Montage et suivi du développement de la communauté microbienne dans une plateforme de microwell Array
Summary
Le développement des communautés microbiennes dépend d'une combinaison de facteurs, y compris l'architecture environnementale, l'abondance des membres, les traits et les interactions. Ce protocole décrit un environnement synthétique et microfabricant pour le suivi simultané de milliers de communautés contenues dans les puits de femtolittes, où des facteurs clés tels que la taille de niche et le confinement peuvent être approchés.
Abstract
Le développement des communautés microbiennes dépend d'une combinaison de facteurs déterministes et stochastiques complexes qui peuvent modifier radicalement la répartition spatiale et les activités des membres de la communauté. Nous avons développé une plate-forme de micropuits qui peut être utilisée pour assembler et suivre rapidement des milliers de communautés bactériennes en parallèle. Ce protocole souligne l'utilité de la plate-forme et décrit son utilisation pour le suivi optique du développement de communautés simples à deux membres dans un ensemble de tableaux au sein de la plate-forme. Cette démonstration utilise deux mutants de Pseudomonas aeruginosa , une partie d'une série de mutants développés pour étudier la pathogénicité de la sécrétion de type VI. Les inserts chromosomiques des gènes mCherry ou GFP facilitent l'expression constitutive de protéines fluorescentes avec des longueurs d'onde d'émission distinctes qui peuvent être utilisées pour surveiller l'abondance et l'emplacement des membres de la communauté dans chaque micropuits. Ce protocole décrit un procédé détailléD pour assembler des mélanges de bactéries dans les puits du réseau et utiliser l'imagerie par fluorescence temporelle et l'analyse d'image quantitative pour mesurer la croissance relative de chaque population membre au fil du temps. L'ensemencement et l'assemblage de la plate-forme des micropuits, les procédures d'imagerie nécessaires à l'analyse quantitative des communautés microbiennes au sein du tableau et les méthodes qui peuvent être utilisées pour révéler les interactions entre les espèces d'espèces microbiennes.
Introduction
Les communautés microbiennes sont façonnées à la fois par des facteurs déterministes tels que la structure de l'environnement et les processus stochastiques associés à la mort cellulaire, à la division, à la concentration de protéines, au nombre d'organites et à la mutation 1 . Dans l'environnement naturel, il est presque impossible d'analyser l'impact individuel de ces influences sur la composition et l'activité de la communauté. Obscurcis par des structures naturelles et enterrés dans un milieu chimique et biologique, l'identification des membres de la communauté et la résolution de leur répartition spatiotemporelle dans l'environnement naturel sont extrêmement difficiles. Néanmoins, les efforts récents ont souligné l'importance de l'organisation spatiale sur la fonction communautaire et soulignent la nécessité de tenir compte de l'abondance et de l'organisation des membres dans les études en cours 2 , 3 , 4 .
IlEst clair que l'environnement chimique local ( c'est-à-dire la disponibilité des nutriments et des métabolites secondaires), la structure physique ( p. Ex., L' architecture du sol, les racines des plantes, les particules de l'océan ou les microvilles intestinales), la présence ou l'absence d'oxygène et l'introduction de Les espèces pathogènes affectent la composition, l'architecture et la fonction des communautés microbiennes 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Néanmoins, les techniques traditionnelles pour les cultures qui négligent de capturer ces facteurs continuent de prévaloir. La composition de la communauté ( par exemple, la présence d'espèces co-dépendantes), l'attachement physique, la concentration de la molécule de signalisation et le contact direct des cellules-cellules sont autant de facteurs importants pour façonner une communauté microbienne et peuvent être perdus dans cConditions culturelles conventionnelles. Ces propriétés sont difficiles à reproduire dans une culture liquide en vrac ou sur une plaque de gélose. La disponibilité de techniques microfluidiques, de micropatternation et de nanofabrication qui permettent la réplication des principales caractéristiques physiques et chimiques des environnements naturels a permis à de nombreux chercheurs de créer des communautés bactériennes pour étudier leurs interactions 12 , 13 , 14 et de développer des environnements synthétiques qui Imiter les conditions naturelles 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Ce protocole décrit une méthode pour fabriquer un dispositif de matrice de micropuits et fournit des procédures expérimentales détaillées qui peuvent être utilisées pour fonctionnerLes puits dans la matrice et la croissance des bactéries, à la fois en tant que colonies d'une seule espèce et dans les communautés multi-membres. Ce travail démontre également comment les bactéries modifiées pour produire des protéines rapporteurs fluorescentes peuvent être utilisées pour surveiller la croissance bactérienne dans les puits au fil du temps. Un tableau similaire a été présenté précédemment et a montré qu'il est possible de suivre la croissance des colonies à une seule espèce de Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) dans les micropuits. En modulant la taille du puits et la densité d'ensemencement, les conditions de départ de milliers d'expériences de croissance peuvent varier en parallèle pour déterminer comment les conditions d'inoculation initiales affectent la capacité des bactéries à se développer 21 . Le travail actuel utilise une version légèrement modifiée du réseau de micro-puits qui se construit sur les travaux précédents en permettant la comparaison simultanée de tableaux multiples et en utilisant un protocole expérimental plus robuste. Le tableau utilisé dans ce travail contient plusieurs sous-arborescences, ou tableau ensemBles, contenant des puits de différentes tailles, allant de 15 à 100 μm de diamètre, qui sont disposés à trois pas différents ( c.-à-d. 2x, 3x et 4x le diamètre du puits). Les matrices sont gravées en silicium et la croissance des bactéries ensemencées dans les réseaux de silicium est activée en scellant les tableaux avec une lamelle qui a été revêtue d'un gel d'agarose à infusion moyenne. Les mutants P. aeruginosa conçus pour étudier le système de sécrétion de type VI sont utilisés dans cette démonstration.
Les résultats présentés ici se basent sur l'objectif ultime d'analyser les communautés de plusieurs membres dans les réseaux de micropuits, permettant aux chercheurs de surveiller l'abondance et l'organisation des bactéries in situ tout en contrôlant et sondant l'environnement chimique. Cela devrait finalement donner un aperçu des «règles» qui régissent le développement communautaire et la succession.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présentait un périphérique de réseau de micropuits et des protocoles expérimentaux conçus pour permettre l'analyse par image de cellule animale à haut débit et à haute teneur du développement communautaire bactérien. Bien que la démonstration ait été axée sur l'étude des effets de la sécrétion de type VI médiée par le contact sur le développement de la communauté, les tableaux ont été conçus pour être flexibles et permettre l'étude d'une large gamme de communautés …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les matrices de micropuits ont été fabriqués et caractérisés au Centre pour la Division des installations pour les utilisateurs de Nanophase Materials Sciences, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Le soutien financier de ce travail a été fourni par l'intermédiaire du Fonds de recherche et de développement du directeur de laboratoire national Oak Ridge. Les auteurs souhaiteraient également remercier le J. Mougous Laboratory (Université de Washington, Seattle, WA) pour la fourniture de souches de P. aeruginosa utilisées dans ces études.
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
References
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity – The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van’t Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
