Assemblea e monitoraggio dello sviluppo microbico della comunità all'interno di una piattaforma di array Microwell
Summary
Lo sviluppo delle comunità microbiche dipende da una combinazione di fattori, tra cui l'architettura ambientale, l'abbondanza dei membri, i tratti e le interazioni. Questo protocollo descrive un ambiente sintetico e microfabbricato per il monitoraggio simultaneo di migliaia di comunità contenute nei pozzetti di femtoliter, in cui si possono approssimare fattori chiave come la dimensione e il confinamento di nicchia.
Abstract
Lo sviluppo delle comunità microbiche dipende da una combinazione di fattori deterministici e stochastici complessi che possono alterare drasticamente la distribuzione spaziale e le attività dei membri della comunità. Abbiamo sviluppato una piattaforma di array microwell che può essere utilizzata per assemblare e monitorare rapidamente migliaia di comunità batteriche in parallelo. Questo protocollo evidenzia l'utilità della piattaforma e descrive il suo utilizzo per monitorare ottimamente lo sviluppo di semplici comunità a due componenti all'interno di un insieme di array all'interno della piattaforma. Questa dimostrazione utilizza due mutanti di Pseudomonas aeruginosa , parte di una serie di mutanti sviluppati per studiare la patogenicità della secrezione di tipo VI. Gli inserti cromosomici di geni mCherry o GFP facilitano l'espressione costitutiva di proteine fluorescenti con distinte lunghezze d'onda di emissione che possono essere utilizzate per monitorare l'abbondanza e la posizione del membro della comunità all'interno di ciascuna microssacca. Questo protocollo descrive un metodo dettagliatoD per l'assemblaggio di miscele di batteri nei pozzetti dell'array e utilizzando l'imaging di fluorescenza a tempo intervallo e l'analisi quantitativa delle immagini per misurare la crescita relativa di ciascuna popolazione membro nel tempo. La semina e l'assemblaggio della piattaforma microwell, le procedure di imaging necessarie per l'analisi quantitativa delle comunità microbiche all'interno dell'array e i metodi che possono essere utilizzati per rivelare le interazioni tra le specie di specie microbiche tutte discusse.
Introduction
Le comunità microbiche sono formate da fattori deterministici come la struttura dell'ambiente e processi stocastici associati a morte cellulare, divisione, concentrazione proteica, numero di organelli e mutazione 1 . All'interno dell'ambiente naturale, può essere quasi impossibile analizzare l'impatto individuale di tali influenze sulla composizione e l'attività della comunità. Oscurati da strutture naturali e sepolte in un ambiente chimico e biologico, identificare i membri della comunità e risolvere ulteriormente la loro distribuzione spaziale nell'ambiente naturale è estremamente impegnativo. Tuttavia, gli sforzi recenti hanno sottolineato l'importanza dell'organizzazione spaziale sulla funzione della comunità e sottolineano la necessità di tenere conto dell'abbondanza e dell'organizzazione dei membri negli studi in corso 2 , 3 , 4 .
essoÈ chiaro che l'ambiente chimico locale ( ossia la disponibilità di sostanze nutritive e metaboliti secondari), la struttura fisica ( ad esempio, l'architettura del suolo, le radici di piante, le particelle oceaniche oi microvilli intestinali), la presenza o l'assenza di ossigeno e l'introduzione di Specie patogene influenzano la composizione, l'architettura e la funzione delle comunità microbiche 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Tuttavia, le tecniche tradizionali per le culture che trascurano di catturare questi fattori continuano a prevalere. La composizione comunitaria ( ad esempio, la presenza di specie co-dipendenti), l'attaccamento fisico, la concentrazione di molecole di segnalazione e il contatto diretto delle cellule cellulari sono tutti fattori importanti per la formazione di una comunità microbica e possono essere persi in cCondizioni culturali convenzionali. Queste proprietà sono difficili da replicare in una coltura liquida o in una piastra agar. La disponibilità di tecniche microfluidiche, micropatternate e nanofabbricazione che consentono la replica delle principali caratteristiche fisiche e chimiche degli ambienti naturali ha comunque consentito a molti ricercatori di costruire comunità batteriche per studiare le loro interazioni 12 , 13 e 14 e sviluppare ambienti sintetici che Mimare le condizioni naturali 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Questo protocollo descrive un metodo per la fabbricazione di un dispositivo di array microwell e fornisce procedure sperimentali dettagliate che possono essere utilizzate per funzionalizzare thI pozzi nell'array e la crescita dei batteri, sia come colonie di singola specie che in comunità multi-membro. Questo lavoro dimostra anche come i batteri modificati per produrre proteine reporter fluorescenti possono essere utilizzati per monitorare la crescita batterica nei pozzetti nel tempo. Un reticolo simile è stato presentato in precedenza e ha dimostrato che è possibile seguire la crescita delle colonie di singola specie di Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) in microonde. Modulando la dimensione del pozzo e della densità di semina, le condizioni di partenza di migliaia di esperimenti di crescita possono essere variate in parallelo per determinare come le condizioni iniziali di inoculazione influenzano la capacità dei batteri di crescere 21 . Il lavoro corrente utilizza una versione leggermente modificata dell'array microwell che si basa sul lavoro precedente abilitando il confronto simultaneo di più array e utilizzando un protocollo sperimentale più robusto. L'array utilizzato in questo lavoro contiene più subarray, o array ensemChe contengono pozzetti di diverse dimensioni, che vanno da 15 a 100 μm di diametro, che sono disposti in tre differenti gradazioni ( ossia 2x, 3x e 4x il diametro del pozzo). Le matrici sono incisi in silicio e la crescita dei batteri seminati negli array di silicio è abilitata sigillando le matrici con una copertura rivestita con un gel agarosio a media infusione. I mutanti P. aeruginosa progettati per studiare il sistema di secrezione di tipo VI sono utilizzati in questa dimostrazione.
I risultati qui presentati si basano sull'obiettivo finale di analizzare le comunità di multipli all'interno delle matrici di microwell, consentendo ai ricercatori di monitorare l'abbondanza e l'organizzazione dei batteri in situ controllando e sondando l'ambiente chimico. Questo dovrebbe infine fornire approfondimenti sulle "regole" che governano lo sviluppo e la successione della comunità.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo è stato presentato un dispositivo a matrice microwell e protocolli sperimentali progettati per consentire l'analisi basata su immagini basate su immagini viventi ad alta percentuale e ad alto contenuto di sviluppo della comunità batterica. Mentre il fuoco della dimostrazione è stato quello di studiare gli effetti della secrezione di tipo VI mediata dal contatto sullo sviluppo della comunità, gli array sono stati progettati per essere flessibili e ospitare lo studio di un'ampia gamma di com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le matrici di Microwell sono state fabbricate e caratterizzate presso il Centro per le Divisioni Ufficio delle Scienze dei materiali di Nanophase, Ufficio delle Scienze Energetiche di base, Dipartimento di Energia Americana. Il sostegno finanziario a questo lavoro è stato fornito attraverso il fondo di Ricerca e Sviluppo del Direttore Nazionale del Laboratorio di Oak Ridge. Gli autori vorrebbero inoltre ringraziare il J. Mougous Laboratory (Università di Washington, Seattle, WA) per la fornitura di ceppi P. aeruginosa utilizzati in questi studi.
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
References
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity – The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van’t Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
