Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו doi: 10.3791/55704 Published: June 8, 2017

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הטכניקה יכולה להיות מנוצל כמו כלי בדיקה במבחנה במחקרי שמיעה.

Abstract

אמנם יש התקדמות בולטת במחקר השמיעה בעשורים האחרונים, עדיין אין תרופה עבור אובדן שמיעה Sensorineural (SNHL), מצב זה בדרך כלל כרוך נזק או אובדן של מבנים מכאנסנסורי עדין של האוזן הפנימית. מתוחכם מבחני חוץ גופית vivo לשעבר צמחו בשנים האחרונות, מה שמאפשר את ההקרנה של מספר גדל והולך של תרכובות טיפוליות פוטנציאליים תוך מזעור משאבים מאיצים המאמצים לפתח תרופות עבור SNHL. למרות תרבויות הומוגניות של סוגי תאים מסוימים ממשיכים לשחק תפקיד חשוב במחקר הנוכחי, מדענים רבים כיום להסתמך על תרבויות organotypic מורכבים יותר של האוזן הפנימית Murine, הידוע גם בשם explants cochlear. שימור מבנים תאיים מאורגנים בתוך האוזן הפנימית מקנה הערכה באתרו של מרכיבים שונים של תשתית השבלול, כולל תאי שיער פנימיים וחיצוניים, נוירונים גנגליונים ספירליים, נוירוניםItes, ותאים התומכים. כאן אנו מציגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הכנה זהירה של explants אלה מאפשרת זיהוי של מנגנונים אשר תורמים SNHL ומהווה כלי רב ערך עבור קהילת המחקר השמיעה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אובדן שמיעה חושבי (SNHL) משקף נזק לאוזן הפנימית או מסלול שמיעתי עולה. בעוד אובדן שמיעה הוא הגירעון הסנסורי הנפוץ ביותר בבני אדם 1 , טיפולים מרפא עדיין לא קיים 2 . למרות שתלות שתלי המוח או השמיעה השמיעתית יכולות לשקם מידה מסוימת של שמיעה לחולים עם SNHL חמור עד עומק, השימוע שסופק על ידי מכשירים אלה עדיין שונה מאוד משימוע "טבעי", במיוחד במהלך ניסיונות להבין דיבור ברעש או להאזנה למוסיקה.

בעוד שתנועת תאי השיער נחשבת מזה זמן רב לתוצאה העיקרית של אירועי השמיעה הטראומטיים ( למשל, חשיפה לרעש חזק), יש ראיות גוברות לכך שהסינפסות המשדרות מידע מתאי שיער לעצב השמיעתי הן לפחות פגיעות לטראומה אקוסטית 3 , 4 , 5 > 6 . מאחר וספים אודיומטריים אנושיים, תקן הזהב הנוכחי להערכת תפקוד השמיעה, אינם מנבאים נזק תאגידי ספציפי באוזן הפנימית, נדרשים כלים מעודנים יותר כדי לזהות ניוון תאי מוקדם ככל האפשר וליזום טיפול הולם.

טיפולים תרופתיים מבטיחים לאובדן שמיעה נבדקים לעתים קרובות על תרבויות תאים הומוגניות במבחנה , אך מערכות כאלה אינן מדויקות במדויק את מיקרו-הסביבה של השבלול. תאי Cochlear ידועים כדי להפריש גורמים trophic המשפיעים על סוגי תאים אחרים בתוך שבלול 8 , 9 , תהליך חיוני vivo כי הוא איבד כאשר איבר של קורטי 10 , 11 או ספירל גנגליון נוירונים (SGNs) 12 מתורבתים בבידוד או כאשר סמנים מולקולריים מנותחיםEf "> 13. עם זאת, במחקרים vivo כי ייתכן שיהיה צורך אימות של נתונים במבחנה להקים טיפולים חדשים, אישית עבור אובדן שמיעה במרדף של" רפואה דיוק "דורשים משאבים משמעותיים וזמן.זה רלוונטי במיוחד כאשר שוקלים כמה מאמץ נדרש כדי לבצע מושלמת אוזן באמצע או חלון עגול זריקות הממברנה עם בדיקות השמיעה ולאחר מכן לנתיחה של מכלול שבלול כולו.ההקרנה היעילה של תרכובות מבטיח בתרבויות vivo לשעבר organotypic המכונה explants cochlear מספק חלופה כלכלית ואמינה 14 , 15 , 16 , 17 .

מאמר זה מפרט פרוטוקול שבאמצעותו ניתן ליצור, לשמור ולהעריך explants cochlear מטופלים. יישומים ספציפיים למודל זה מודגשים, כולל השימוש בו בהקרנהשל תרכובות טיפוליות פוטנציאליות והערכה השוואתית של וקטורים ויראליים לריפוי גנטי. גישה vivo exant לשעבר מאפשר לחוקרים לדמיין את ההשפעות של טיפול נתון על אוכלוסיות תאים שונים באתרם , להקל על זיהוי של סוג ספציפי תאים מנגנוני ואת חידוד הבאים של טיפול ממוקד.

