המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הטכניקה יכולה להיות מנוצל כמו כלי בדיקה במבחנה במחקרי שמיעה.
אמנם יש התקדמות בולטת במחקר השמיעה בעשורים האחרונים, עדיין אין תרופה עבור אובדן שמיעה Sensorineural (SNHL), מצב זה בדרך כלל כרוך נזק או אובדן של מבנים מכאנסנסורי עדין של האוזן הפנימית. מתוחכם מבחני חוץ גופית vivo לשעבר צמחו בשנים האחרונות, מה שמאפשר את ההקרנה של מספר גדל והולך של תרכובות טיפוליות פוטנציאליים תוך מזעור משאבים מאיצים המאמצים לפתח תרופות עבור SNHL. למרות תרבויות הומוגניות של סוגי תאים מסוימים ממשיכים לשחק תפקיד חשוב במחקר הנוכחי, מדענים רבים כיום להסתמך על תרבויות organotypic מורכבים יותר של האוזן הפנימית Murine, הידוע גם בשם explants cochlear. שימור מבנים תאיים מאורגנים בתוך האוזן הפנימית מקנה הערכה באתרו של מרכיבים שונים של תשתית השבלול, כולל תאי שיער פנימיים וחיצוניים, נוירונים גנגליונים ספירליים, נוירוניםItes, ותאים התומכים. כאן אנו מציגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הכנה זהירה של explants אלה מאפשרת זיהוי של מנגנונים אשר תורמים SNHL ומהווה כלי רב ערך עבור קהילת המחקר השמיעה.
אובדן שמיעה חושבי (SNHL) משקף נזק לאוזן הפנימית או מסלול שמיעתי עולה. בעוד אובדן שמיעה הוא הגירעון הסנסורי הנפוץ ביותר בבני אדם 1 , טיפולים מרפא עדיין לא קיים 2 . למרות שתלות שתלי המוח או השמיעה השמיעתית יכולות לשקם מידה מסוימת של שמיעה לחולים עם SNHL חמור עד עומק, השימוע שסופק על ידי מכשירים אלה עדיין שונה מאוד משימוע "טבעי", במיוחד במהלך ניסיונות להבין דיבור ברעש או להאזנה למוסיקה.
בעוד שתנועת תאי השיער נחשבת מזה זמן רב לתוצאה העיקרית של אירועי השמיעה הטראומטיים ( למשל, חשיפה לרעש חזק), יש ראיות גוברות לכך שהסינפסות המשדרות מידע מתאי שיער לעצב השמיעתי הן לפחות פגיעות לטראומה אקוסטית 3 , 4 , 5 </sup > 6 . מאחר וספים אודיומטריים אנושיים, תקן הזהב הנוכחי להערכת תפקוד השמיעה, אינם מנבאים נזק תאגידי ספציפי באוזן הפנימית, נדרשים כלים מעודנים יותר כדי לזהות ניוון תאי מוקדם ככל האפשר וליזום טיפול הולם.
טיפולים תרופתיים מבטיחים לאובדן שמיעה נבדקים לעתים קרובות על תרבויות תאים הומוגניות במבחנה , אך מערכות כאלה אינן מדויקות במדויק את מיקרו-הסביבה של השבלול. תאי Cochlear ידועים כדי להפריש גורמים trophic המשפיעים על סוגי תאים אחרים בתוך שבלול 8 , 9 , תהליך חיוני vivo כי הוא איבד כאשר איבר של קורטי 10 , 11 או ספירל גנגליון נוירונים (SGNs) 12 מתורבתים בבידוד או כאשר סמנים מולקולריים מנותחיםEf "> 13. עם זאת, במחקרים vivo כי ייתכן שיהיה צורך אימות של נתונים במבחנה להקים טיפולים חדשים, אישית עבור אובדן שמיעה במרדף של" רפואה דיוק "דורשים משאבים משמעותיים וזמן.זה רלוונטי במיוחד כאשר שוקלים כמה מאמץ נדרש כדי לבצע מושלמת אוזן באמצע או חלון עגול זריקות הממברנה עם בדיקות השמיעה ולאחר מכן לנתיחה של מכלול שבלול כולו.ההקרנה היעילה של תרכובות מבטיח בתרבויות vivo לשעבר organotypic המכונה explants cochlear מספק חלופה כלכלית ואמינה 14 , 15 , 16 , 17 .
מאמר זה מפרט פרוטוקול שבאמצעותו ניתן ליצור, לשמור ולהעריך explants cochlear מטופלים. יישומים ספציפיים למודל זה מודגשים, כולל השימוש בו בהקרנהשל תרכובות טיפוליות פוטנציאליות והערכה השוואתית של וקטורים ויראליים לריפוי גנטי. גישה vivo exant לשעבר מאפשר לחוקרים לדמיין את ההשפעות של טיפול נתון על אוכלוסיות תאים שונים באתרם , להקל על זיהוי של סוג ספציפי תאים מנגנוני ואת חידוד הבאים של טיפול ממוקד.
בסך הכל, טכניקה זו מספקת מודל ללמוד את vivo cochlea לשעבר תוך שמירה על חוצה שיחה בין סוגי תאים שונים מאוד להתקיים בתוך cochlea.
החוקרים חייבים להשלים את הטכניקה לנתיחה לפני ביצוע ניסויים מעורבים explants cochlear. תאי שיער נפגעים בדרך כלל במהלך ניתוחים המבוצעים בשלב מוקדם בעקומת הלמידה, ורגע בעייתי במיוחד בשלמותם הוא הסרת הממברנה הטקטוריאלית, המחייבת ידיים יציבות, כלים מתאימים וניסיון. כדי לחסוך זמ…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של חירשות הפרעות תקשורת אחרות מעניקה R01DC015824 (KMS) ו T32DC00038 (תמיכה SD), משרד ההגנה מענק W81XWH-15-1-0472 (KMS), קרן ברטרלי (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS) ומרכז המחקר לאואר טיניטוס (KMS). אנו מודים לג 'סיקה E. Sagers, BA עבור הערות תובנה על כתב היד.
Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100×20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35×10 mm, four inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60×15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50×7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Distilled water, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
Glutamate – GlutaMAX supplement, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml | EMD Millipore | TMS-006-B | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
N-2 Supplement (100X), 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
Zipper Bag, Reclosable, 4'' x 6'' – 2 mil. thick | Zipline | 0609132541599 |