Summary
В этой работе описывается протокол, в котором используется подход с разделением компонентов для изучения сенсибилизации к аллергенам пыльцы травы в когорте пациентов из южного Китая с аллергическим ринитом и / или астмой.
Abstract
Сенсибилизация пыльцы травы наносит глобальный риск развития аллергических заболеваний дыхательных путей. Хотя профилактика основана на местном исследовании аллергенов пыльцы, данные по этой теме ограничены на юге Китая. Любые имеющиеся данные были получены путем опросов самоотчетов, тестов на кожные уколы и общих или специфических тестов IgE с использованием сырых экстрактов. По многим причинам эти методы ненадежны. Реакция сывороточного sIgE на траву Бермудских островов, траву Тимоти и Humulus scandens на аллергены в когорте пациентов из Большого Гуанчжоу (самый большой город Южного Китая и его окрестности) с аллергическим ринитом и / или астмой были исследованы с использованием полностью автоматизированного анализатора иммуноанализа в качестве компонента - разработанная диагностика (CRD).
Впервые у китайских южан была продемонстрирована значительно большая распространенность положительной реакции травы Бермудских островов с аллергическим ринитом и / или астмой. У этих пациентов тонкая распространенность сенсибилизацииК Тимоти-траве и Хумулус-сканндам, которые могут возникнуть из-за перекрестной реактивности, поскольку последние два не распространены в регионе. Это также подтверждается обнаружением компонентов аллергена.
Полностью автоматизированные анализаторы иммуноанализа могут обеспечить удовлетворительную согласованность между регионами, лабораториями и учреждениями и с течением времени. Автоматизация прибора может позволить стандартизированное обнаружение, которое не было бы легко обнаружено до появления CRD.
Это исследование, в котором используется подход CRD для исследования чувствительности к аллергенам пыльцы травы в южном Китае. Это добавляет к современным данным в литературе. Для подтверждения этих результатов необходимы дальнейшие исследования. Однако, хотя CRD является полезным инструментом, результаты, сделанные с помощью полностью автоматизированного анализатора иммуноанализа, не должны заменять другие лабораторные исследования, клинические оценки и экспертные знания.
Introduction
На пыльцу травы приходится почти 50% аллергенов, связанных с иммуноглобулином E (IgE), и из-за ее воздушно-десантной природы налагает глобальный риск развития аллергических заболеваний дыхательных путей, в частности астмы и аллергического ринита 1 , 2 , 3 , 4 . Предотвращение аллергий на пыльцу в регионе зависит от информации о местном распределении аллергенов пыльцы. К сожалению, спектр чувствительных аллергенов варьируется от места к месту - наблюдение, обычно известное как региональная специфика.
В Китае, обширной восточноазиатской территории, региональная специфика сенсибилизации пыльцы травы дополнительно осложняется ограниченными данными, имеющимися в настоящее время в южной части этой страны за последние десятилетия 5 . Такая нехватка данных привела к затруднениям в выявлении общей пыльцы пыльцыВ этой большой стране 6 . Кроме того, очень ограниченные данные по китайским южанам были в основном получены из анкетных опросов, тестов на кожные заболевания (а не лабораторных анализов сыворотки), полных измерений IgE (а не аллерген-специфических IgE (sIgE)) и sIgE-обнаружения для аллергенов ( А не молекулам компонентов аллергена).
Самооценка аллергических симптомов может быть ненадежной при определенных аллергенах. Тесты кожного покрова, хотя и широко доступны, включают использование нестандартизированных сырых экстрактов аллергенов, которые сами могут содержать другие сенсибилизирующие компоненты, которые смешивают интерпретацию результатов. Надежность теста на кожный шов также критически зависит от умелого манипулирования аллергологами или медсестрами специалистов, недавнего использования гистамина и соблюдения пациентом (иногда очень трудно для маленьких детей). Общий IgE полезен для скрининга аллергии, но неE оскорбительные аллергены у пациента. Более того, почти все аллергены содержат ряд молекул аллергенных компонентов. Сенсибилизация основных компонентов ( т. Е. Der p 1 и Der p 2 от домашних пылевых клещей) может указывать на «настоящую» аллергию (аллергия на специфический аллерген, а не ложную положительность из-за перекрестных реакций с другими аллергенами), но сенсибилизация К некоторым ( т. Е. Перекрестно-реактивный Der p 10, тропомиозин) не может быть 7 .