בסך הכל, טכניקה זו מספקת מודל ללמוד את vivo cochlea לשעבר תוך שמירה על חוצה שיחה בין סוגי תאים שונים מאוד להתקיים בתוך cochlea.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול המחקר אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש הוועדה (IACUC) של מסצ 'וסטס עין ואוזן. ניסויים בוצעו על פי קוד האתיקה של האיגוד הרפואי העולמי.

1. הכנת הדיסקציה

  1. הכנת השולחן הניתוח
    1. השתמש באתנול 70% לחטא את השולחן כירורגי.
    2. מקום שני רפידות הכנה nonsterile ליד המיקרוסקופ.
    3. הכן את מגש המכשיר, כולל מספריים ההפעלה מעוקרים בחום, ידית אזמל, סכין מיקרו, מלקחיים (שני כל אחד # 4 & # 55). מניחים את מגש המכשיר ואת 50 מ"מ, שקוף היטב, זכוכית צלחת פטרי תחתית על משטח אחד סטרילי.
    4. השג להב סטרילי מס '15 באזמל; שקית ניילון או מכולה (להשליך את הפגרים בהתאם להנחיות המוסדיות); קרח בדלי; ו קר, סטרילי של תמיסת מלח מאוזן של Hank (HBSS). המקום פריטים אלה עלפנקס אחר nonsterile.
    5. מעבירים את HBSS לתוך צינור פלסטיק 50 מ"ל מעבדה ולשים אותו על הקרח.
  2. הכנת התרבות
    1. הכן את כל החומרים ברדס זרימה למינרית. עבור כל ארבעה דגימות, לשים ארבעה autoclaved 10 מ"מ כיסוי זכוכית עגול מחליק בארבעת שיבוצים של 35 מ"מ 4 צלחת פטרי.
    2. עבור כל 4 דגימות, לערבב נפח כולל של 300 μL המורכב הבאים בצינור microcentrifuge: 10 μL של דבק רקמות, 285 μL של NaHCO 3 , ו 5 μL של NaOH.
    3. שים 45 μL של הפתרון שנוצר על כל כיסוי להחליק ולהשאיר אותו שם לפחות 20 דקות ב RT; פתרון זה ניתן להשאיר על coverslip במשך מספר שעות, אבל לא ניתן להשאיר O / N.
    4. מניחים אחד או שניים 35 מ"מ 4-גם צלחת פטרי (es) בתוך צלחת 10 פטרי ס"מ על מנת ליצור שני מחסומים נגד זיהום.
    5. הכינו בינוני תרבות המכיל 98% Dulbecco השתנה של הנשר בינוני (DMEM), 1% N-2, ו 1% ampicillin (65 μL לכל טוב בצינור צנטריפוגה (מיקרו)). חם פתרון 25 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

