Summary
Dette værk beskriver en protokol, der anvender en komponent-løst tilgang til at studere sensibilisering til græs pollenallergener i en kohorte af patienter fra det sydlige Kina med allergisk rhinitis og / eller astma.
Abstract
Sensibilisering til græs pollen pålægger en global risiko for allergiske luftvejssygdomme. Selvom forebyggelse er afhængig af lokal undersøgelse af pollenallergenerne, er data om dette emne begrænset i det sydlige Kina. Eventuelle tilgængelige data blev opnået ved hjælp af selvrapporterede spørgeskemaer, hudpricktest og samlede eller specifikke IgE-test ved anvendelse af råekstrakter. Af mange grunde er disse metoder upålidelige. Serum sIgE reaktivitet over for Bermuda græs, Timothy græs og Humulus scandens allergener i en kohorte af patienter fra Greater Guangzhou (den sydlige Kinas største by og dens udkanter) med allergisk rhinitis og / eller astma blev undersøgt ved hjælp af en fuldt automatiseret immunoassay analysator som en komponent CRD-værktøj.
For første gang blev en betragtelig høj forekomst af Bermuda græs sIgE positivitet påvist hos kinesiske sydøere med allergisk rhinitis og / eller astma. I disse patienter er en subtil forekomst af sensibiliseringTil Timothy græs og Humulus skandaler blev også bemærket, hvilket kan opstå ved krydsreaktivitet, da de sidstnævnte to ikke er almindelige i regionen. Dette blev også understøttet af påvisning af allergenbestanddele.
Fuldautomatiserede immunanalysatorer kan tilbyde tilfredsstillende sammenhæng mellem regioner, laboratorier og institutioner og over tid. Instrumentets automatik kan muliggøre en standardiseret detektion, som ikke ville være blevet afsløret umiddelbart før CRD's fremkomst.
Dette er en undersøgelse, der bruger en CRD-tilgang til at undersøge sensibilisering til græspollenallergener i det sydlige Kina. Det tilføjer til aktuelle beviser i litteraturen. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at validere disse resultater. Selvom CRD er et nyttigt redskab, bør resultaterne fra den fuldt automatiserede immunanalysator ikke erstatte andre laboratorieundersøgelser, kliniske evalueringer og lægeekspertise.
Introduction
Græspollen står for næsten 50% af immunoglobulin E (IgE) -relaterede allergier og på grund af dets luftbårne natur pålægger en global risiko for allergiske luftvejssygdomme, især astma og allergisk rhinitis 1 , 2 , 3 , 4 . Forebyggelse mod græs pollenallergi i en region er afhængig af information om den lokale fordeling af pollenallergenerne. Desværre varierer spektret af de sensibiliserende allergener fra sted til sted-en observation, der generelt er kendt som regional specificitet.
I Kina er en stor østasiatisk territorium den regionale specificitet af græspollenfølsomhed yderligere kompliceret af begrænsede data, som i øjeblikket er tilgængelige fra den sydlige del af dette land i de seneste årtier 5 . En sådan ulempe i data har ført til et problem med at vise den samlede græs pollen sensiI dette store land 6 . Derudover blev de meget begrænsede data om kinesiske sydborgere hovedsageligt hentet fra selvrapporterede spørgeskemaer, hudpricktest (i stedet for laboratorieserumtest), samlede IgE-målinger (i stedet for allergenspecifikke IgE (sIgE)) og sggE-detektion til allergener ( Snarere end til allergenkomponentmolekyler).
Selvrapporteringen af allergiske symptomer kan være upålidelig, når der er tale om specifikke allergener. Hudpricktest, selv om det er bredt tilgængeligt, involverer anvendelse af ikke-standardiserede rågenergenekstrakter, som selv kan indeholde andre sensibiliserende komponenter, der forstyrrer resultatetolkningen. Pålideligheden af hudpricketest er også kritisk afhængig af dygtige manipulationer hos allergikere eller specialiserede sygeplejersker, nyligt brug af histamin og patientoverholdelse (nogle gange meget vanskeligt for små børn). I alt IgE er nyttigt til screening af en allergi, men bestemmer ikke fornuftigtE krænkende allergener hos en patient. Desuden indeholder næsten alle allergener en række allergenkomponentmolekyler. Sensibilisering til hovedkomponenterne ( dvs. Der p 1 og Der p 2 fra husstøvmider) kan foreslå en "ægte" allergi (allergi over for et specifikt allergen i stedet for falsk positivitet på grund af krydsreaktioner med andre allergener), men sensibilisering Til visse ( dvs. den krydsreaktive Der p 10, et tropomyosin) må ikke 7 .
