение и мембранный тест в режиме «Ванна».
- Тонкая фокусировка для более четкого обзора ячейки, затем постепенно опускайте микропипетку с помощью микроманипулятора с низкой средней скоростью.
- Когда микропипетка находится близко к ячейке (демонстрируется уменьшением тока при срабатывании команды мембранной проверки), немедленно снимите низкое положительное давление и примените слабое отрицательное давление (0,1 мл объема шприца), чтобы сформировать гигазальный (> 1 ГΩ) ,
- Контролируйте сопротивление с помощью теста мембраны. Если сопротивление> 500 МОм, но <1 ГΩ, примените отрицательный потенциал (обычно как потенциал удержания, который установлен на -60 мВ), что может помочь сформировать гигапазон. Компенсировать переходный емкостный ток микропипетки.
- Если уплотнение> 1 GΩ и стабильное (как показано в программном интерфейсе), примените короткое и сильное всасывание, чтобы сломать клеточную мембрану. Не применяйте компенсацию заРезистентности и емкости ячейки.
- Сразу же после достижения успешной конфигурации целых ячеек примените шаг гиперполяризации 10 мВ (5-трассировки с минимальными временными интервалами, длительность 20 мс, образец сигнала при 20 кГц) от удерживающего потенциала -60 мВ.
- Переключите режим напряжения в режим нулевого тока и отметьте показания с программного интерфейса или выполните запись без зазора (10-60 с) для показаний мембранного потенциала ячейки.
- Быстро переключайтесь обратно в режим напряжения и оставайтесь в режиме напряжения и применяйте протоколы напряжения в соответствии с запланированными экспериментами и измеряйте текущие ответы. Вычитание не применяется к внутреннему течению утечки во время записи.
- Контролируйте стабильность ответов во время записи или различные параметры ячейки. Например, используйте интерфейс команды «Membrane Test» для проверки входного сопротивления (R i ), последовательного сопротивления (R s ) и ячейки(C m ) в мембранном тесте в режиме «Cell» во время переключения протоколов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Внезапные падения входного сопротивления обычно указывают на свободный патч, и резкое увеличение сопротивления серии может указывать на засорение наконечника микропипетки внутриклеточными органеллами или фрагментами мембраны. Во время записи регулярно контролируйте местоположение микропипетки, чтобы проверить, не происходит ли дрейф, что может привести к потере патча. Если дрифт является проблемой, осторожно поднимите микропипетку и исправляющую ячейку со дна камеры записи. Этот шаг иногда может привести к потере патча, и в этом случае необходимо повторить процедуру цельного клеточного зажима.
5. Анализ пассивных электрофизиологических свойств клеток
- После получения данных из экспериментов с патч-зажимами, откройте данные без пробелов в программном обеспечении Clampfit и измерьте среднее значениеЗначение для потенциала покоя мембраны для каждой ячейки. В качестве альтернативы используйте значение, указанное ниже от напряжения нулевого тока в текущем режиме. Исправьте значения с потенциалом перехода жидкости (12,4 мВ в этом исследовании).