2. Murine Cochlear Explant Dissection

  1. עריפת ראש של העכבר הילוד
    1. השג 60 מ"מ צלחת פטרי פלסטיק לרסס אתנול 70% במכסה שלה, כך שהמשטח רטוב.
    2. יוצקים HBSS קר מן צינור המעבדה הפלסטיק לתוך החלק התחתון של פלסטיק 60 מ"מ ואת 50 מ"מ צלול בצלחת, צלחת פטרי תחתית זכוכית. אחסן את המעבדה פלסטיק צלחת שתי מנות פטרי על הקרח כדי לשמור על רקמות קר בכל פעם שזה לא להיות גזור.
    3. מניחים עכבר P3 - P5 בגיל הילוד על הקרח באצבע החתך של כפפת לטקס לחכות עד היפותרמיה גורם לאובדן הכרה (כ 1-3 דקות).
    4. לערוף את העכבר במהירות עם המספריים ההפעלה להשליך את הגוף בשקית פלסטיק sealable. שים את ראשו של התינוק הנגוע70% אתנול במכסה של צלחת פטרי 60 מ"מ פלסטיק.
  2. דיסקציה מאקרוסקופית של העצם הזמנית
    1. הסר את העור של הגולגולת על ידי ביצוע חתך שטחי מן הקדמי עד הקצה האחורי (ישירות על גבי תפר sagittal) באמצעות להב סכין מנתחים.
    2. חותכים שתי תעלות השמיעה החיצונית עם להב אזמל לקפל את העור anteriorly לחשוף את הגולגולת כולה.
      הערה: אמנם אין צורך במיקרוסקופ לנתיחה בדרך כלל עבור שלב זה, זה יכול לשמש להדמיה משופרת.
    3. פתח את הגולגולת לאורך תפר sagittal באמצעות להב # 15 אזמל. הקפד לחתוך את הגולגולת על ידי העברת בעדינות את הלהב למעלה ולמטה מ הקדמי כדי האחורי כדי למנוע דחיסה של cochleae.
      הערה: הגולגולת לא צריך להיות ossified בגיל זה צריך לחתוך בקלות.
    4. הסר וזורקים את חוטם על ידי ביצוע חתך אנכי ישירות אל מסלולים באמצעות # 15 אזמללהב.
      הערה: החלק האחורי של הגולגולת צריך עדיין להכיל את המוח ואת שבלול.
    5. השלך של המוח הקדמי, המוח הקטן, וגזע המוח באמצעות דיסקציה קהה עם # 4 מלקחיים.
  3. מיצוי מיקרוסקופי של השבלול
    1. התאם את המיקרוסקופ (הגדלה 6.5X) ואת מקור האור על ידי הצבת מלקחיים תחת היקף ואופטימיזציה התאורה ואת המיקוד.
    2. מניחים את שני חצאים של הגולגולת לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ פלסטיק מלא HBSS קר.
    3. לחשוף לחלוטין את cochlea / e, לזיהוי כמו להיות סמוך לעורק stapedial שמסביב (עורק מפותל בתוך העצם הזמנית), וכן להפריד את האורגן בצורה ברורה מן העצם הזמנית באמצעות # 4 מלקחיים.
    4. מעבירים את שבלול לתוך צלחת פטרי 50 מ"מ, צלול זכוכית, תחתית זכוכית ומניחים את צלחת מתחת למיקרוסקופ.
    5. מניחים את צלחת פטרי 60 מ"מ פלסטיק עם החצי השני של הגולגולת על הקרח. הסר את שבלול מן המערכת שיווי המשקל בזהירות לנתח את הקפסולה otic cochlear (בדרך כלל סחוס בגיל זה) עם # 4 מלקחיים. השתמש # 55 מלקחיים עבור כל השלבים הבאים.
  4. השלבים הסופיים של עיבוד רקמות
    1. המשך עם העיבוד של רקמת האוזן הפנימית על ידי הפרדה קפדנית של הליגמנט הלולייני הדבוק לאיבר של Corti משאר שבלול ואת modiolus באמצעות סכין מיקרו או שני מלקחיים.
      1. גזור לתוך אזור כהה, שקוף על הסדק בין הלולאה הלוליינית לאזור תא השיער ולהמשיך להסרת הבא של הלולאה הספירלית על ידי אחיזתו בהיבט הבסיסי ביותר בעדינות תוך כדי הסרת אותו בעדינות.
    2. מקם את הדגימה כדי לקבל תצוגה אורכית, sagittal של שבלול לחתוך את cochlea לתוך שניים עד שלושה חלקים באמצעות סכין מיקרו, סיווג חלקים אלה כמו apical, (באמצע,) ו - bאסאל מסתובב. הסר את הרקמה מעולה ונחותים את השכבה בפועל של תאי שיער ו neurites על מנת להשיג חתיכת explant cochlear שיכול להניח אופקית על צלחת פטרי.
      הערה: גודל מתאים להדבקה יציבה לתבשיל התרבות הוא כמחצית מפנה אחד של cochlear.
    3. מוציאים את הממברנה הטקטוריאלית, שכבה דקה מאוד שקופה העולה מיד על האיבר של קורטי, על ידי קילוף בעדינות את זה עם מלקחיים.
    4. הסר את הממברנה של רייסנר, מיד עולה על SGNs, על ידי נגיעה זה עם מלקחיים משני הצדדים וקילוף אותו.
      הערה: הסר את כל האזורים תא פגום שיער פגום על ידי חיתוך אותם עם סכין מיקרו.