Inden der blev introduceret komponentopløset diagnostik (CRD), forhindrede disse skuffende tilbageslag allergenstudier i Kina. CRD registrerer netop komponenterne i et allergen ved at anvende rekombinante eller rensede allergenmolekyler, hvorved målingen nemt kan kvantificeres og karakteriseres 8 . I de sidste årtier har allergiundersøgelser ofte anvendt råekstrakter af allergener, som uundgåeligt indeholder en række irrelevante komponenter. Mange af disse coMponents er inerte, men nogle gange kan nogle føre til forstyrrende positive reaktioner. Anvendelsen af rekombinante eller rensede allergenmolekyler i CRD kan omgå dette og giver derfor bedre testnøjagtighed. Når der behandles i mikroarrays, skifter en CRD-tilgang hurtigt eller identificerer sensibilisering til hundredvis af allergenmolekyler i enkelte forsøgspersoner. Et veludformet CRD-studie om græspollenfølsomhed i det sydlige Kina mangler i øjeblikket. Ideelt set bør en sådan undersøgelse omfatte en lokal befolkning med stor geografisk dækning, redegør for græspollens, der almindeligvis rapporteres i Kina, og adresserer de ovennævnte tekniske aspekter. For at nå et praktisk niveau af klinisk relevans og for at lette rekruttering af serumprøver, kan tidlig undersøgelse af sensibilisering til græspollens som inhalationsallergener også være fokuseret på patienter med allergiske respiratoriske sygdomme snarere end på den generelle befolkning.
Dette værk beskriver en metodeBruges til at teste serumgennemtrængende reaktivitet over for Bermuda græs, Timothy græs og Humulus scandens hos patienter fra Greater Guangzhou (Sydkinas største by og dets udkanter) med allergisk rhinitis og / eller astma ved hjælp af CRD tilgang 5 . Disse resultater om sensibilisering til disse subtropiske og tempererede græs pollen i det sydlige Kina tilføjer vigtige beviser til det, der aktuelt er i litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studieprotokollen, herunder anvendelse af human serumprøve, blev godkendt af etiske udvalg, første tilknyttet hospital i Guangzhou Medical University. Alle deltagere tilbød skriftligt informeret samtykke, enten uafhængigt eller via deres forældre (i tilfælde af børn). Protokollen er blevet registreret online (Chinese Clinical Trial Registry, Reg.nr .: ChiCTR-DCC-13004003, se http://www.chictr.org/cn/).
1. Identifikation af undersøgelsesbefolkningen
BEMÆRK: Allergi Information Repository of State Key Laboratory of Respiratory Disease (AIR-SKLRD) er den primære kilde til patientrekruttering, fordi AIR er den mest vel dokumenterede store database af patienter til allergenstest i det sydlige Kina 9 , 10 . AIR har lagret serumprøver af patienter i næsten et årti. Kort fortalt blev disse lagrede prøver fremstillet tidligere ved centrifugering 5 ml oF phlebotomized venøst blod i 10 minutter ved 3000 xg og udvinding af supernatanten. Serumprøverne blev anbragt i -80 ° C køleskabe til langvarig opbevaring. Prøver, der opfyldte patientinddragelseskriterier, var klare til brug for alle testninger i den foreliggende undersøgelse.
- Fra AIR-databasen hentes data om patienter med allergisk rhinitis og / eller astma, der gennemgik serumtest for græsallergen sIgE mellem januar 2013 og juni 2015, den forudbestemte studieperiode.
- Vælg patienter med mild til moderat allergisk rhinitis og / eller astma i henhold til den allergiske rhinitis og dens indvirkning på astma (ARIA) 11 og den globale strategi for astma (GINA) 12 retningslinjer. Tildel dem som "studiegruppen."
- Undgå patienter med ufuldstændige journaler, de tabte til opfølgning, dem, der nægter at give informeret samtykke om anvendelsen af deres serumprøver til videnskabelige formål, dem med identificeret IMmunodeficiency, dem der for øjeblikket er på immunterapi eller immunomodulerende midler, eller dem, der har fundet parasitære infektioner.
- Vælg en moderne kohorte af patienter med ikke-respiratoriske allergier ( dvs. eksem, allergisk dermatitis og fødevareallergi) i henhold til de samme udelukkelseskriterier og tildele dem som "kontrolgruppen".
- Sørg for, at serumprøverne blev opsamlet, inden der blev givet nogen recept eller behandlinger for at minimere forstyrrende virkninger på laboratoriefundene. Undtaget enhver serumprøve, der ikke opfylder dette krav.
- Sørg for, at alle fag er permanente beboere fra alle dele af Greater Guangzhou ( dvs. født eller boet der i mere end 10 år).
2. Studiestrøm og måling af interesse
- Hent serumprøver af berettigede patienter fra bio-banken. For at teste en allergen / allergen komponent skal du bruge 140 μL serum (inklusive 100 μL til at fyldeOp i det døde rum).