- Открыть данные из гиперполяризационного шага 10 мВ ( & Dgr ; v) , полученный из клетки, измерить текущую разницу до и во время стадии (Δ я шаг), и рассчитать входное сопротивление (R I) , используя уравнение как:
- Вычислите емкость ячейки (C m , в единицах pF) (используйте те же самые текущие данные с этапа гиперполяризации 10 мВ, объединив общую площадь под током мембранного конденсатора во время начального тока спада переходного процесса, поднятого на триггер ступени напряжения) Для получения значения общего накопленного заряда (Q, в единицах pA • ms) ячейки. Используйте следующее уравнение:
- Вычислите значение последовательного сопротивления (R s ) для каждой ячейки, установив исходный переходный ток с отрицательного шага 10 мВ со стандартным экспоненциальным алгоритмом, чтобы получить постоянный ток распада времени ( T , в единицах мс) и использовать Следующее уравнение:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанная процедура ферментативного расщепления для выделения эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы представляет собой модифицированный протокол из наших предыдущих исследований 9 , 12 . Этот метод дает смесь одиночных клеток с более чем 90% жизнеспособностью и без поверхностных волдырей или объема набухших клеток. Гетерогенная клеточная смесь состоит главным образом из основных клеток, прозрачных клеток и базальных клеток, как мы описали ранее 1 . В этом протоколе относительно чистые образцы эпидидиальных эпителиальных клеток могут быть получены путем культивирования первичных диссоциированных клеток в течение ночи на чашке Петри, чтобы обеспечить адгезию неэпителиальных клеток (таких как фибробласты и гладкие клетки) на блюде, поскольку Как показано на рис. 1А (до сбора урожая). Затем типы клеток могут быть предварительно выделены их фенотипами под микроскопомИ классифицируются в соответствии с их специфическими свойствами пассивной мембраны. В диссоциированной клеточной смеси имеется группа клеток, которые имеют микроворсинки или шероховатую мембрану на одном конце их поверхностной мембраны и поляризованное клеточное содержание; Они называются главными ячейками или ясными ячейками ( рис. 1В , стрелки). Эти поляризованные эпителиальные клетки неразличимы по морфологическим признакам, но могут быть идентифицированы в соответствии с их пассивными свойствами мембраны и реакциями проводимости, полученными из записей цельноклеточных патч-зажима. Другая группа клеток меньше по размеру без стереоцилий на одном конце мембраны и без видимого поляризованного клеточного содержимого; Они называются клетками без микровиллий и состоят в основном из базальных клеток ( фиг. 1В , звездочки).
Первичные эпителиальные основные клетки можно отличить от других клеток( Рис. 2 ) и рисунками тока ( рис. 3 ) в ответ на применяемый протокол напряжения с использованием метода цельноклеточного патч-зажима. Пассивные мембранные электрофизиологические свойства клеток могут помочь оценить начальное состояние здоровья отдельных клеток и групп клеток. Краткое описание отдельных точечных графиков мембранной емкости (C m ), входного сопротивления (R m ) и мембранного потенциала (V m ) каждой группы клеток приведено на рисунке 2A . Не существует разницы в постоянной времени для емкости мембраны между различными типами клеток (~ 0,4 мс) (данные не показаны в этой рукописи). Используя низкое решение EGTA K + , средняя измеренная емкость мембран для основных клеток составляет 9,4 0,5 пФ (n = 32), а для ячеек - 9,7 1,9 пФ (n = 12). Мембранная емкостьКлетки без микровиллий составляют 5,2 0,8 пФ (n = 17), что статистически меньше основной и прозрачной мембранных емкостей клеток.
Входное сопротивление основных ячеек на рисунке 2A (средняя панель) составляет 1,1 ± 0,2 GΩ (n = 32), а входное сопротивление ячеек составляет 2,2 ± 0,8 GΩ (n = 12), что значительно ниже (P <0,001), чем Клеток без микровилли (8,9 ± 2,1 ГΩ, n = 17). Как показано на рисунке 2A (правая панель), потенциал мембраны с нулевым током ( т. Е. Потенциал покоя мембраны V m ) измерялся вскоре после установления конфигурации целых ячеек и использовался для сравнения групп после коррекции с потенциалом жидкого спая (12.4 мВ). Клетки обычно плавали в стандартной PSS и диализовали с 0,1 мМ раствором пипетки EGTA K +, содержащим АТФ. МEan мембранный потенциал основных клеток составляет -26 ± 2 (n = 28), между -51 мВ и +1 мВ, а средний мембранный потенциал ячеистых клеток составляет -30 ± 3 мВ (n = 10), Между-47 мВ и -17 мВ. Не-микровиллиевые клетки обладают наивысшим средним мембранным потенциалом со значением -33 ± 5 мВ (n = 17), между -63 мВ и -13 мВ.