3. העברת דגימות לתבניות התרבות

  1. הסר את 45 μL של תמיסת דבק רקמות מן ארבע מחליק תלושי. לשטוף כל להחליק לכסות עם 50 μL של סטרילי H 2 O. לשאוב את המים.
  2. לאסוף את פיפטה 1 מ"ל. רטוב קצה פיפטה עם כ 120 μL של DMEM כדי למנוע את הדגימה מן היצמדות הפנימי של קצה.
  3. מעבירים את הדגימות בנפרד באמצעות פיפטה 1 מ"ל. פיפטה מקסימום של 70 μL מן HBSS מלא, קטן, ברור, זכוכית צלחת פטרי התחתונה ומניחים את הדגימה יחד עם נוזל על אחד של 4 שיבוצים (מוכן עם כיסוי להחליק) בצלחת 4-פטרי .
  4. בדוק מתחת למיקרוסקופ (הגדלה 50X) כי הדגימה היא בכיוון הנכון. ודא כי האזור של תאים שיער שממנו הממברנה הטקטורי הוסר הפנים כלפי מעלה. ודא כי הממברנה basilar, יחד עם החלק התחתון, הבסיאלי של modiolus, פונה כלפי מטה דבק coverslip.
    1. אם הדגימה מכוונת הפוך במהופך על הבדיקה, להפקיד את HBSS שנותר קצה פיפטה לתוך שיבוץ למקם את חתיכת עד שהוא בכיוון הנכון.
      לאTE: זה ימנע תאי שיער מן צף בינוני תרבות ללא תמיכה מבנית מן coverslip, אשר עלול להוביל להתנוונות.
  5. לשאוב HBSS עודף באמצעות פיפטה 1 מ"ל. המתן 15 שניות.
  6. פיפטה 60 μL של המדיום תרבות מוכן חם (98% DMEM, 1% N-2, ו 1% ampicillin) ישירות על הדגימה. הקפד לא לגעת הדגימה עם פיפטה. החלף את צלחת פטרי הפנימי והחיצוני מכסה דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  7. החזירו את כל פתרונות המלאי למקומם הנכון, השליכו פגרים ופסולת שיורית, חיטטו את השולחן הכירורגי על פי הנחיות מוסדיות ( למשל, באמצעות אתנול או היפוכלוריט), נקו את החיטוי ואת החיטוי, והשליכו את החדים במיכל המתאים .

4. הוספת סופי תרבות מדיה ותכנים של עניין

הערה: explants Cochlear יהיה מוכן לשימוש 10-16 שעות מאוחר יותר.

  1. הכן mixtuמחדש של 97% DMEM, 1% בסרום שור עוברית (FBS), 1% N-2, ו 1% ampicillin (65 μL לכל טוב בצינור microcentrifuge, חם הפתרון 25 מעלות צלזיוס לפני השימוש).
  2. הוסף חומרים אחרים המעניינים את הפתרונות לקבוצות הטיפול המתאימות. אם חומרים פלואורסצנטיים מתווספים ( לדוגמה, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -חשוף וירוסים, בפרסום האחרון, ריכוז של 10 10 GC של Adeno- המשויכים וירוסים (AAVs) שימש במשך 48 שעות ב 50 μL) 18 , להגן מפני אוֹר.
  3. מעבירים את cochlear explant המכילים מנות פטרי מן החממה ומניחים אותם מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית.
  4. לשאוב בינוני המדיום הישן (w / o FBS) עם פיפטה מן שיבוצים.
  5. הוסף 60 μL לכל טוב של התרבות החמה מוכנה (טיפול) בינוני (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicillin, ואת החומרים של עניין).
  6. מניחים את צלחת פטרי בחזרה לתוך החממה (37 מעלות צלזיוס).
  7. הצג rבמיוחד מתחת למיקרוסקופ לזהות סימנים של זיהום, נדידה סלולרית, או ניתוק של cochlear explant ולבצע מכתים לאחר מקסימום של 7 ימים.

5. Immunofluorescence - יום 1

  1. הכן פתרון חסימה (94% פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), 5% עזים נורמלי או הסרום סוס (NGS / NHS, בהתאם הנוגדנים המשניים), ו 1% Non- יונית פעילי שטח (ראה טבלה של חומרים )) ומלאי נוגדנים (98.6% PBS, 1% NHS, ו 0.4% ללא פעילי שטח יוניים עם נוגדנים בהתאמה).
    הערה: נוגדנים כוללים ארנבת נגד Myo7A בריכוז של 1: 400+ (מיוזין 7A, עבור תאי שיער פנימיים וחיצוניים) ועכבר נגד TuJ1 1: 200 + (β- טובולין, עבור SGNs) או עכבר (IgG1) נגד -CtBP2 1: 200+ (c- מסוף חלבון מחייב, עבור presynapse), עכבר (IgG2a) נגד PSD95 1: 50 + (צפיפות postsynaptic, עבור postsynapse), ועוף נגד NF-H 1: 1000 + (neurofilament, עבור SGNs וסיבי עצב). "+" MeNs "ומעלה".
  2. לשאוב את המדיום תרבות באמצעות פיפטה. הקפד לא לגעת הדגימה.
  3. מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית, לשטוף את explants cochlear פעמיים עם PBS סטרילית, הצבת דגימות על שייקר במשך 5 דקות לאחר כל לשטוף.
  4. תקן את הרקמה paraformaldehyde 4% (PFA - זהירות) במשך 20 דקות על שייקר (מתחת למכסה המנוע). לשאוב את PFA.
  5. החל 60 μL של PBS כדי explants cochlear ומניחים את צלחת פטרי על שייקר במשך 5 דקות. לשאוב את PBS. חזור על 3x.
  6. מניחים את explants cochlear בפתרון חסימת מוכן (94% PBS, NHS 5%, ו 1% Non- יונית פעילי שטח) במשך 30 דקות על שייקר.
  7. מניחים את explants cochlear בפתרון נוגדנים מלאי מוכן (98.6% PBS, 1% NHS, ו 0.4% ללא פעילי שטח יוניים) עם נוגדנים העיקריים בהתאמה (מערבולת לפני השימוש) O / N על מונה ב RT.
    הערה: לעטוף את צלחות פטרי עם מגבות נייר לחים עטוף בניילון נצמד (או רדיד אלומיניום אם הוסיף סולוטיון מכיל חומרים ניאון כגון GFP- להביע וירוסים) כדי לשמור על לחות כלים כדי למנוע אידוי של פתרון נוגדנים O / N.