BEMÆRK: Det maksimale totale serumvolumen, der kræves for hver patient i denne undersøgelse, er: 3 specifikke allergener og 8 allergenkomponenter, sIgE = 140 μL * 11 = 1,540 μL. - Når du bruger dette instrument, testes serumprøverne for sIgEs primært på hele allergener af Bermuda græs, Timothy græs og Humulus scandens . Følg instruktionerne i afsnit 3.
BEMÆRK: Disse pollen blev udvalgt til målingerne, fordi Bermuda græs 13 , 14 , 15 og Humulus scandens 16 er blevet rapporteret bredt i Kina, mens Timothy græs 17 , 18 , 19 er en typisk planteart, der lever i miljøer fra tropisk til tempereret Zoner og er mest undersøgt over hele verden. - Test sekundært de serumprøver, der er identificeret i trin 2.3, for at haveSygger over for hele allergener for tilstedeværelsen af syger til allergenbestanddele i Bermuda [Cyn d 1 (g216)], Timothy [Phlp 1 (g205), Phl p4 (g208), Phl p5 (g215), Phl p6 (g209) ), Phl p7 (g210), Phl p11 (g211) og Phl p12 (g212)] og krydsreaktive kulhydratdeterminanter [CCD (o214)]. Følg instruktionerne i afsnit 3.
3. Fuldautomatiseret testprocedure ved anvendelse af Immunoassay Analysesystemet
BEMÆRK: Hele proceduren for allergen sIgE test, som er fuldt automatiseret og er beskrevet andetsteds 7 , 8 , 9 , 10 , følger producentens protokol.
- Start den fuldt automatiserede immunoassayanalysator ( f.eks. ImmunoCAP1000) og brug den til at udføre immunoassayet gennem hele undersøgelsen. Tænd den indbyggede Information Data Management (IDM) computer.
BEMÆRK: Immunanalysen analYzer er rutinemæssigt i standby-tilstand. - Med "Primary Power" tændes "System Power" og venter 3 minutter, indtil den indbyggede software starter. Klik på "Load Rinse Solution" og "Load Washing Solution."
- Tilsæt 140 μL serum til et hætteglas for hver allergen / allergenkomponent test. Mærk hvert hætteglas indeholdende 140 μl serum med et identifikationsnummer, der er unikt for hver patient.
- Fra IDM-grænsefladen udføres følgende trin ved at klikke på menuen.
- Kontroller vinduet "Request List" på IDM for at sikre, at "sIgE" er den valgte testmetode.
- Læg prøverørene ind i prøveholdere og kvalitetsstyringsrørene i kvalitetskontrolhylderne med stregkoder.
BEMÆRK: For hver patient blev testningen oprindeligt planlagt for sIgE til 3 specifikke allergener og 8 allergenkomponenter eller 346 * 11 (3.806) prøverør. For hver prøve rør, 3 kvalitetskontrol rørDer indeholder lave, mellemstore og høje niveauer af sig kontrol (se Materialebordet for detaljer) blev matchet. Til sidst blev kun 58 patienter, der testede positivt i den primære test (trin 2.3) undersøgt yderligere i den sekundære test (trin 2.3). Indlæsningen af rør kan indstilles automatisk på computerens konsol. - Vælg "Load Reagents" i "Assay Processing" skærmen. Udfyld prøveudtagningen og kvalitetsstyringsholderne, udviklingsopløsningen, konjugatet, kalibratorerne, bæreren, pipettespidserne, stopopløsningen og vaskeopløsningen i henhold til "Loadlist" (se materialebladet for detaljer).
- I "Load and Start" trykkes "OK".
BEMÆRK: I slutningen af målingen vises resultaterne på IDM. - Fra IDM-grænsefladen skal du vælge de data, der skal eksporteres. Klik på "Menu", "Godkendelse" og "Gem som" og eksporter de sIgE måleresultater som en regnearkfil. Importer regnearkfilen til en statistisk software ( f.eks. SPSS) 10 . Ved hjælp af et specifikt modul for Spearmans koefficienter fra SPSS-menuen analyseres korrelationerne i sensibilisering mellem disse græspollerne (positive sIgE til hele allergen) og pollenkomponenter (positive sIgE til allergenmolekyler).
4. Definition af sIgE Reaktivitet
BEMÆRK: For et ufortyndet serumprøve er intervallet af specifik IgE-måling 0,35 til 100 kU / L.
- Fortynd prøverne med sIgE værdier> 100 kU / L 1: 5 og genassay. Hvis værdien forbliver højere end 100 kU / L, fortsæt med yderligere fortyndinger, indtil et slutpunktniveau op til 1000 kU / L nås.