Перед внедрением диагностики с использованием компонентов (CRD) эти разочаровывающие неудачи препятствовали исследованиям аллергенов в Китае. CRD точно обнаруживает компоненты аллергена с использованием рекомбинантных или очищенных молекул аллергена, тем самым делая измерение легко поддающимся количественной оценке и характеризуемым 8 . В последние десятилетия в исследованиях аллергии часто применялись сырые экстракты аллергенов, которые неизбежно содержат ряд неуместных компонентов. Многие из этихМины являются инертными, но иногда некоторые могут приводить к смешиванию положительных реакций. Использование рекомбинантных или очищенных молекул аллергена в CRD может обойти это и, следовательно, обеспечить лучшую точность теста. При обработке в микрочипах подход CRD быстро экранирует или идентифицирует сенсибилизацию к сотням молекул аллергенов у отдельных субъектов. В настоящее время отсутствует хорошо разработанное исследование CRD по сенсибилизации пыльцы на юге Китая. В идеальном случае такое исследование должно включать местное население с значительным географическим охватом, учет пыльцы травы, обычно сообщаемое в Китае, и рассмотрение технических аспектов, упомянутых выше. Чтобы достичь практического уровня клинической значимости и облегчить вербовку образцов сыворотки, раннее исследование сенсибилизации к пыльцевой траве в качестве ингаляционных аллергенов может также быть сосредоточено на пациентах с аллергическими респираторными заболеваниями, а не на общей популяции.
Эта работа описывает методИспользуется для тестирования реакционной способности сыворотки sIgE на траву Бермудских островов, травы Тимоти и Humulus scandens у пациентов Большого Гуанчжоу (самый большой город Южного Китая и его окраины) с аллергическим ринитом и / или астмой с использованием подхода CRD 5 . Эти данные о сенсибилизации к этим субтропическим и умеренным пыльцам травы в южном Китае добавляют важные доказательства тому, что в настоящее время в литературе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол исследования, включая использование образцов сыворотки крови, был одобрен Комитетом по этике, Первой аффилированной больнице Гуанчжоуского медицинского университета. Все участники предлагали письменное информированное согласие либо самостоятельно, либо через своих родителей (в случае детей). Протокол зарегистрирован в Интернете (китайский клинический судебный реестр, рег. №: ChiCTR-DCC-13004003, см. Http://www.chictr.org/cn/).
1. Идентификация исследуемого населения
ПРИМЕЧАНИЕ. Первичный источник набора пациентов - это информационный репозиторий по изучению аллергии, который является основным источником для лечения респираторных заболеваний (AIR-SKLRD), поскольку ВОЗ является наиболее хорошо документированной большой базой данных пациентов для тестов на аллергены в южном Китае 9 , 10 . AIR хранит образцы сыворотки пациентов в течение почти десятилетия. Вкратце, эти сохраненные образцы предварительно готовили центрифугированием 5 млF флеботомизированная венозная кровь в течение 10 мин при 3000 мкг и восстановление супернатанта. Образцы сыворотки помещали в холодильники -80 ° C для длительного хранения. Образцы, которые соответствовали критериям включения пациента, были готовы использовать для всех испытаний в настоящем исследовании.
- Из базы данных AIR извлекайте данные о пациентах с аллергическим ринитом и / или астмой, которые прошли тесты на сыворотку для оценки аллергий на травы в период с января 2013 года по июнь 2015 года, предварительно спроектированный период исследования.
- Выбирайте пациентов с аллергическим ринитом и / или астмой от легкой до умеренной степени в соответствии с рекомендациями 12 «Алгический ринит и его воздействие на астму» (ARIA) 11 и «Глобальная инициатива по борьбе с астмой» (GINA). Назначьте их как «исследовательскую группу».
- Исключить пациентов с неполными медицинскими документами, потерянными для наблюдения, теми, кто отказывается дать информированное согласие относительно использования их образцов сыворотки в научных целях, тех, кто идентифицировал iMmunodeficiency, те, которые в настоящее время находятся на иммунотерапии или иммуномодулирующие средства, или те, которые, как обнаружено, имеют паразитарные инфекции.
- Выберите современную когорту пациентов с невоспалительными аллергиями ( например, экзема, аллергический дерматит и пищевая аллергия) в соответствии с теми же критериями исключения и назначьте их как «контрольную группу».
- Удостоверьтесь, что образцы сыворотки были собраны до того, как были даны какие-либо предписания или методы лечения, чтобы свести к минимуму смешение результатов лабораторных исследований. Исключить любой образец сыворотки, не удовлетворяющий этому требованию.
- Убедитесь, что все предметы являются постоянными жителями из всех частей Большого Гуанчжоу ( т.е. родились или жили там более 10 лет).
2. Исследование потока и измерение интереса
- Получите образцы сыворотки пациентов, имеющих право на участие в биобанке. Для тестирования компонента аллергена / аллергена используйте 140 мкл сыворотки (в том числе 100 мкл для заполненияВверх по мертвому пространству).