6. Immunofluorescence - יום 2

  1. הכן את 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כתם (300 ננומטר) ולהשתמש פתרון נוגדן המניות כדי לקבל את תערובות נוגדנים משני הנכון, משלימים את הנוגדנים העיקריים בשלב 5.1. ( למשל , עזים נגד ארנב 488 1: 200 + ו עז נגד עכבר 568 1: 200 + או עז נגד עכבר (IgG1) 568 1: 1000 +, עז נגד העכבר (IgG2a) 488 1: ו עזים נגד עוף 647 1: 200 + OR Phalloidin 568 1: 200 + (עבור תאי שיער פנימיים וחיצוניים)).
  2. לשאוב את הפתרון נוגדנים ראשוניים.
  3. החל 60 μL של PBS כדי explants cochlear ומניחים את צלחת פטרי על שייקר במשך 5 דקות. לשאוב את PBS. חזור על 3x.
  4. מניחים את explants cochlear בפתרון נוגדן מלאי מוכן (98.6% PBS, 1% NHS, ו 0.4% פעילי שטח לא יוניים) עם resנוגדנים משני משנית (מערבולת לפני השימוש) עבור 1.5 שעות על הדלפק ולהגן מפני האור.
  5. לשאוב את הפתרון נוגדנים משני ולשטוף את explants cochlear עם כתם DAPI (הנחת על שייקר במשך 1 דקות ולאחר מכן לשאוב).
  6. החל 60 μL של PBS כדי explants cochlear ומניחים את צלחת פטרי על שייקר במשך 5 דקות. לשאוב את PBS. חזור על 3x.
  7. השתמש מלקחיים כדי להסיר coverslips עם דגימות מהצלחת 4-היטב, לטבול אותם לתוך נמען מלא מזוקק H 2 O, ויבש את coverslips על ידי אנכית להביא אותם במגע עם מגבות נייר.
  8. מניחים טיפה של המדיום גובר antifade על השקופית מיקרוסקופ להפוך את coverslips לטבול את הרקמה הפונה כלפי מטה במדיום.
  9. חותם את coverslip באמצעות לק לציפורניים ברור מכסה את הקצה (בלי לרסק את הדגימה מתחת לזכוכית). השאירו את השקופיות שוכב שטוח באזור מכוסה הרחק מן האור במשך 15 - 20 דקות עד יבש הלשים אותם בקופסה או לבחון תחת מיקרוסקופ confocal.
    הערה: מכתים פלואורסצנטי נשמר הטוב ביותר על ידי אחסון שקופיות ב 4 או -20 מעלות צלזיוס.

7. הדמיה confocal

  1. קבל סקירה כללית zoomed בתמונות עבור האיבר של האזור Corti, כולל neurites ו SGNs.
    הערה: הגדרות סטנדרטיות עבור תהליך ההדמיה: תבנית של 1,024 x 1,024 פיקסלים, מהירות של 400 הרץ, ממוצע מסגרת של 3, 20% עוצמת הלייזר הכוללת, ובדרך כלל 20x ו 63x עדשה עם טבילה שמן (בשילוב עם זום דיגיטלי 2x). הגדרות ערוץ עבור פרוטוקול DAPI, Myo7A ו- TuJ1 מתוארים לעיל: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766.8V, "Smart Offset" 0.0% - 488 15% פלואורסצין איזותרפיאנט (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "חכם אופסט" 0.0% - 561 13% tetramethylrhomadine isothiocyanate (TRITC), "חכם רווח" 562.4V, "חכם אופסט" 0.0%.
  2. למזג את התמונות בערימה z באמצעותתוכנה כדי לקבל תחזית ציר z.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בעוד פרוטוקולים רבים מתמקדים באיבר של explants קורטי, טכניקה זו מנסה לשמר את האנטומיה של התור כולו cochlear, כולל SGNs. זה נותן לחוקרים את ההזדמנות לנתח את ההשפעות של טיפול נתון על neurites ו somata של SGNs בנוסף האיבר של קורטי. ביצוע דיסקציה שמשמרת חלק מהמודולוס, כפי שמתואר כאן, מאתגר יותר מבחינה טכנית מאשר חשיפת האיבר של קורטי בלבד. עם זאת, האזור neurite ו SGN חשוב, כי השפעות פתולוגיות משמעותיות נצפו באזור זה לאחר החלת הפרעות שוואנומה שיווי המשקל ( איור 1 ) ו שלפוחית ​​תאיים בשני פרסומים האחרונים באמצעות אותה מתודולוגיה 19 , 20 . שינויים כאלה לא היו יכולים להתגלות באמצעות איבר מבודדים של explants קורטי.