Низкое входное сопротивление основных клеток указывает на наличие в этих клетках собственных проводимостей, но это может указывать на утечку уплотнения между пипеткой и мембранами патч-клещей. Чтобы решить эту проблему, мы сначала исключили данные из этих ячеек с внезапными изменениями (указывающими на утечку уплотнения) электрических свойств во время записи. Затем мы проанализировали корреляцию между сопротивлением уплотнения на пороге 1 гига-ом с входным сопротивлением, как показано на рисунке 2B . Результатом было очень низкое значение корреляции (R 2 ≈ 0,02). Это говорит о том, что сопротивление уплотнению оказывает незначительное влияние на входное сопротивление и что сообщаемые пассивные электрические свойства различных ячеек (например, низкое входное сопротивление основных ячеек) являются внутренними свойствами этих клеток.
Рисунок 3A представляет собой типичный ток, регистрируемый из основных клеток в квазифизиологических условиях, с использованием ванн в нормальном физиологическом солевом растворе (PSS), диализованный с помощью раствора пипетки с низким содержанием EGTA K и стимулированный от удерживающего потенциала -60 мВ К серии испытательных напряжений 500 мс (от -120 мВ до +60 мВ, как указано во вставке на рис. 3В ). На двух рисунках на фиг.3C показаны типичные ответы покоящейся мембраны идентифицированной основной ячейки под нулевым токовым зажимом в присутствии илиОтсутствие АТФ в растворе пипетки. В присутствии АТФ потенциал покоя относительно стабилен. В то время как прогрессирующая гиперполяризация наблюдалась, когда клетки диализовали с раствором пипетки без АТФ. Первоначальный потенциал мембраны покоя, измеренный в начале клеточного диализа с помощью растворов пипетки, не обнаруживает существенной разницы в клетках с АТФ или без него ( рисунок 3D ), что указывает на то, что измеренные значения все еще остаются неизменными и минимально влияют на решения пипетки.
Рисунок 1 : Морфологические особенности изолированных эпидулиальных клеток эпителия крысы cauda. ( A, B ). Примеры эпителиальных клеток, выделенных из эпидидимидов кауды крысы до ( A ) и после ( B ) повторного сбора oveНочной культуры на блюде перед экспериментом с зажимами. Стрелки указывают на микроворсинки, которые в основном состоят из основных клеток и ячеистых клеток. Звездочки обозначают клетки без микровилли. Для записи патч-зажима были выбраны только отдельные ячейки. Шкала шкалы = 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Пассивные мембранные свойства клеток эпидидиальных эпителиальных клеток кауды одной крысы. ( A ) Точечные графики пассивных мембранных свойств эпителиальных клеток эпидидиальных клеток одной крысы cauda. Раствор пипетки является низким EGTA K +, а раствор для купания является стандартным PSS. ( B ) Корреляционный анализ входных данныхС сопротивлением уплотнения клеток. NS : нет существенной разницы, * P <0,05, ** P <0,01 *** P <0,001 Значительная разница против соответствующих контролей с использованием однонаправленного ANOVA с пост-hoc-тестом Bonferroni. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 : Типичные токи цельной ячейки в отдельных эпидидимальных основных клетках. ( A ) Типичные токи цельной ячейки, записанные из одиночных эпидидиальных эпителиальных клеток, записанных в квазифизиологических условиях с использованием протокола импульсного вызывания, как показано на вставке паналлы B. Пунктирная линия указывала уровни нулевого тока. ( B ) Отношение тока и напряжения от текущегоИзмеренные в указанные моменты времени, как в A. Данные представляют собой средства ± SEM из восьми основных клеток, по меньшей мере, из трех животных. ( C ) Репрезентативные трассировки потенциала покоящейся мембраны основных клеток, диализуемых с раствором пипетки, либо с АТФ (+ АТФ), либо без АТФ (-АТФ). ( D ) Гистограмма, не показывающая существенной разницы между первоначальным потенциалом мембранной мембраны + ATP и -ATP. Значения представляют собой средние значения ± SEM, измеренные в то время, которое указано на панели C. Числа в скобках в барах указывают количество тестируемых клеток, по меньшей мере, из трех животных. NS : нет существенной разницы. ( E ) Корреляционный анализ сопротивления уплотнения и входного сопротивления всех клеток или только основных клеток по сравнению с остальными мембранами, измеренными на зажиме с нулевым током вскоре после установления цельной ячейки и величинами тока, измеренными при гиперполяризационном Шаг до -100 мВ от удержания potential. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе ферментативная дисперсия эпидидимидов кауды крысы последовательно давала здоровые эпителиальные клетки. Качество эпидидиальных эпителиальных клеток для экспериментов с патч-зажимами зависит от нескольких критических шагов в протоколе. Например, центрифугирование клеточной смеси при низкой центробежной силе (30 мкг) важно для удаления сперматозоидов и содержимого эпидидимального просвета; Эпидидиальные эпителиальные клетки становятся нездоровыми в присутствии сперматозоидов в клеточной культуре. Кроме того, культивирование диссоциированной смеси клеток на чашке Петри в течение нескольких часов является важным шагом для удаления фибробластов и клеток гладкой мускулатуры; Неэпителиальные клетки быстрее прилипают на блюде культуры и, таким образом, оставляют эпителиальные клетки в суспензии, которые могут быть повторно собраны путем нежной аспирации. Кроме того, переваривание коллагеназы и растирание с помощью тонкой стеклянной пипетки являются двумя важными шагами для освобожденияОдиночных клеток во время процедуры диссоциации клеток. Наконец, ферментативное переваривание эпидидимальных клеток имеет решающее значение для эксперимента с патч-зажимами, потому что недостаточное усвоение при неэффективной ферментативной активности или чрезмерное переваривание путем длительной инкубации может нарушать образование гига-омного уплотнения между пипеткой и клеточными мембранами.
В клеточных смесях клетки в большей, столбчатой форме с грубой мембраной, несущей стереоцилии на одном конце, и поляризованное распределение внутриклеточного содержимого, по-видимому, являются основными клетками или прозрачными клетками. Другие клетки, которые не обладают заметными микроворсинами и поляризованными клетками, могут включать базальные клетки и некоторые клетки иммунной системы. В дополнение к описанию основных морфологических особенностей эпидидиальных эпителиальных клеток в этом протоколе используется метод цельноклеточного патч-зажима для измерения свойства пассивной мембраны каждой клетки. Эти свойства мембраны позволяют предварительно различатьТипы клеток. Этот метод имеет некоторые ограничения, такие как вымывание внутриклеточного содержимого раствором пипетки и электронные изменения в отношении модификаций клеточной архитектуры во время непрерывных записей 19 , 20 . Мы предоставляем только параметры, которые мы измерили сразу после установления конфигурации целых ячеек, которые отражают начальные, относительно неповрежденные состояния клеток. Пассивные мембранные свойства каждой ячейки включают мембранную емкость, входное сопротивление и потенциал покоящейся мембраны.