ПРИМЕЧАНИЕ. Максимальный общий объем сыворотки, необходимый для каждого пациента в этом исследовании: 3 специфических аллергена и 8 аллергенных компонентов, sIgE = 140 мкл * 11 = 1,540 мкл. - При использовании этого инструмента в первую очередь проверяйте образцы сыворотки для sIgEs на целые аллергены бермудской травы, травы Тимоти и Humulus scandens . Следуйте инструкциям в Разделе 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти пыльцы были выбраны для измерений, потому что в Китае широко распространены травы Бермудские травы 13 , 14 , 15 и Humulus scandens 16 , а трава Тимоти 17 , 18 , 19 - типичный вид растений, который обитает в средах от тропических до умеренных Зон и наиболее изучен во всем мире. - Во-вторых, проверьте образцы сыворотки, указанные на шаге 2.3, чтобыSIgEs для целых аллергенов для присутствия sIgEs для аллергенных компонентов Бермудских островов [Cyn d 1 (g216)], Timothy [Phlp 1 (g205), Phl p 4 (g208), Phl p 5 (g215), Phl p 6 (g209) ), Phl p 7 (g210), Phl p 11 (g211) и Phl p12 (g212)], и перекрестно-реактивные углеводные детерминанты [CCD (o214)]. Следуйте инструкциям в Разделе 3.
3. Полностью автоматизированная процедура тестирования с использованием системы анализа иммуноанализа
ПРИМЕЧАНИЕ. Вся процедура тестирования аллергена sIgE, которая полностью автоматизирована и была описана в других разделах 7 , 8 , 9 , 10 , соответствует протоколу изготовителя.
- Начните полностью автоматизированный анализатор иммуноанализа ( например, ImmunoCAP1000) и используйте его для проведения иммуноанализа на протяжении всего исследования. Включите встроенный компьютер управления данными (IDM).
ПРИМЕЧАНИЕ: аналог иммуноанализаYzer обычно находится в режиме ожидания. - При включенной функции «Первичная мощность» включите «Системное питание» и подождите 3 минуты, пока не запустится встроенное программное обеспечение. Нажмите «Load Rinse Solution» и «Загрузить решение для стирки».
- Добавьте 140 мкл сыворотки во флакон для каждого теста на аллерген / аллерген. Обозначьте каждый флакон, содержащий 140 мкл сыворотки с идентификационным номером, уникальным для каждого пациента.
- В интерфейсе IDM выполните следующие шаги, щелкнув меню.
- Проверьте окно «Список запросов» на IDM, чтобы убедиться, что «sIgE» является выбранным методом тестирования.
- Загрузите пробирки для образцов в стойки для образцов и трубки контроля качества в стойки контроля качества со штрих-кодами.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для каждого пациента первоначально было запланировано тестирование для sIgE на 3 специфических аллергена и 8 компонентов аллергена, или 346 * 11 (3,806) пробы. Для каждой пробоотборной трубки 3 трубки контроля качестваКоторые содержат низкие, средние и высокие уровни контроля sIgE (см. Таблицу материалов для деталей). В конце концов, только 58 пациентов, которые испытывали положительный результат в первичном тесте (этап 2.3), были дополнительно исследованы во вторичном тесте (шаг 2.3). Загрузка труб может быть автоматически установлена на компьютерную консоль. - Выберите «Загрузка реагентов» на экране «Обработка анализа». Завершите загрузку образцов и контрольно-контрольных стеллажей, раствора для разработки, конъюгата, калибраторов, носителей, наконечников пипеток, стоп-раствора и моющего раствора в соответствии с «Загрузочным списком» (подробнее см. Таблицу материалов ).
- В разделе «Загрузка и запуск» нажмите «ОК».
ПРИМЕЧАНИЕ. В конце измерения результаты отображаются в IDM. - В интерфейсе IDM выберите данные для экспорта. Нажмите «Меню», «Утвердить» и «Сохранить как» и экспортируйте результаты измерения sIgE в виде файла электронной таблицы. Импортируйте файл электронной таблицы в статистическое программное обеспечение ( например, SPSS) 10 . Используя специальный модуль для коэффициентов Спирмена из меню SPSS, проанализируйте корреляции в сенсибилизации между этими пыльцами травы (положительный sIgE для всего аллергена) и компонентами пыльцы (положительные sIgE для молекул аллергенов).
4. Определение реактивности sIgE
ПРИМЕЧАНИЕ. Для образца неразбавленной сыворотки диапазон удельного IgE-измерения составляет от 0,35 до 100 кU / л.
- Разбавьте образцы с помощью значений sIgE> 100 кU / л 1: 5 и повторного анализа. Если значение остается выше 100 кU / л, продолжайте дальнейшие разведения до достижения конечного уровня до 1000 кU / л.