- Baseret på tærskelværdien på 0,35 kU / L, overvej et sIgE-niveau på over 0,35 kU / L for at være positivt 5 , 7 , 10 . Vurder den reaktiveKlasse 1 (≥0,35 og <0,70 kU / L), klasse 2 (≥0,70 og <3,50 kU / L), klasse 3 (≥3,50 og <17,50 kU / L), klasse 4 17,50 og <50,00 kU / L), klasse 5 (≥50,00 og <100,00 kU / L) og klasse 6 (≥100,00 kU / L).
5. Statistisk analyse
- Analysér dataene med statistisk software ( f.eks. SPSS) 10 . Rapportér de kvantitative data som middel- og standardafvigelsen, de kvalitative data som median- og interkvartilintervallerne (IQR) og de kategoriske data som andelen af positive resultater.
- Brug en chi-square test for mellem-gruppe sammenligning af proportioner, en uparget t-test for kvantitative data og en rang-sum test for kvalitative data.
- Brug Pearson's test for korrelationsanalyser mellem parametriske data med korrelationskoefficienterne udtrykt som "r" og Spearman's test for ikke-parametriske værdier med tHan korrelationskoefficienter udtrykt som " r s ." Overvej statistisk betydning at være, når P- værdier <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den fuldt automatiserede immunoassayanalysator anvendt i dette studie har en fastfasestruktur dækket med kovalent koblingsallergener eller allergenkomponenter, der reagerer med de interessante molekyler (sIgE) i serumprøver fra patienten. Med et automatisk program vasker analysatoren alle ikke-specifikke IgE'er med 150 μl skyllemiddel og gentager dette 5 gange. Derefter tilføjer det enzymmærkede anti-IgE antistoffer (50 μl) for at danne et kompleks. Det enzymmærkede anti-IgE-antistof (konjugat) er et sekundært antistof, der binder til et specifikt IgE. Ubundne anti-IgE antistoffer elimineres ved vask med 150 μl vaskeopløsning (gentaget 3 gange). Det bundne kompleks behandles med et udviklingsmiddel (50 μl) i 9 minutter ved 37 ° C. Udviklingsmidlet er et enzymfordøjelsesmiddel, der afskærer alle bundne anti-IgE antistoffer. Sidstnævnte udsender fluorescens under alkalisk tilstand. Reaktionen stoppes medTilsætningen af alkalisk stopopløsning. Herefter komprimerer instrumentet fastfasestrukturen for at klemme eluatet ud og måle fluorescensen af det resulterende eluat ved en bølgelængde på 470 nm. Fluorescensen er lineært korreleret med det absolutte niveau af analytmolekylerne af interesse i eluatet. En højere fluorescensværdi betyder mere sIgE i serumprøven. For at fortolke testresultaterne transformerer systemet automatisk svarene på prøver til koncentrationer ved hjælp af en kalibreringskurve. Måldataene overføres elektronisk til IDM-softwaren, som integrerer funktioner til beregning af analyseresultater, beregning af statistikker og resultatrapportering.
I henhold til inkluderings- og udelukkelseskriterierne undersøgte den foreliggende undersøgelse serum fra 346 patienter. Undersøgelsesgruppen indbefattede 78 forsøgspersoner alene med allergisk rhinitis, 92 med astma alene og 88 sammenhængendeLider med astma og rhinitis. Kontrolgruppen omfattede 88 patienter med ikke-respiratoriske allergier. Disse patienter var i alderen 1-87 år og blev bekræftet at være fastboende fra alle dele af Greater Guangzhou, målområdet for undersøgelsen. Alle studiegrupper og kontrolgruppen var sammenlignelige i demografiske og sociale karakteristika, herunder køn, alder og familiehistorie. Af patienterne i undersøgelsesgruppen testede 22,5% positivt på Bermuda græs, 13,6% til Timothy græs og 7,0% til Humulus skandiner . I undersøgelsesgruppen var følsomheden for enhver græspollen meget højere end i kontrolgruppen ( tabel 1 ). Alle Bermuda græs sieg-negative patienter var også negative for Timothy græs og Humulus skandiner . Det er interessant at bemærke, at patienter med allergisk rhinitis og / eller astma viste en bemærkelsesværdig højere sensibiliseringsgrad for bermuda græs (n = 58, 22,5%) end dem med andre allergier (n = 4, 4,5%).
Humulus skandiner eller CCD under 30%. I modsætning hertil havde patienter med klasse 4-Bermuda græs sIgE-reaktivitet 67-100% chance for samtidig positivitet over for Cyn d 1, Timothy græsallergener, Humulus scandens eller CCD ( Figur 1 ). Bermuda græs SIgE reaktivitetsniveauer viste en signifikant korrelation med chancer for positivitet til andre græspollen IgE'er ( r s = 0.669, P <0.001).