Конкретная емкость клеточных мембран, как правило, составляет 1 мкФ / см 2, и это справедливо для клеток (таких как иммунные клетки и нейроны) с ограниченной складчатостью на их клеточных мембранах 16 , 18 . Однако удельная постоянная емкости, как правило, больше для ячеек wС более сложными, клеточными архитектурами, такими как эпителиальные клетки, которые имеют много клеточных мембранных складок в отдельных отделениях. Отчеты показывают, что значения линий эпителиальных клеток MDCK составляют 4 мкФ / см 2 и 3 мкФ / см 2 для апикальной и базальной мембранных удельных емкостей, соответственно 17 . В настоящем исследовании измеренные средние мембранные емкости составляют ~ 8 пФ и ~ 12 пФ для группы клеток без микровилли и основных клеток и группы ячеистых клеток ( т.е. клеток микровиллий) соответственно. Используя удельную емкость 1 мкФ / см 2 для наших расчетов, расчетные площади поверхности клеток составляют 500 мкм 2 и 1000 мкм 2 для клеток без микровилли и клеток микроворсинок соответственно, что соответствует диаметрам 13 мкм и 18 мкм. Однако эти оценки больше, чем ожидалось, исходя из размеров ячеек под микроскопом, которые составляют ~ 81, м и ~ 12 мкм для клеток без микровилли и клеток микровиллиантов соответственно, и эти клетки составляют около 2,4 мкФ / см 2 и 1,9 мкФ / см 2 соответственно. Наши результаты показывают, что мембранный ландшафт клеток без микровиллий более сложный, чем мембранные клетки микрожидкостей, что согласуется с их функциями секреции и транспорта.
Конкретная емкость клеточных мембран, как правило, составляет 1 мкФ / см 2, и это справедливо для клеток (таких как иммунные клетки и нейроны) с ограниченной складчатостью на их клеточных мембранах 16 , 18 . Однако удельная постоянная емкости, как правило, больше для клеток с более сложными клеточными архитектурами, такими как эпителиальные клетки, которые имеют много клеточных мембранных складок в отдельных отделениях. Отчеты показывают, что значения линий эпителиальных клеток MDCK составляют 4 мкФ / см 2 и 3 мкФ / см 2 17 . В настоящем исследовании измеренные средние мембранные емкости составляют ~ 8 пФ и ~ 12 пФ для группы клеток без микровилли и основных клеток и группы ячеистых клеток ( т.е. клеток микровиллий) соответственно. Используя удельную емкость 1 мкФ / см 2 для наших расчетов, расчетные площади поверхности клеток составляют 500 мкм 2 и 1000 мкм 2 для клеток без микровилли и клеток микроворсинок соответственно, что соответствует диаметрам 13 мкм и 18 мкм. Однако эти оценки больше, чем ожидалось, исходя из размеров ячеек под микроскопом, составляют ~ 8 мкм и ~ 12 мкм для клеток без микровилли и микровиллианных клеток соответственно, и эти клетки лучше совместимы с удельной емкостью 2 мкФ / см 2 . Это говорит о том, что мембранный ландшафт эпидидиальных эпителиальных клетокКомплекс, чем другие типы клеток, что согласуется с их функциями секреции и транспортировки.
В записях целых клеток проводимость утечки через мембрану и уплотнение между мембраной и пипеткой способствовала измеренным свойствам мембраны. Уплотнение имеет значительно более высокое сопротивление, чем мембрана, и поэтому оно оказывает минимальное влияние на измерение свойств пассивной мембраны, таких как входное сопротивление и потенциал мембран с нулевым током. В соответствии с этим понятием корреляционный анализ сопротивления уплотнения на пороге 1 гига-ом против входного сопротивления каждой ячейки привел к значению ~ 0,02, что свидетельствует о очень слабом влиянии. Дальнейшие корреляционные анализы как сопротивления уплотнения, так и входного сопротивления по сравнению с потенциалами покоящейся мембраны или величины тока, измеренной при -100 мВ, также дали низкие значения для всех тестируемых клеток или только для основных клеток. Наши результатыMonstrate, что входное сопротивление основных эпидидимальных клеток и ячеистых клеток значительно ниже, чем клетки без микровилли, тем самым обеспечивая предварительный параметр для оценки дифференцирования типов клеток. Эти результаты показывают, что низкое входное сопротивление в основных клетках является внутренним физиологическим свойством клеток. Отдельные эпителиальные клетки также обладают разной структурой тока в ответ на применяемые протоколы и условия эксперимента. Мы наблюдали, что каждый определенный тип ячейки демонстрировал уникальные шаблоны тока по тому же протоколу примененного напряжения. Пример, показанный на рисунке 3, демонстрирует типичные ответы тока, записанные из основных ячеек в квазифизиологических условиях, как мы сообщали ранее 9 . Электрофизиологические характеристики каждого типа специализированных клеток легко дифференцируются (данные не показаны в этой статье). Основываясь на этих параметрах,Различные типы клеток могут быть грубо разделены на основные клетки, прозрачные клетки и клетки без микровиллий, как описано в результатах.