- Исходя из порогового значения 0,35 кU / л, рассмотрим уровень sIgE, превышающий 0,35 кU / л, положительный 5 , 7 , 10 . Оцените реактивКласс sIgE: класс 1 (≥0,35 и <0,70 кU / л), класс 2 (≥0,70 и <3,50 кU / л), класс 3 (≥3.50 и <17.50 кU / л), класс 4 (≥ 17.50 и <50.00 кU / л), класс 5 (≥50.00 и <100.00 кU / л) и класс 6 (≥100.00 кU / л).
5. Статистический анализ
- Анализ данных со статистическим программным обеспечением ( например, SPSS) 10 . Сообщите количественные данные как среднее и стандартное отклонение, качественные данные как медианные и межквартильные диапазоны (IQR), так и категориальные данные как долю положительных результатов.
- Используйте критерий хи-квадрат для сопоставления пропорций между группами, непарный t-критерий для количественных данных и критерий ранга для качественных данных.
- Используйте тест Пирсона для анализа корреляции между параметрическими данными с коэффициентами корреляции, выраженными как «r», и критерием Спирмена для непараметрических значений, при этом tКоэффициенты корреляции, выраженные как « r s» . Рассмотрим статистическую значимость, когда P- значения <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Полностью автоматизированный анализатор иммуноанализа, используемый в этом исследовании, имеет твердофазную структуру, покрытую ковалентно связывающими аллергенами или компонентами аллергена, которые реагируют с представляющими интерес молекулами (sIgE) в образцах сыворотки от пациента. С помощью автоматической программы анализатор смывает все неспецифические IgE 150 мкл раствора для полоскания и повторяет это 5 раз. Затем он добавляет фермент-меченые антитела против IgE (50 мкл) для образования комплекса. Меченое ферментом антитело против IgE (конъюгат) представляет собой вторичное антитело, которое связывается с определенным IgE. Несвязанные анти-IgE-антитела удаляют путем промывания 150 мкл промывочного раствора (повторяют 3 раза). Связанный комплекс обрабатывают проявляющим агентом (50 мкл) в течение 9 мин при 37 ° С. Развивающий агент представляет собой фермент-переваривающий агент, который отсекает все связанные антитела против IgE. Последний испускает флуоресценцию в щелочном состоянии. Реакцию останавливаютДобавление щелочного стоп-раствора. После этого прибор сжимает твердофазную структуру, чтобы выжать элюат и измерить флуоресценцию полученного элюата на длине волны 470 нм. Флуоресценция линейно коррелирует с абсолютным уровнем интересующих молекул аналита в элюате. Более высокое значение флуоресценции означает больше sIgE в образце сыворотки. Чтобы интерпретировать результаты испытаний, система автоматически преобразует ответы для образцов в концентрации с использованием калибровочной кривой. Данные измерений передаются электронным способом в программное обеспечение IDM, которое объединяет функции для расчета аналитических результатов, расчета статистики и представления результатов.
Следуя критериям включения и исключения, настоящее исследование исследовало сыворотку у 346 пациентов. Исследовательская группа включала 78 субъектов с аллергическим ринитом в одиночку, 92 с только астмой и 88 сопутствующихС астмой и ринитом. Контрольная группа включала 88 пациентов с невоспалительными аллергиями. Эти пациенты были в возрасте 1-87 лет и были подтверждены как постоянные жители из всех частей Большого Гуанчжоу, целевого региона исследования. Все исследовательские комиссии и контрольная группа были сопоставимы по демографическим и социальным характеристикам, включая пол, возраст и историю семьи. Из пациентов в группе исследования 22,5% опробовали положительный результат на траву Бермудских островов, 13,6% на траву Тимоти и 7,0% на Humulus scandens . В исследовательской группе частота сенсибилизации к любой пыльной пыльце была намного выше, чем в контрольной группе ( таблица 1 ). Все отрицательные пациенты с травами бермудской травы также были отрицательными для травы Тимофея и Хумулуса . Интересно отметить, что у пациентов с аллергическим ринитом и / или астмой наблюдалась значительно более высокая степень сенсибилизации до бермудской травы (n = 58, 22,5%), чем у пациентов с другими аллергиями (n = 4, 4,5%).
scandens или CCD была ниже 30%. Напротив, у пациентов с реакционной способностью Бермудской травы класса 4 была 67-100% вероятность сопутствующей положительности к Cyn d 1, аллергенам травы Тимоти, Humund scandens или CCD ( рисунок 1 ). Уровни реактивности на бермудской трассе продемонстрировали значительную корреляцию с шансами на положительность к другим IgEs пыльцы травы ( r s = 0.669, P <0.001).