Timothy græs sensibilisering blev yderligere vurderet af sIgE til Timothy græs komponenter. Blandt de 35 timothy græspositive patienter var den mest opdagede allergenkomponent Phl p 4 (100%, 35/35) efterfulgt af Phl p 1(17,1%, 6/35). Tre patienter hver (3/35, 8,6%) var positive for nogen af Phl p 5, 6, 7, 11 og 12 ( tabel 2 ). Serum Phl p 4 sIgE niveauer korrelerede stærkt med total Timothy græs allergen og CCD sIgE niveauer ( r s = 0,941 og 0,928, P <0,001, tabel 3 ). 41,4% (24/58) af Bermudas græspositive patienter og 68,6% (24/35) af Timothy græsfølsomme patienter var sIgE positive for CCD. Spearmans rangkorrelationsanalyse viste en signifikant association i sensibilisering mellem CCD og andre græsallergener ( Tabel 3 ).
Figur 1: Overfølsomhed blandt patienter, der er positive for Bermuda Grass SIgE.
Denne figur viser procentdelen af patienter med forskellige klasser af sIgE reaktivitet over for Bermuda græs (n = 58) og en sammenhængAnt sensibilisering til Timothy græs, Humulus scandens , CCD og andre græs allergen komponenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Frekvens af positive tests [% (n / patienter)] | |||
| Bermuda græs | Timothy græs | Humulus skandiner | |
| Patienter med AR og / eller AS | 22,5% (58/258) †† ‡ | 13,6% (35/258) † | 7,0% (18/258) |
| Patienter med AR | 21,8% (17/78) †† | 10,2% (8/78) | 7,7% (6/78) |
| Patienter med AS | 22,8% (21/92)†† | 14,1% (13/92) † | 5,4% (5/92) |
| Patienter med AR og AS | 22,7% (20/88) †† | 15,9% (14/88) | 8,0% (7/88) |
| Alder | |||
| <14 år eller yngre | 18,6% (8/43) | 14,0% (6/43) | 7,0% (3/43) |
| > 4 år | 23,3% (50/215) | 13,5% (29/215) | 7,0% (15/215) |
| Køn | |||
| Han | 25,7% (35/136) | 13,9% (19/136) | 7,4% (10/136) |
| Kvinde | 18,8% (23/122) | 13,1% (16/122) | 6,6% (8/122) |
| Patienter med anden allergi | 4,5% (4/88) ** | 1,1% (1/88) ** | 0 * |
Tabel 1: Patienter med sIgE-positive test for Bermuda Grass, Timothy Grass og Humulus scandens Baseret på sygdomsenhed og demografiske detaljer. En højere andel patienter med allergiske respiratoriske sygdomme var positive for Bermuda græs (χ 2 = 14,35, P <0,001), Timothy græs (χ 2 = 10,88, P <0,001) og Humulus skandiner (χ 2 = 5,14, P = 0,02 ) I forhold til de andre allergiske kontroller ( ** P <0,01, * P <0,05). Andelen af patienter med en positiv Bermuda græs test var bemærkelsesværdig højere end andelen for Timothy græs ( ‡; P <0,05) og Humulus-scanninger ( †† P <0,01). Andelen af patienter med en positiv Timothy græsprøve var højere end Humulus skandens ( † P <0,05). Andelen af positive tests til Bermuda græs, Timothy græs og Humulus scandens sIgE varierede ikke signifikant mellem de mindre og de voksne grupper (x 2 = 0,07, P = 0,79; x 2 = 0,06, P = 0,80; x 2 = 0,11, P = 0,74). Priserne på græspollenfølsomheder var ikke statistisk forskellige mellem mænd og kvinder (χ2 = 1,338, P = 0,25; x 2 = 0,063, P = 0,80; x 2 = 0,38, P = 0,54). Tilsvarende blev der ikke angivet signifikante forskelle i følsomhedsrate mellem rhinitis og astmapatienterne (x 2 = 0,030, P = 0,985; x 2 P = 0,558; X 2 = 0,528, P = 0,768; henholdsvis).
| Patienter (%) | Phl p 4 | Phl p 1 | Phl p 5 | Phl p 6 | Phl s. 11 | Phl p 7 | Phl s. 12 | |
| 28 (80,0%) | + | |||||||
| 4 (11,4%) | + | + | ||||||
| 1 (2,9%) | + | + | + | + | + | + | ||
| 2 (5,7%) | + | + | + + | + | + | + | ||
| Total | 35 (100%) | 6 (17,1%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | |
| SIgE a (kU / L) | 0,52, 0,06-2,02 | 0,02, 0,01-0,10 | 0,04, 0,03-0,24 | 0,12, 0,03-0,34 | 0,05, 0,02-0,27 | 0,03, 0,02-0,36 | 0,10, 0,04-0,28 |
Tabel 2: Sensibilisering af Timothy Grass i henhold til den positive positivitet og niveauer af Timothy Grass Components (N = 35). +, Positive test; A , sIgE niveauer (kU / L) vises som median og IQR. Af de 35 Timothy-græs-SIgE-positive patienter var 80,0% alene Phl p4-positive, mens 11,4% var positive for Phl p4 eller Phl p1.