תE כימות של תאים פגומים או GFP להביע עבור תאים שיער פנימיים וחיצוניים, תאים התומכים, ו SGNs יכול להתבצע על ידי ספירה ידנית או עם תהליך אוטומטי, כגון זה מובנה לתוך תוסף ImageJ תוסף. אזורים נציג עבור סעיפים אלה ניתן להקים לאחר המאשר שלהם מתאם עם סך כל סעיפים. שחזור 3D הם שימושיים במיוחד כדי לכלול את ההשפעות כיסוי ב z- ציר התחזיות של SGNs. ארגון סיבים, מספר SGNs לכל אזור נתון, אזור SGN SGA ניתן להעריך. מכתים וספירה של סינפסות, תאי שיער, neurites מתואר באיור 2 ; אותו פרוטוקול יכול לשמש גם עבור mounts כולו cochlear ו הוכח להיות מודל אמין למטרות אלה 17 , 21 , 22 . חוקרים אחרים הקימו שיטות אלטרנטיביות אלגנטיות, שניתן לשלבן גם בפרדיגמות ניסוייות22 , 22 , 22 .

האורך המרבי של התרבות הוא מוגבל בדרך כלל על ידי תחילת הגירה הסלולר תלוי ריכוז של FBS במדיום התרבות. כאשר שיעור של FBS הופחת מ 5% עד 3 אחוזים או אחוז אחד, תקופת הזמן לשמירה explant שבלול השלם שלם אנטומית עד שבוע בערך ( איור 3 ).

איור 4 מדגים GFP חיובי תאים cochlear אקספלנט לאחר התמרה עם וקטור סינתטי הקשורים וירוס וקטור Anc80 עבור 48 שעות 25 . תאי שיער פנימיים, תאי שיער חיצוניים, תאים תומכים ניתן לכמת בתצוגה זו, תוך שחזור 3D יכול לעזור לכמת תאים חיוביים GFP באזור SGN. סרוטיפים ויראליים שונים ניתן להשוות במונחים של יעילות התמרה שלהם ב ce מסוימיםLl שימוש במתודולוגיה המתוארת 18 .

איור 1
איור 1: מיקרוסקופיה confocal נציג של explants Cochlear מאזורי Apical והבזליים לאחר הדגירה עם הפרשות עצבים Auricular גדול או Schwannomas שיווי המשקל במשך 48 שעות . ( א ) סקירה של התמונה של explant. המלבן מסמן את האזור בתמונות תקריב. סולם בר = 200 מיקרומטר. ( B - E ) זום פנימה צפיות של תאי שיער ו neurites. סולם בר = 50 מיקרומטר. ירוק = מיוזין 7A (Myo7A), כתמי שיער תאים; אדום = בכיתה III בטא טובולין (Tuj1), כתמים מבנים עצביים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מיקרוסקופיה Confocal תמונה של אזור תא שטח Coclear Explant. ( A ) סינפסות שלמות ניתן להעריך על ידי תיוג presynaptic (C- מסוף מחייב חלבון, אדום) ו postsynaptic (צפיפות postsynaptic-95, ירוק) חלבונים יחד עם מכתים של מבנים העצבית (neurofilament, כחול). OHC, תאי שיער חיצוניים; IHC, תאי שיער פנימיים. סולם בר = 10 מיקרומטר. ( ב ) התמקדות באזור תא השיער הפנימי עם ספירת תאי השיער הפנימיים (ראשי חץ אדומים) ונוריטים (ראשי חץ כחולים). בשל ההשלכות של מבנים עצביים, חשוב לתקנן את המרחק בין תאי השיער הפנימי במהלך הספירה (מודגשת עם מסגרת לבן, מחובר ישירות הסינפסות). סולם בר = 5 מיקרומטר. ( ג ) תקריב של סינפסות נפרדות (2 זוגות לפני ו postsynaptic מסומן עם ראשי חץ לבן). סרגל קנה מידה = 1 & # 181; m. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: מיקרוסקופיה קונפוקאל נציג תמונות של explants הקופים אפיקל Basal לאחר 7 ד בתרבות עם 3% או 1% FBS. ( A ו- B ) תאים מודגרות 3% FBS להתחיל להגר בין 4 ל 5 ימים (החצים האפורים בהיר עבור תאים שיער, חיצים אדומים עבור neurites), ( C ו- D ) Explants ב 1% FBS לשמור על שלמות ארגונית עד יום 7. אפור בהיר: מיוזין 7A (Myo7A), כתמים כל תאי השיער; אדום: בכיתה III בטא טובולין (Tuj1), כתמים מבנים עצביים. OHC, תאי שיער חיצוניים; IHC, תאי שיער פנימיים. סולם בר = 100 מיקרומטר, להחיל על כל לוחות.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: מיקרוסקופיה confocal תמונה של חוקר קוקלר לאחר החשיפה לזיהום וירוס סינתטי Adeno הקשורים Anc80 במשך 48 שעות. תאים transduced להביע GFP (ירוק). Myosin 7A (Myo7A, כחול) כתמים תאי שיער חיצוניים (OHC) ותאי שיער פנים (IHC); בכיתה III בטא טובולין (Tuj1, אדום) כתמים מבנים עצביים. Supp .: שטח של תאים תומכים Sox2 חיובי; SGN, נוירונים גנגליון ספירלי. סולם בר: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