Сенсибилизация тимовой травы была дополнительно оценена sIgE компонентам травы Тимоти. Среди 35 пациентов с травоподобными травами Тимоти наиболее часто определяемым компонентом аллергена был Phl p 4 (100%, 35/35), а затем Phl p 1(17,1%, 6/35). Три пациента (3/35, 8,6%) были положительными для любого из Phl p 5, 6, 7, 11 и 12 ( таблица 2 ). Уровни сыворотки Phl p 4 sIgE сильно коррелировали с общими уровнями аллергена травы Тимоти и CCD ( r s = 0,941 и 0,928, соответственно, P <0,001, таблица 3 ). 41,4% (24/58) бермудских травянистых пациентов и 68,6% (24/35) пациентов с чувствительностью к травам Тимоти были устойчивы к ПЗС. Анализ корреляции рангов Спирмена показал значительную связь в сенсибилизации между ПЗС и другими аллергенами травы ( табл. 3 ).
Рисунок 1: Совместная сенсибилизация среди пациентов, положительно влияющих на траву Бермудских островов.
Этот показатель показывает процент пациентов с различными классами реакционной способности sIgE для травы Бермудских островов (n = 58) и сопутствующейМуравьиной чувствительности к траве Тимоти, Humund scandens , CCD и другим компонентам аллергена травы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Частота положительных тестов [% (n / пациентов)] | |||
| Бермудская трава | Тимоти-трава | Гумулюс сканденс | |
| Пациенты с AR и / или AS | 22,5% (58/258) †† ‡ | 13,6% (35/258) † | 7,0% (18/258) |
| Пациенты с AR | 21,8% (17/78) †† | 10,2% (8/78) | 7,7% (6/78) |
| Пациенты с AS | 22,8% (21/92)†† | 14,1% (13/92) † | 5,4% (5/92) |
| Пациенты с AR и AS | 22,7% (20/88) †† | 15,9% (14/88) | 8,0% (7/88) |
| Возраст | |||
| <14 лет или младше | 18,6% (8/43) | 14,0% (6/43) | 7,0% (3/43) |
| > 4 года | 23,3% (50/215) | 13,5% (29/215) | 7,0% (15/215) |
| секс | |||
| мужчина | 25,7% (35/136) | 13,9% (19/136) | 7,4% (10/136) |
| женский | 18,8% (23/122) | 13,1% (16/122) | 6,6% (8/122) |
| Пациенты с другой аллергией | 4,5% (4/88) ** | 1,1% (1/88) ** | 0 * |
Таблица 1: Пациенты с sIgE-положительными испытаниями для травы Бермудских островов, Тимоти Трасс и Humulus scandens , основанные на сущности и демографических данных. Более высокая доля пациентов с аллергическими респираторными заболеваниями была положительной для бермудской травы (χ 2 = 14,35, P <0,001), травы Тимоти (χ 2 = 10,88, P <0,001) и Humulus scandens (χ 2 = 5,14, P = 0,02 ) Против других контролей аллергии ( ** P <0,01, * P <0,05). Доля пациентов с положительным тестом на бермудских травах была значительно выше, чем доля травы Тимоти ( ‡; P <0,05) и Humulus scandens ( †† P <0,01). Доля пациентов с положительным тестом Тимофея была выше, чем у Humulus scandens ( † P <0,05). Доля положительных тестов на траву Бермудских островов, травы Тимоти и Humulus scandens sIgE существенно не менялась между группами несовершеннолетних и взрослых (χ 2 = 0,07, P = 0,79, χ 2 = 0,06, P = 0,80, χ 2 = 0,11, P = 0,74 соответственно). Показатели чувствительности пыльцы травы не были статистически различны между мужчинами и женщинами (χ 2 = 1,338, P = 0,25, χ 2 = 0,063, P = 0,80, χ 2 = 0,38, P = 0,54 соответственно). Аналогично, между ринитом и пациентами с астмой не было выявлено существенных различий в показателях чувствительности (χ 2 = 0,030, P = 0,985, χ 2 P = 0,558; Χ 2 = 0,528, P = 0,768; соответственно).
| Пациенты (%) | Phl p 4 | Phl p 1 | Phl p 5 | Phl p 6 | Phl p 11 | Phl p 7 | Phl p 12 | |
| 28 (80,0%) | + | |||||||
| 4 (11,4%) | + | + | ||||||
| 1 (2,9%) | + | + | + | + | + | + | ||
| 2 (5,7%) | + | + | + + | + | + | + | ||
| Всего | 35 (100%) | 6 (17,1%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | |
| SIgE a (kU / L) | 0,52, 0,06-2,02 | 0,02, 0,01-0,10 | 0,04, 0,03-0,24 | 0,12, 0,03-0,34 | 0,05, 0,02-0,27 | 0,03, 0,02-0,36 | 0,10, 0,04-0,28 |
Таблица 2: Сенсибилизация Тимоти Трасса в соответствии с позитивностью sIgE и уровнями компонентов Timothy Grass (N = 35). +, Положительные тесты; A , sIgE (kU / L) показаны как медиана и IQR. Из 35 пациентов с положительным падением тимовой травы 80,0% были исключительно Phl p 4-позитивными, а 11,4% были положительными к Phl p 4 или Phl p 1.
| аллерген | Бермудские острова | Тимоти | Гумулюс сканденс | CCD |
| Бермудские острова | - | 0,709 ** | 0,682 ** | 0,565 ** |
| Cyn d 1 | 0,583 ** | 0,787 ** | 0,751 ** | 0,865 ** |
| Тимоти | 0,709 ** | - | 0,921 ** | 0,856 ** |
| Phl p 4 | 0,645 ** | 0,941 ** | 0,886 * | 0,928 ** |
| Phl p 1 | 0,616 ** | 0,681 ** | 0,712 ** | 0,507 ** |
| Phl p 5 | 0,46 | 0,273 | 0,590 * | 0,624 * |
| Phl p 6 | 0.445 | 0,306 | 0,583 * | 0,569 |
| Phl p 7 | 0,681 * | 0,481 | 0,632 * | 0,531 |
| Phl p 11 | 0,589 * | 0,372 | 0,620 * | 0,568 |
| Phl p 12 | 0,671 * | 0,411 | 0,565 | 0,446 |
| Гумулюс сканденс | 0,682 ** | 0,921 ** | - | 0,853 ** |
Таблица 3: Коэффициенты корреляции † для положительности между ПЗС и аллергенами пыльцы травы. † представлен как коэффициент корреляции r s ; Корреляционный анализ Спирмена был выполнен для этого непараметрического набора данных. * P <0,05, ** P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Полностью автоматизированные анализаторы иммуноанализа могут обеспечить удовлетворительную согласованность между регионами, лабораториями и учреждениями и с течением времени. Было обнаружено, что такая автоматическая процедура в значительной степени поддерживает лабораторные исследования и клинические исследования, позволяет стандартизовать обнаружение многих аллергенов и / или аллергенных компонентов и выявлять вероятную аллергическую перекрестную реактивность, которая не была бы легко обнаружена до появления CRD. Более того, вся процедура тестирования может быть выполнена со строгим контролем качества, что позволяет использовать высокопроизводительные методы, как того требует обзор большого географического региона. Хотя процедура тестирования в основном управляется компьютерной консолью, следует обратить внимание на несколько важных вопросов. Обязательно, чтобы прибор использовался в строгом соответствии с руководством пользователя; Любая аберрация может привести к ненужным ошибкам теста, механическим повреждениям или личной травме от лазерного луча или высокого электрического напряжения. Всегда enУбедитесь, что в системе сохранена правильная и правильная калибровочная кривая, так как это связано с точностью теста. В противном случае концентрацию sIgE указанного калибратора следует измерять до испытаний образцов сыворотки. Впоследствии система может автоматически вычислять и сохранять калибровочную кривую для последующего использования. Как и в других лабораторных методах, важно также соблюдать безопасность манипуляций с сывороткой человека для защиты техников от инфекций и во избежание загрязнения окружающей среды.
Впервые, используя полностью автоматизированный анализатор иммуноанализа как подход CRD, это исследование показало значительную распространенность положительной реакции Бермудской травы (22,5%) у пациентов с аллергическим ринитом и / или астмой в Гуанчжоу, на юге Китая. Поскольку травы Тимоти и Хумулус не являются обычными, даже несуществующими в Гуанчжоу, показатели положительности травы Тимоти (13,6%) и Humulus scandens sIgE (7,0%) мAy можно отнести к перекрестной реактивности среди пыльцы травы.
Проанализировав аллергены пыльцы травы, было ясно показано, что все пациенты с положительным IgE-положительным течением Тимоти также были положительными к специфическому антигену травы Тимоти Phl p 4. Очень немногие (17,1%) испытывали положительный результат на Phl p 1, что на удивление отличалось от данных В Европе, где скорость положительности к Phl p 1 намного выше, чем у Phl p 4 18 , 20 , 21 . Поскольку Phl p 1 является основным компонентом травы Тимоти, преобладающая степень положительности Phl p 4 по сравнению с Phl p 1 в этой популяции исследования также может предполагать вероятную кросс-реактивность, отличную от «подлинной» сенсибилизации, поскольку Phl p 4 имеет структурное сходство С ПЗС и рядом других аллергенов, включая деревья, овощи и тропические фрукты 19 , 22 , 23, 24 . Клиническая значимость этого наблюдения может заключаться в том, что большинство пациентов с травяным положительным эффектом Тимоти в этом исследовании никогда не должны были получать иммунотерапию Тимоти Трау, в которой в настоящее время используется Phl p 1 25 .