| allergen | Bermuda | Timothy | Humulus skandiner | CCD |
| Bermuda | - | 0,709 ** | 0,682 ** | 0.565 ** |
| Cyn d 1 | 0,583 ** | 0,787 ** | 0,751 ** | 0,865 ** |
| Timothy | 0,709 ** | - | 0,921 ** | 0,856 ** |
| Phl p 4 | 0,645 ** | 0,941 ** | 0,886 * | 0,928 ** |
| Phl p 1 | 0,616 ** | 0,681 ** | 0,712 ** | 0,507 ** |
| Phl p 5 | 0,46 | 0,273 | 0.590 * | 0,624 * |
| Phl p 6 | 0.445 | 0,306 | 0,583 * | 0,569 |
| Phl p 7 | 0,681 * | 0,481 | 0,632 * | 0,531 |
| Phl s. 11 | 0,589 * | 0,372 | 0.620 * | 0,568 |
| Phl s. 12 | 0,671 * | 0,411 | 0.565 | 0,446 |
| Humulus skandiner | 0,682 ** | 0,921 ** | - | 0,853 ** |
Tabel 3: Korrelationskoefficienter † for positivitet mellem CCD og græspollen allergener. † præsenteres som korrelationskoefficienten r s ; Spearmans korrelationsanalyser blev udført for dette ikke-parametriske datasæt. * P <0,05, ** P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fuldautomatiserede immunanalysatorer kan tilbyde tilfredsstillende sammenhæng mellem regioner, laboratorier og institutioner og over tid. En sådan automatisk procedure har vist sig at støtte væsentlig bænkeforskning og kliniske undersøgelser, muliggøre standardiseret påvisning af mange allergener og / eller allergenkomponenter og identificere sandsynlig allergen-krydsreaktivitet, som ikke ville være blevet afsløret let før CRD'ernes tilværelse. Desuden kan hele testproceduren afsluttes med streng kvalitetskontrol, der muliggør høj gennemstrømningsmetoder, som krævet i en undersøgelse af en stor geografisk region. Selv om testproceduren hovedsageligt drives af en computerkonsol, skal der oplyses flere kritiske problemer. Det er obligatorisk, at instrumentet anvendes i streng overensstemmelse med brugervejledningen; Enhver aberration kan resultere i unødvendige testfejl, mekanisk skade eller personskade fra laserstråle eller høj elektrisk spænding. Altid enSikker på at en korrekt og korrekt kalibreringskurve er blevet opbevaret i systemet, da dette er forbundet med testens nøjagtighed. Ellers må sig koncentrationen af en bestemt kalibrator måles forud for serumprøveprøverne. Derefter kan systemet automatisk beregne og opbevare kalibreringskurven til senere brug. Som med andre laboratorieteknikker er det også vigtigt at observere sikkerheden ved human serummanipulation for at beskytte teknikere mod infektioner og for at undgå forurening af miljøet.
For første gang viste denne undersøgelse for første gang en betydelig forekomst af Bermuda græs sIgE positivitet (22,5%) hos patienter med allergisk rhinitis og / eller astma i Guangzhou, det sydlige Kina, ved hjælp af en fuldt automatiseret immunanalysator som en CRD-tilgang. Da Timothy græs og Humulus skandaler ikke er almindelige, selv ikke-eksisterende, i Guangzhou, positiviteten af Timothy græs (13,6%) og Humulus scandens sIgE (7,0%) mAy skyldes krydsreaktivitet blandt græs pollen.
Ved at analysere græspollenallergener blev det tydeligt vist, at alle Timothy græs IgE-positive patienter også var positive for det specifikke Timothy græs antigen Phl p 4. Meget få (17,1%) testede positivt til Phl p 1, hvilket var overraskende forskelligt fra data I Europa, hvor positiviteten til Phl p 1 er meget højere end Phl p 4 18 , 20 , 21 . Da Phl p 1 er hovedkomponenten af Timothy græs, kan den overvejende grad af Phl p 4 positivitet over Phl p 1 i denne undersøgelsespopulation også foreslå sandsynlig krydsreaktivitet ud over "ægte" sensibilisering, fordi Phl p 4 deler en strukturel lighed Med CCD og en række andre allergener, herunder træer, grøntsager og tropiske frugter 19 , 22 , 23, 24 . Den kliniske relevans af denne observation kunne være, at størstedelen af Timothys græspositive patienter i denne undersøgelse aldrig skulle have fået råd til at modtage Timothy græsimmunterapi, som i øjeblikket bruger Phl p 1 25 .