החוקרים חייבים להשלים את הטכניקה לנתיחה לפני ביצוע ניסויים מעורבים explants cochlear. תאי שיער נפגעים בדרך כלל במהלך ניתוחים המבוצעים בשלב מוקדם בעקומת הלמידה, ורגע בעייתי במיוחד בשלמותם הוא הסרת הממברנה הטקטוריאלית, המחייבת ידיים יציבות, כלים מתאימים וניסיון. כדי לחסוך זמן ומשאבים, שליטה חזותית צריכה להתבצע תחת מיקרוסקופ לנתיחה ואזורים שנפגעו פוטנציאלית יש לציין. במקום להשתמש נוגדנים ראשוניים ומשניים יקרים, ריאגנטים זולים יותר כמו phalloidin מתאימים יותר עבור ניסויים ראשוניים. אקספלנטים פגומים קלות יכולים לשמש עדיין בקרות בניסויים מסוימים (ניתוח של חלקים שלא הושפעו) או לבדיקה של צירופים חדשים של נוגדנים.

העברת הדגימות היא גם חשובה במיוחד, כי יש להבטיח את החלקיםאינם מכוונים הפוך (תאים "צפים" שיער ללא הדרכה של coverslip מצופה לעתים קרובות מנוון). מיקום מרכזי על coverslip מקל על כל הצעדים pipetting נוספת.

עבור ניסויים שלילי שליטה תרכובות רומן (זה כמובן חייב להיות מסיס במדיום התרבות), חשוב להחיל את הרכב המתאים explants ולא להתמקד אך ורק על explants לא מטופל. לדוגמה, אם תרופה מסחרית כוללת ציטרט נתרן בנוסף למרכיב הפעיל, אז נתרן ציטראט יש להוסיף את השליטה השלילית של cochlear explants כי ציטראט נתרן עצמה עשויה להיות השפעה.

המגבלות על השימוש explants cochlear כוללים את העובדה כי אלה תרבויות organotypic נגזרים בדרך כלל גורים צעירים שעדיין עוברים שינויים התפתחותיים לאחר הלידה וכי קיים מחסור של שיפוע יונית על פני explant, שהוא חיוני עבור נורמלישמיעה ב vivo . עם זאת, השירות של הפרוטוקול הוא הוכיח באופן משכנע בפרסום שפורסם לאחרונה על AAVs 18 . בעוד קבוצה זו של וקטורים מוגבל כ 4.7 קיבולת קיבולת האריזה, הוא הפך להיות משאב חשוב לטיפול של כמה תסמונות אנושיות 26 . באמצעות המודל explant cochlear, הפרסום הנ"ל הוכיח כי וירוס Anc80 בביצועיו של AAV מסורתיים AAV ב התמרה של מגוון של תאים cochlear, כולל תאי שיער ו SGNs. אלה בממצאים חוץ גופית אושרו לאחר מכן על ידי בחירת המועמדים המבטיחים ביותר עבור הזרקת דרך החלון עגול גורי העכבר in vivo . המודל vivo לשעבר מספק דרך בהצלחה לשחזר את האנטומיה של שבלול, להקטין את הזמן והמשאבים הדרושים לניהול בעבודה vivo 27 .