Следует упомянуть несколько ограничений методов и методов исследования. Во-первых, поскольку до трех различных калибраторных полосок можно помещать в лоток для пипетки / реагента в анализаторе иммуноанализа, максимум в три тестовые партии можно запускать одновременно. Когда требуется большая рабочая нагрузка, как и при проведении большего регионального обследования, для обработки все еще требуется значительное количество времени. Во-вторых, перекрестная реактивность с IgA IgA, IgD, IgM и IgG человека не проявляется при физиологических концентрациях при использовании анализатора из этого исследования, поэтому необходимы другие исследовательские подходы при перекрестной реактивности с этими иммуноглобулинами. В-третьих, несмотря на изощренностьE, результаты, сделанные с помощью полностью автоматизированного анализатора иммуноанализа, не должны заменять другие лабораторные исследования, клинические оценки и опыт врача при проведении окончательного диагноза. В-четвертых, из-за позднего введения аллергена CRD в Китае несколько коммерческих продуктов субтропических компонентов пыльцы травы недоступны или до недавнего времени не были одобрены для исследований. Поэтому использование этого метода в качестве CRD-подхода для аллергенов в значительной степени зависит от коммерческой доступности поставок продукта от производителя для конкретного использования в регионе. В тропических и субтропических регионах с вездесущей сложностью пыльцы растений исследование CRD может быть недостаточным и трудным из-за отсутствия соответствующих аллергенных продуктов для тестов. Такая дилемма может значительно снизить эффективность этой техники.
Тем не менее, насколько нам известно, это новаторское исследование, в котором используется подход CRD tO изучить сенсибилизацию к аллергенам пыльцы травы в южном Китае. Дальнейшие исследования могут продолжаться в этом ключе и подтверждать эти результаты.
До сих пор методы, использующие полностью автоматический анализатор иммуноанализа, были приняты в качестве золотого стандарта для испытаний in vitro аллергенов sIgE 26 , 27 . Учитывая очень ограниченные данные о сенсибилизации аллергенов на обширной территории Китая, исследования с большой выборкой с использованием полностью автоматизированного иммуноанализа в качестве подхода CRD могут заполнить пробелы и добавить доказательства, доступные в этой области. Важно отметить, что такие исследования, как правило, многоцентровое и общенациональное сотрудничество, могут потребовать создания сетей иммунологических анализов на основе протокола для стандартизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Юэминга Су за его помощь в подготовке фигуры. Это исследование финансировалось Фондом науки и технологий провинции Гуандун (проект № 2014A020212352), Бюро образования Гуанчжоу (1201630044, 1201630393) и Национальным научным фондом Китая (NSFC 81572063, NSFC 81601394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImmunoCAP 1000 Instrument | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3800-01 | |
| Phadia Information Data Manager Software Package | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-11 | |
| Software Package, ImmunoCAP 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-12 | |
| g2 (Bermuda grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4131-01 | |
| g6 (Timothy grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4100-01 | |
| w22 (Japanese Hop) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4452-01 | |
| g216 (nCyn d 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4972-01 | |
| g205 (rPhl p 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5234-01 | |
| g208 (nPhl p 4) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5288-01 | |
| g215 (rPhl p 5b) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5338-01 | |
| g209 (rPhl p 6) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5289-01 | |
| g210 (rPhl p 7) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5290-01 | |
| g211 (rPhl p 11) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5291-01 | |
| g212 (rPhl p 12) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5292-01 | |
| o214 Cross-reacting carbohydrate determinants (CCDs) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5339-01 | |
| Specific IgE Conjugate 400 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9310-08 | |
| Specific IgE Calibrator Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9459-08 | |
| Specific IgE Curve Control Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9312-08 | |
| Specific IgE Anti-IgE ImmunoCAP | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4417-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Negative Control | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9445-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control L | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9528-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control M | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9529-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control H | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9530-01 | |
| Development Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9439-08 | |
| Stop Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 34-2271-58 | |
| Washing Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9202-08 | |
| FluoroC | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9264-01 | |
| Maintenance Solution Kit | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9476-01 |
References
- Scadding, G. K. BSACI guidelines for the management of allergic and non-allergic rhinitis. Clin Exp Allergy. 38 (1), 19-42 (2007).
- Pollart, S. M., Reid, M. J., Fling, J. A., Chapman, M. D., Platts-Mills, T. A. Epidemiology of emergency room asthma in northern California: association with IgE antibody to rye grass pollen. J Allergy Clin Immunol. 82 (2), 224-230 (1988).
