एक Microwell Array प्लेटफॉर्म के भीतर विधानसभा और माइक्रोबियल सामुदायिक विकास का ट्रैकिंग
Summary
माइक्रोबियल समुदाय का विकास कारकों के संयोजन पर निर्भर करता है, जिनमें पर्यावरणीय वास्तुकला, सदस्य बहुतायत, लक्षण, और बातचीत शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल में सिंथेटिक, माइक्रोफैब्रिकेटेड माहौल का वर्णन है, जिसमें फेट्टोलिटर कुओं में निहित हजारों समुदायों के साथ-साथ ट्रैकिंग शामिल हैं, जहां प्रमुख कारक जैसे कि आला आकार और कैद को अनुमानित किया जा सकता है।
Abstract
माइक्रोबियल समुदाय का विकास जटिल नियतात्मक और स्टोचस्टिक कारकों के संयोजन पर निर्भर करता है जो नाटकीय रूप से स्थानिक वितरण और समुदाय के सदस्यों की गतिविधियों को बदल सकते हैं। हमने एक माइक्रोवेल्ल सरणी प्लेटफार्म विकसित किया है जो समानांतर में हजारों बैक्टीरियल समुदायों को तेजी से इकट्ठा और ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल मंच की उपयोगिता को हाइलाइट करता है और मंच के भीतर सरणियों के एक टुकड़े के भीतर सरल, दो-सदस्यीय समुदायों के विकास की ऑप्टिकली निगरानी के लिए इसके उपयोग का वर्णन करता है। यह प्रदर्शन स्यूडोमोनस एरुजिनोसा के दो म्यूटेंट का उपयोग करता है, जो एक प्रकार की म्यूटेंट का हिस्सा है, जो कि टाइप वीस स्राक्रेशन पैथोजेनिकता का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। एमकेरी या जीएफपी जीन के क्रोमोसोमल सम्मिलन फ्लोरोसेंट प्रोटीनों की अलग-अलग अभिव्यक्ति की सुविधा प्रदान करते हैं, जिनके साथ अलग-अलग उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य होते हैं जिनका उपयोग समुदाय के सदस्य की बहुतायत और प्रत्येक माइक्रोवेवेल में स्थान की निगरानी के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एक विस्तृत मेथो का वर्णन करता हैसमय के साथ-साथ प्रत्येक सदस्य आबादी के सापेक्ष विकास को मापने के लिए समय-विलंब प्रतिदीप्ति इमेजिंग और मात्रात्मक छवि विश्लेषण का उपयोग करके बैरक्टीरिया के मिश्रण को सरणी के कुएं में एकत्रित करने के लिए और घ। Microwell प्लेटफार्म के बीजिंग और विधानसभा, सरणी के भीतर माइक्रोबियल समुदायों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक इमेजिंग प्रक्रियाएं, और उन तरीकों का उपयोग किया जा सकता है जो सूक्ष्मजीव प्रजातियों के क्षेत्र में बातचीत के बारे में सभी चर्चा करते हैं।
Introduction
माइक्रोबियल समुदायों का निर्धारण दोनों नियतात्मक कारकों से होता है, जैसे पर्यावरण की संरचना, और स्टेचैस्टिक प्रक्रियाएं, जो कोशिका मृत्यु, विभाजन, प्रोटीन एकाग्रता, ऑर्गेनेल की संख्या और उत्परिवर्तन 1 के साथ जुड़ी हुई हैं। प्राकृतिक वातावरण के भीतर, समुदाय संरचना और गतिविधि पर इन प्रभावों के व्यक्तिगत प्रभाव को पार्स करना लगभग असंभव हो सकता है। प्राकृतिक संरचनाओं द्वारा अदृश्य और रासायनिक और जैविक परिवेश में दफन किया गया, समुदाय के सदस्यों की पहचान करने और प्राकृतिक वातावरण के भीतर अपने आंतकमीय वितरण को हल करने के लिए बेहद चुनौतीपूर्ण है। फिर भी, हाल के प्रयासों ने सामुदायिक कार्यों पर स्थानिक संगठन के महत्व को रेखांकित किया है और वर्तमान में 2 , 3 , 4 के अध्ययन में सदस्य बहुतायत और संगठन दोनों के लिए खाते की आवश्यकता की ओर इंगित किया है।
यहयह स्पष्ट है कि स्थानीय रासायनिक पर्यावरण ( यानी पोषक तत्वों और माध्यमिक चयापचयों की उपलब्धता), भौतिक संरचना ( जैसे, मिट्टी वास्तुकला, पौधे की जड़ें, सागर कणों, या आंतों में माइक्रोवेलीली), ऑक्सीजन की मौजूदगी या अनुपस्थिति, और इसकी शुरूआत रोगजनक प्रजातियां, माइक्रोबियल समुदाय 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 के संयोजन, वास्तुकला और कार्य को प्रभावित करती हैं। फिर भी, संस्कृतियों के लिए परंपरागत तकनीकें जो इन कारकों पर कब्जा करने की उपेक्षा करते रहें हैं। सामुदायिक संरचना ( उदाहरण के लिए, सह-निर्भर प्रजातियों की उपस्थिति), शारीरिक लगाव, संकेत अणु एकाग्रता, और प्रत्यक्ष सेल-सेल संपर्क एक माइक्रोबियल समुदाय को आकार देने के लिए सभी महत्वपूर्ण कारक हैं और सी में खो जा सकता हैअनौपचारिक संस्कृति की स्थिति इन गुणों को थोक तरल संस्कृति में या एक एगर प्लेट पर दोहराना मुश्किल है। प्राकृतिक वातावरणों की मुख्य भौतिक और रासायनिक सुविधाओं की प्रतिकृति के लिए अनुमति देने वाले माइक्रोफ़्लुइडिक, माइक्रोप्रेट्रिंग और नैनोफैब्रिकेशन तकनीकों की उपलब्धता हालांकि, कई शोधकर्ताओं ने बैक्टीरियल समुदायों को उनके 12 , 13 , 14 इंटरैक्शन का अध्ययन करने और सिंथेटिक वातावरण विकसित करने के लिए सक्षम बनाया है प्राकृतिक परिस्थितियों की नकल 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 1 9 , 20