יתרון נוסף של לשעבר vמודל איבו הוא הפוטנציאל שלו ליישום למחקר של מנגנונים תאיים ספציפיים שתורמים SNHL. על ידי שימוש בתרכובות הנמצאות באזור המיקרו-סביבתי של הגידול ( למשל, הפרשות גידולים אנושיים) ל- explant, ההשפעה של תרכובות אלה על שבלול העין ניתנת להדמיה ישירה, ויעילותן או רעילותן של טיפולים תרופתיים אפשריים הוערכו. זה חשוב כי cochlea האדם לא יכול להיות ביופסיה, ואת התאים בתוך זה לא יכול להיות דמיינו in vivo . לדוגמה, פרסום שפורסם לאחרונה בחן את הפוטנציאל האוטוטוקסי של חלבונים המופרשים מתוך שוואנומה וסטיבולארית, שהם גידולים תוך גולגולתיים הנובעים מעצבים שיווי המשקל וגורמים לאובדן שמיעה ב -95% מהחולים. החלת הפרשות גידולים אנושיים על explants cochlear, לעומת הפרשות שליטה עצבים אנושיים בריאים, אישר את ההשפעות הרעילות של הפרשות אלה על שבלול 19 . אותו ניסוי יהיה קשה לשכפל in in vivoמודל עקב התגובה האימונוגנית נגד חלבונים אנושיים כי יעלו עכבר immunocompetent.

לסיכום, כתב היד הזה מציג טכניקה המאפשרת לימוד סימולטני של תאי שיער של שבלול, סינפסות, נוירונים ונוירונים במודל של vivo לשעבר . מודל זה יכול לעזור לספק תובנה מנגנוני פעולה של מולקולות חדשות של cochlea 28 , כולל גורמים בהפרשות האדם 19 , 20 , תוך פוטנציאל להאיץ את ההקרנה של תרכובות טיפוליות 18 לפני הבדיקה שלהם in vivo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של חירשות הפרעות תקשורת אחרות מעניקה R01DC015824 (KMS) ו T32DC00038 (תמיכה SD), משרד ההגנה מענק W81XWH-15-1-0472 (KMS), קרן ברטרלי (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS) ומרכז המחקר לאואר טיניטוס (KMS). אנו מודים לג 'סיקה E. Sagers, BA עבור הערות תובנה על כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin, Sodium Salt Invitrogen 11593-027
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) BD Transduction Laboratories 612044
anti-Myo7A antibody, rabbit Proteus Biosciences 25-6790
anti-NF-H antibody, chicken EMD Millipore AB5539
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) Antibodies Inc. 75-028
anti-TuJ1 antibody, mouse BioLegend 801202
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg Corning 354241
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm Greiner Bio-One 664160
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings Greiner Bio-One 627170
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm Greiner Bio-One 628160
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm Ted Pella Inc. 14027-20
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm Ted Pella Inc. 260368
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
Distilled water, 500 mL Thermo Fisher Scientific 15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10313-039
Dumont #4 Forceps Fine Science Tools 11241-30
Dumont #55 Forceps (Dumostar) Fine Science Tools 11295-51
Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% Sigma-Aldrich 459836-1L
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10437-028  Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
goat anti-chicken-647 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21469
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-11004
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21124
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21131
goat anti-rabbit-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific R37116
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL EMD Millipore TMS-006-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL Thermo Fisher Scientific 14025-092
Instrument Tray with Lid Stainless Steel Mountainside Medical TechMed4255
Micro (dissecting) knife – angled 30° Fine Science Tools 10056-12
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 VWR 16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 mL Thermo Fisher Scientific 17502-048
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL Thermo Fisher Scientific 25080-094
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L Thermo Fisher Scientific SS266-1
Normal Horse Serum (NHS) Invitrogen 16050130
Operating scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6806
Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010-023  Autoclave prior to use
Phalloidin, Alexa Fluor 568  Thermo Fisher Scientific A12380
Prep Pad, Non Sterile  Medline 05136CS
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Scalpel Blades - #15 Fine Science Tools 10015-00
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools 10004-13
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss  000000-1106-133
TCS SP5 confocal microscope Leica N/A
Triton-X (non-ionic surfactant) Integra T756.30.30
VectaShield antifade mounting medium for fluorescence Vector Laboratories, Inc. H-1000
Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick Zipline 0609132541599

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
  2. Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344, (6184), 1241062 (2014).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26, (7), 2115-2123 (2006).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29, (45), 14077-14085 (2009).
  5. Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12, (6), 711-717 (2011).
  6. Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10, (5), (2015).
  7. Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. 83-93 (2016).
  8. Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163, (6), 1348-1359 (2015).
  9. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
  10. Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148, (5), 834-840 (2013).
  11. Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501, (2), 67-71 (2011).
  12. Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
  13. Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
  14. Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
  15. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
  16. Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
  17. Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31, (21), 7938-7949 (2011).
  18. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35, (3), 280-284 (2017).
  19. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
  20. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. (2016).
  21. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14, (3), 321-329 (2013).
  22. Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15, (1), 31-43 (2014).
  23. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35, (19), 7509-7520 (2015).
  24. Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. 50-62 (2016).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12, (6), 1056-1068 (2015).
  26. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18, (1), 80-86 (2010).
  27. Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. (2016).
  28. Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15, (2), 301-308 (2016).
Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. J. Vis. Exp. (124), e55704, doi:10.3791/55704 (2017).More

Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. J. Vis. Exp. (124), e55704, doi:10.3791/55704 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter