マイクロウェルアレイプラットフォーム内での微生物コミュニティ開発の組み立てと追跡
Summary
微生物群集の発達は、環境構造、メンバーの豊富さ、形質および相互作用を含む複数の要因の組み合わせに依存する。このプロトコルは、ニッチサイズや閉じ込めなどの重要な要素を近似できるフェムトリットルウェルに含まれる数千のコミュニティを同時に追跡するための合成の微細加工環境を記述しています。
Abstract
微生物群集の発達は、コミュニティメンバーの空間分布および活動を劇的に変えることができる複雑な決定論的および確率論的因子の組み合わせに依存する。我々は、数千の細菌群を並行して迅速にアセンブルおよび追跡するために使用できるマイクロウェルアレイプラットフォームを開発しました。このプロトコルは、プラットフォームの有用性を強調し、プラットフォーム内の配列のアンサンブル内の単純な2メンバーのコミュニティの開発を光学的に監視するための使用方法を説明します。このデモでは、 緑膿菌の 2つの突然変異体を使用しています。これは、タイプVIの分泌病原性を研究するために開発された一連の突然変異体の一部です。 mCherryまたはGFP遺伝子のいずれかの染色体挿入物は、各マイクロウェル内のコミュニティメンバーの存在および位置をモニターするために使用され得る異なる発光波長を有する蛍光タンパク質の構成的発現を促進する。このプロトコルは、アレイのウェルに細菌の混合物を組み立て、時間経過に伴う各メンバー集団の相対的成長を測定するための経時的蛍光イメージングおよび定量的イメージ分析を使用する。マイクロウェルプラットフォームの播種およびアセンブリ、アレイ内の微生物群集の定量分析に必要なイメージング手順、およびすべて説明した微生物種間の相互作用を明らかにするために使用できる方法。
Introduction
微生物群は、環境の構造や細胞死、分裂、タンパク質濃度、オルガネラ数、突然変異1に関連する確率論的プロセスのような決定論的要因の両方によって形成される。自然環境の中で、これらの影響がコミュニティの構成と活動に与える個々の影響を解析することは、ほとんど不可能です。自然の構造によって隠され、化学的および生物学的環境に埋もれて、コミュニティのメンバーを特定し、自然環境内で時空間分布をさらに解決することは非常に困難です。それにもかかわらず、最近の努力は、地域の機能に関する空間的組織の重要性を強調し、進行中の研究2,3,4でメンバーの豊富さと組織の両方を考慮する必要性を指摘している。
それ（ 例えば、土壌構造、植物の根、海洋粒子、または腸の微絨毛）、酸素の存在または不存在、およびその存在が、病原性種はすべて、微生物群集の組成、構造、および機能に影響を及ぼす5,6,7,8,9,10,11。それにもかかわらず、これらの要因を捕らえることを怠った伝統的な文化の技法が引き続き普及している。コミュニティ構成（ 例えば、共依存種の存在）、物理的付着、シグナル伝達分子濃度、および直接的細胞 – 細胞接触は、微生物共同体を形成するためのすべての重要な因子であり、c予防的培養条件。これらの特性は、バルク液体培養または寒天プレート上で複製することは困難である。しかし、自然環境の主要な物理的および化学的特徴の複製を可能にするマイクロ流体、マイクロパターン形成、およびナノ製造技術の可能性は、多くの研究者が相互作用を研究する細菌群集を構築することを可能にした12,13,14。自然条件4,15,16,17,18,19,20を模倣する。
このプロトコールは、マイクロウェルアレイデバイスを作製する方法を記載し、そして、機能的にするために使用され得る詳細な実験手順を提供する単一ウェルのウェル内で細菌を増殖させることができます。この研究はまた、蛍光レポータータンパク質を産生するように改変された細菌が、時間の経過とともにウェル内の細菌増殖をモニターするためにどのように使用され得るかを実証する。同様のアレイを以前に提示し、 マイクロウェル中の緑膿菌（ P.緑膿菌）の単一種コロニーの成長を追跡することが可能であることを示した。ウェルサイズと播種密度を調整することにより、何千もの増殖実験の開始条件を並行して変化させることができ、初期接種条件がバクテリアの増殖能力にどのように影響するかを決定することができる21 。現在の研究では、複数のアレイの同時比較を可能にし、より堅牢な実験プロトコールを使用することにより、前の研究に基づいて構築されたわずかに改変されたマイクロウェルアレイのバージョンを使用する。この作品で使用されているアレイには、複数のサブアレイ、または配列ensem3つの異なるピッチ（ すなわち 、ウェル直径の2倍、3倍、および4倍）で配置された、直径15〜100μmの範囲の異なるサイズのウェルを含む。アレイはシリコン内にエッチングされ、シリコン注入アレイに封入された細菌の増殖は、培地注入アガロースゲルで被覆されたカバースリップでアレイを密封することによって可能になる。タイプ6分泌系を研究するために設計されたP.aeruginosa変異体がこのデモンストレーションで使用される。
ここで提示された結果は、マイクロウェルアレイ内のマルチメンバーコミュニティを分析し、化学環境の制御と探索を行っている間、研究者がバイオウムの豊富さと組織をインサイチュで監視できる究極の目標に向かっています。これは、最終的に、コミュニティの発展と継承を支配する「ルール」についての洞察を提供するはずです。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、マイクロウェルアレイデバイスと、細菌のコミュニティ開発のハイスループットと高含量の生細胞イメージングベースの解析を可能にするための実験プロトコルを紹介しました。ここでのデモの焦点は、接触仲介型VI型分泌が地域社会の発展に及ぼす影響を研究することであったが、広範囲の微生物群集と微生物 – 微生物相互作用の研究に柔軟に対応するように設計された。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マイクロウェルアレイは、米国エネルギー省基礎エネルギー科学局のナノフェーズ材料科学センターのユーザー施設部門のセンターで製作され、特性評価されました。この研究の資金援助は、オークリッジ国立研究所所長の研究開発基金を通じて提供された。著者らはまた、これらの研究で使用されたP.緑膿菌株の供給についてJ. Mougous Laboratory（Washington、Seattle、WA）に感謝したい 。
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
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