Входное сопротивление представляет собой сопротивление мембраны в ответ на приложенную потенциальную ступень (шаг гиперполяризации 10 мВ в этом исследовании), вызванный удерживающим потенциалом -60 мВ. Это отражает степень активности открытых каналов в ответ на прикладной потенциал. В связи с этим низкое сопротивление подразумевает высокую внутреннюю «утечку» проводимости клеток, в то время как высокое сопротивление подразумевает замкнутые каналы. Низкое значение входного сопротивления в основных ячейках соответствует заметной проводимости мембраны, тогда как прозрачные ячейки, которые обладают небольшой проводимостью при тестируемом мембранном потенциале, подразумевают их умеренную проводимость в условиях записи. Значительно высокое входное сопротивление не-микровиллинговых ячеек подразумевает, что у них нет открытых каналов в этом статусе. В нуле-куRrent, средний потенциал покоящихся мембран измеренных изолированных эпителиальных клеток находится в диапазоне 26-33 мВ для трех клеточных групп. Эти значения сопоставимы с сообщенным мембранным потенциалом (-30 мВ) с использованием метода микроэлектрода 21 . Однако измеренные потенциалы покоя широко варьируются в отдельных клетках (от +3 мВ до -63 мВ), несмотря на отсутствие спонтанных потенциалов спайка. Это изменение может отражать взаимодействие различных процессов ионного канала в различных типах клеток, таких как связанное взаимодействие каналов TRPV6 и TMEM16A в основных клетках, как мы недавно сообщали 9 . Стоит отметить, что когда клетки были диализованы с пипеткой АТФ, мы не наблюдали спонтанных электрических потенциалов в основных клетках; Это согласуется с классификацией эпителиальных клеток как невосприимчивость 4 . Прогрессивная гиперполяризация, когда клетки были диализованы с помощью piPette без АТФ, возможно, отразилось на постепенном появлении АТФ-чувствительного калиевого тока. Сообщалось, что АТФ-чувствительные калиевые каналы экспрессируются в аппарате Гольджи основных клеток крысиного эпидидимиса и что истощение внутриклеточного АТФ приводит к активации K ATP- каналов 14 , 22 . Это наблюдение позволяет предположить, что включение АТФ в раствор пипетки способствует устойчивым физиологическим условиям эпидидимальных основных клеток.
Метод цельноклеточного патч-зажима - это хорошо зарекомендовавший себя метод, который обычно используется для изучения электрофизиологии возбудимых клеток, таких как нейроны. В этой статье мы показали, что это также полезный инструмент для характеристики биоэлектрических свойств невозбудимых клеток, таких как эпителиальные клетки. Кроме того, этот протокол позволяет проводить функциональные исследования первичного изолированного эпидидимаАль-эпителиальных клеток, чтобы еще больше выяснить их физиологическую роль в эпидидимисе. Это исследование дает некоторые предварительные электрические свойства эпителиальных клеток, выделенных из крысиного кауда-эпидидимида, для помощи в дальнейших исследованиях физиологического поведения этих клеток и их базовой биологической значимости в эпидидимисе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Кристофера Антоса за полезные комментарии к тексту. Эта работа была поддержана начальным финансированием Университета Шанхая, присужденным Винни Шум, и финансированием Национального фонда естественных наук Китая (NNSFC № 31471370).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices - Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices - Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , Elsevier. 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. , Springer. 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. , Humana Press. New Jersey. (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