Flere begrænsninger af undersøgelsesmetoder og -teknikker skal nævnes. For det første, da op til 3 forskellige kalibratorstrimler kan placeres i et pipette / reagensbakke i immunanalysator analysatoren, kan der maksimalt udføres tre testpartier samtidigt. Når der kræves en stor arbejdsbyrde, som i en større regional undersøgelse, tager det stadig en betydelig del tid at behandle. For det andet er krydsreaktiviteten med humant IgA, IgD, IgM og IgG ikke-eksisterende ved fysiologiske koncentrationer ved anvendelse af analysatoren fra dette studie, så der er behov for andre undersøgelsesmetoder, når der er tale om krydsreaktivitet med disse immunoglobuliner. For det tredje, på trods af den sofistikerede devicE, skal resultaterne fra den fuldt automatiserede immunanalysator ikke erstatte andre laboratorieundersøgelser, kliniske evalueringer og lægeekspertise, når der foretages en endelig diagnose. For det fjerde på grund af den sene introduktion af allergen-CRD i Kina er adskillige kommercielle produkter af subtropiske græspollenkomponenter utilgængelige eller ikke blevet godkendt til forskning indtil for nylig. Brug af denne teknik som en CRD-tilgang til allergener er derfor baseret på den kommercielle tilgængelighed af produktforsyninger fra producenten til specifik brug i en region. I tropiske og subtropiske regioner med en allestedsnærværende kompleksitet af plante pollener, kan en CRD undersøgelse være utilstrækkelig og vanskelig på grund af mangel på tilsvarende allergenprodukter til testen. Et sådant dilemma kunne i høj grad kompromittere effektiviteten af denne teknik.
Ikke desto mindre er det til vores nyeste viden en banebrydende undersøgelse, der anvender CRD-tilgangen tO undersøge sensibilisering til græs pollen allergener i det sydlige Kina. Yderligere undersøgelser kan fortsætte i denne vene og validere disse fund.
Hidtil har teknikker, der anvender den fuldt automatiske immunoassayanalysator, været accepteret som guldstandarden for in vitro allergen sIgE-test 26 , 27 . I betragtning af de meget begrænsede data om allergenfølsomhed inden for det store område i Kina, kan store stikprøveundersøgelser, der anvender det fuldt automatiserede immunoassay som en CRD-tilgang, fylde hullerne og føje til de foreliggende beviser på dette område. Det er vigtigt at bemærke, at sådanne undersøgelser, som regel multisenter og landsdækkende samarbejder, kan nødvendiggøre netværksdannelsen af immunoassays baseret på en standardprotokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Yueming Su for hans hjælp til at forberede figuren. Denne undersøgelse blev finansieret af Guangdong Fonden for Videnskab og Teknologi (Projekt nr .: 2014A020212352), Guangzhou Education Bureau (1201630044; 1201630393) og National Natural Science Foundation of China (NSFC 81572063; NSFC 81601394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImmunoCAP 1000 Instrument | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3800-01 | |
| Phadia Information Data Manager Software Package | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-11 | |
| Software Package, ImmunoCAP 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-12 | |
| g2 (Bermuda grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4131-01 | |
| g6 (Timothy grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4100-01 | |
| w22 (Japanese Hop) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4452-01 | |
| g216 (nCyn d 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4972-01 | |
| g205 (rPhl p 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5234-01 | |
| g208 (nPhl p 4) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5288-01 | |
| g215 (rPhl p 5b) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5338-01 | |
| g209 (rPhl p 6) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5289-01 | |
| g210 (rPhl p 7) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5290-01 | |
| g211 (rPhl p 11) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5291-01 | |
| g212 (rPhl p 12) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5292-01 | |
| o214 Cross-reacting carbohydrate determinants (CCDs) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5339-01 | |
| Specific IgE Conjugate 400 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9310-08 | |
| Specific IgE Calibrator Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9459-08 | |
| Specific IgE Curve Control Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9312-08 | |
| Specific IgE Anti-IgE ImmunoCAP | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4417-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Negative Control | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9445-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control L | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9528-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control M | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9529-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control H | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9530-01 | |
| Development Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9439-08 | |
| Stop Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 34-2271-58 | |
| Washing Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9202-08 | |
| FluoroC | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9264-01 | |
| Maintenance Solution Kit | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9476-01 |
References
- Scadding, G. K. BSACI guidelines for the management of allergic and non-allergic rhinitis. Clin Exp Allergy. 38 (1), 19-42 (2007).
- Pollart, S. M., Reid, M. J., Fling, J. A., Chapman, M. D., Platts-Mills, T. A. Epidemiology of emergency room asthma in northern California: association with IgE antibody to rye grass pollen. J Allergy Clin Immunol. 82 (2), 224-230 (1988).