- Wang, Q. Lower airway inflammation and hyperresponsiveness in non-asthmatic patients with non-allergic rhinitis. J Thorac Dis. 7 (10), 1756-1764 (2015).
- Ma, Y. The link between mold sensitivity and asthma severity in a cohort of northern Chinese patients. J Thorac Dis. 7 (4), 585-590 (2015).
- Luo, W. Major grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Mol Immunol. 78, 105-112 (2016).
- Zhang, Y., Zhang, L. Prevalence of allergic rhinitis in china. Allergy Asthma Immunol Res. 6 (2), 105-113 (2014).
- Zeng, G., Zheng, P., Luo, W., Huang, H., Wei, N., Sun, B. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Mol Immunol. 74, 1-9 (2016).
- Kleine-Tebbe, J., Matricardi, P. M., Hamilton, R. G. Allergy work-up including component-resolved diagnosis: how to make allergen-specific immunotherapy more specific. Immunol Allergy Clin North Am. 36 (1), 191-203 (2016).
- Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, southern China. PLoS One. 9 (5), e94776 (2014).
- Zeng, G. Component-resolved diagnostic study of Dermatophagoides pteronyssinus major allergen molecules in a southern Chinese cohort. J Investig Allergol Clin Immunol. 25 (5), 343-351 (2015).
- Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma (ARIA). Management of Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma Pocket Guide. , Available from: http://www.whiar.org/docs/ARIA_PG_08_View_WM.pdf (2015).
- Global Initiative for Asthma (GINA). Pocket Guide for Asthma Management and Prevention. , Available from: http://ginasthma.org/wp-content/uploads/2016/01/GINA_Pocket_2015.pdf (2015).
- Liu, J., Guo, A., Guo, H. Morphological variation and types of Cynodon dactylon. Acta Prataculture Sinica. 12 (6), 99-104 (2003).
- Zhang, H., Xi, J. Study on the germplasm resource and ecological characteristics of wild carpet grass (Axonopus compressus) in Guangdong. Grassland and Turf. 13 (1), 25-28 (2005).
- Kao, S. H., Su, S. N., Huang, S. W. Sub-proteome analysis of novel IgE-binding proteins from Bermuda grass pollen. Proteomics. 5 (14), 3805-3813 (2005).
- Ouyang, Y. H., Zhang, D. S., Fan, E. Z., Li, Y., Zhang, L. Correlation between symptoms of pollen allergic rhinitis and pollen grain spreading in summer and autumn. Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Waike Zazhi. 47 (8), 623-627 (2012).
- Westritschnig, K. Analysis of the sensitization profile towards allergens in central Africa. Clin Exp Allergy. 33 (1), 22-27 (2003).
- Rossi, R. E., Monasterolo, G., Monasterolo, S. Measurement of IgE antibodies against purified grass-pollen allergens (Phl p 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, and 12) in sera of patients allergic to grass pollen. Allergy. 52 (12), 1180-1185 (2001).
- Zafred, D., Nandy, A., Pump, L., Kahlert, H., Keller, W. Crystal structure and immunologic characterization of the major grass pollen allergen Phl p 4. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 696-703 (2013).
- Chabre, H. Molecular variability of group 1 and 5grass pollen allergens between Pooideae species: implications for immunotherapy. Clin Exp Allergy. 40 (3), 505-519 (2010).
- Mari, A. Skin test with a timothy grass (Phleum pratense) pollen extract vs.IgE to a timothy extract vs. IgE to rPhl p 1 rPhl p 2, nPhl p 4, rPhl p 5, rPhl p 6, rPhl p 7, rPhl p 11, and rPhl p 12: epidemiological and diagnostic data. Clin Exp Allergy. 33 (1), 43-51 (2003).
- Grote, M., Stumvoll, S., Reichelt, R., Lidholm, J., Rudolf, V. Identification of an allergen related to Phl p 4, a major timothy grass pollen allergen, in pollens, vegetables, and fruits by immunogold electron microscopy. Biol Chem. 383 (9), 1441-1445 (2002).
- Andersson, K., Lidholm, J. Characteristics and immunobiology of grass pollen allergens. Int Arch Allergy Immunol. 130 (2), 87-107 (2003).
- Tripodi, S. Molecular profiles of IgE to Phleum pratense in children with grass pollen allergy: implications for specific immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 129 (3), 834-839 (2012).
- Stumvoll, S., et al. Purification, structural and immunological characterization of a timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen Phl p 4, with cross-reactive potential. Biol Chem. 383 (9), 1383-1396 (2002).
- Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Ann Allergy Asthma Immunol. 99 (1), 34-41 (2007).
- Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (IgE) tests performed by different assay systems. J Allergy Clin Immunol. 121 (5), 1219-1224 (2008).