यह प्रोटोकॉल एक माइक्रोवेल्ल सरणी डिवाइस को तैयार करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है और विस्तृत प्रायोगिक प्रक्रियाओं को प्रदान करता है जो कि फ़ंक्शन चालू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसरणी में ई कुओं और जीवाणु बढ़ने के लिए, दोनों एकल-प्रजाति के उपनिवेशों और बहु-सदस्यीय समुदायों में। यह काम यह भी दर्शाता है कि समय समय पर कुओं के भीतर बैक्टीरिया की वृद्धि को मॉनिटर करने के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए बैक्टीरिया को संशोधित किया जा सकता है। एक समान सरणी को पहले प्रस्तुत किया गया था और दिखाया गया कि सूक्षोवालों में स्यूडोमोनस एरुगिनोसा ( पी। एरुजिनोसा) की एकल-प्रजाति के उपनिवेशों के विकास को ट्रैक करना संभव है। अच्छी तरह से आकार और सीडिंग घनत्व को संशोधित करके, हजारों विकास प्रयोगों की शुरुआती स्थितियों को समानांतर में अलग किया जा सकता है ताकि निर्धारित किया जा सके कि शुरुआती टीकाकरण की स्थिति 21 जीवाणुओं के बढ़ने की क्षमता को कैसे प्रभावित करती है। वर्तमान कार्य में माइक्रोवेल्ल सरणी का एक थोड़ा संशोधित संस्करण उपयोग होता है जो पिछले अरसे से कई सरणियों की तुलना करके और अधिक मजबूत प्रायोगिक प्रोटोकॉल का उपयोग करके सक्षम बनाता है। इस कार्य में उपयोग किए गए सरणी में एकाधिक सबरायर्स, या सरणी प्रतीत होता हैBles, विभिन्न आकार के कुओं युक्त, 15 से 100 मीट्रिक व्यास तक, जो कि तीन अलग पिचों ( यानी 2x, 3x और 4x बराबर व्यास) पर व्यवस्थित होता है। Arrays सिलिकॉन में etched हैं, और सिलिकॉन सरणियों में वरीयता वाले जीवाणुओं की वृद्धि एक माध्यमिक-युक्त agarose जेल के साथ लेपित किया गया है जो एक coverslip के साथ arrays सील द्वारा सक्षम किया गया है। पी। एरगिनोसा म्यूटेंट, जो कि टाइप VI स्राव प्रणाली का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, इस प्रदर्शन में उपयोग किया जाता है।
यहां प्रस्तुत परिणाम माइक्रोवेल्ल सरणियों के भीतर बहुसंख्यक समुदायों के विश्लेषण के अंतिम लक्ष्य की ओर बढ़ते हैं, जिससे शोधकर्ताओं ने रासायनिक पर्यावरण के नियंत्रण और जांच के दौरान बहुतायत और जीवाणुओं के संगठन की निगरानी कर सकी। अंत में "नियम" में अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए जो कि सामुदायिक विकास और उत्तराधिकार को नियंत्रित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में बैक्टीरिया समुदाय के विकास के उच्च-थ्रुपुट और उच्च-सामग्री लाइव-सेल इमेजिंग-आधारित विश्लेषण को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किए गए एक माइक्रोऑवेल सरणी डिवाइस और प्रायोगिक प्रोटोकॉल प्रस्तुत…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
माइक्रोवेल सरणियों को गढ़े और नैनोफस मैट्रिक्स साइंस के लिए सेंटर फॉर यूजर फीचर डिवीजन, बेसिक एनर्जी साइंस का कार्यालय, यूएस डिपार्टमेंट ऑफ एनर्जी इस काम के लिए वित्तीय सहायता ओक रिज नेशनल लेबोरेटरी डायरेक्टर रिसर्च एंड डेवलपमेंट फंड के जरिए प्रदान की गई थी। लेखक इन अध्ययनों में इस्तेमाल पी। एरुगिनोसा उपभेदों की आपूर्ति के लिए जे। माउगस लैबोरेटरी (वाशिंगटन विश्वविद्यालय, सिएटल, वाशिंगटन) का भी शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
References
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity – The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van’t Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