- Wang, Q. Lower airway inflammation and hyperresponsiveness in non-asthmatic patients with non-allergic rhinitis. J Thorac Dis. 7 (10), 1756-1764 (2015).
- Ma, Y. The link between mold sensitivity and asthma severity in a cohort of northern Chinese patients. J Thorac Dis. 7 (4), 585-590 (2015).
- Luo, W. Major grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Mol Immunol. 78, 105-112 (2016).
- Zhang, Y., Zhang, L. Prevalence of allergic rhinitis in china. Allergy Asthma Immunol Res. 6 (2), 105-113 (2014).
- Zeng, G., Zheng, P., Luo, W., Huang, H., Wei, N., Sun, B. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Mol Immunol. 74, 1-9 (2016).
- Kleine-Tebbe, J., Matricardi, P. M., Hamilton, R. G. Allergy work-up including component-resolved diagnosis: how to make allergen-specific immunotherapy more specific. Immunol Allergy Clin North Am. 36 (1), 191-203 (2016).
- Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, southern China. PLoS One. 9 (5), e94776 (2014).
- Zeng, G. Component-resolved diagnostic study of Dermatophagoides pteronyssinus major allergen molecules in a southern Chinese cohort. J Investig Allergol Clin Immunol. 25 (5), 343-351 (2015).
- Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma (ARIA). Management of Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma Pocket Guide. , Available from: http://www.whiar.org/docs/ARIA_PG_08_View_WM.pdf (2015).
- Global Initiative for Asthma (GINA). Pocket Guide for Asthma Management and Prevention. , Available from: http://ginasthma.org/wp-content/uploads/2016/01/GINA_Pocket_2015.pdf (2015).
- Liu, J., Guo, A., Guo, H. Morphological variation and types of Cynodon dactylon. Acta Prataculture Sinica. 12 (6), 99-104 (2003).
- Zhang, H., Xi, J. Study on the germplasm resource and ecological characteristics of wild carpet grass (Axonopus compressus) in Guangdong. Grassland and Turf. 13 (1), 25-28 (2005).
- Kao, S. H., Su, S. N., Huang, S. W. Sub-proteome analysis of novel IgE-binding proteins from Bermuda grass pollen. Proteomics. 5 (14), 3805-3813 (2005).
- Ouyang, Y. H., Zhang, D. S., Fan, E. Z., Li, Y., Zhang, L. Correlation between symptoms of pollen allergic rhinitis and pollen grain spreading in summer and autumn. Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Waike Zazhi. 47 (8), 623-627 (2012).
- Westritschnig, K. Analysis of the sensitization profile towards allergens in central Africa. Clin Exp Allergy. 33 (1), 22-27 (2003).
- Rossi, R. E., Monasterolo, G., Monasterolo, S. Measurement of IgE antibodies against purified grass-pollen allergens (Phl p 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, and 12) in sera of patients allergic to grass pollen. Allergy. 52 (12), 1180-1185 (2001).
- Zafred, D., Nandy, A., Pump, L., Kahlert, H., Keller, W. Crystal structure and immunologic characterization of the major grass pollen allergen Phl p 4. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 696-703 (2013).
- Chabre, H. Molecular variability of group 1 and 5grass pollen allergens between Pooideae species: implications for immunotherapy. Clin Exp Allergy. 40 (3), 505-519 (2010).
- Mari, A. Skin test with a timothy grass (Phleum pratense) pollen extract vs.IgE to a timothy extract vs. IgE to rPhl p 1 rPhl p 2, nPhl p 4, rPhl p 5, rPhl p 6, rPhl p 7, rPhl p 11, and rPhl p 12: epidemiological and diagnostic data. Clin Exp Allergy. 33 (1), 43-51 (2003).
- Grote, M., Stumvoll, S., Reichelt, R., Lidholm, J., Rudolf, V. Identification of an allergen related to Phl p 4, a major timothy grass pollen allergen, in pollens, vegetables, and fruits by immunogold electron microscopy. Biol Chem. 383 (9), 1441-1445 (2002).
- Andersson, K., Lidholm, J. Characteristics and immunobiology of grass pollen allergens. Int Arch Allergy Immunol. 130 (2), 87-107 (2003).
- Tripodi, S. Molecular profiles of IgE to Phleum pratense in children with grass pollen allergy: implications for specific immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 129 (3), 834-839 (2012).
- Stumvoll, S., et al. Purification, structural and immunological characterization of a timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen Phl p 4, with cross-reactive potential. Biol Chem. 383 (9), 1383-1396 (2002).
- Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Ann Allergy Asthma Immunol. 99 (1), 34-41 (2007).
- Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (IgE) tests performed by different assay systems. J Allergy Clin Immunol. 121 (5), 1219-1224 (2008).
