Summary
Bu çalışma, Güney Çin'den allerjik rinit ve / veya astımlı bir hasta grubunda ot polen allerjenlerine duyarlılığı araştırmak için bileşen çözümü yaklaşımını kullanan bir protokolü açıklamaktadır.
Abstract
Ot polenine duyarlılık alerjik hava yolu hastalıkları için küresel bir risk oluşturmaktadır. Önleme, polen allerjenlerinin yerel incelemesine dayanmasına rağmen, bu konudaki veriler güney Çin'de sınırlıdır. Mevcut veriler, kendi kendine anket formları, cilt prick testleri ve ham ekstraktlar kullanılarak yapılan toplam veya spesifik IgE testleri ile elde edildi. Birçok nedenle bu yöntemler güvenilmez. Allerjik rinit ve / veya astımlı Greater Guangzhou (Güney Çin'in en büyük şehri ve eteklerinde) hastalardan oluşan bir gruptaki Bermuda ot, Timothy otu ve Humulus skandens allerjenlerine karşı Serum sIgE reaktivitesi, tam otomatik immünoassay analizör kullanılarak bir bileşen olarak incelendi -arlı teşhis (CRD) aracı.
İlk defa, alerjik rinit ve / veya astımı olan Çinli güney ülkelerde Bermuda çim SEg Pozitifliği yaygınlığı oldukça yüksek gösterildi. Bu hastalarda hassas bir prevalansİkincisi bölgede yaygın olmadığından, çapraz reaktiviteden kaynaklanabilecek Timothy grass and Humulus Scandens'e de dikkat çekildi. Bu aynı zamanda alerjen bileşenlerin tespiti ile de desteklendi.
Tam otomatik immüno-analizör, bölgeler, laboratuvarlar ve kurumlar arasında ve zamanla tatmin edici bir tutarlılık sağlayabilir. Cihazın otomatikliği, CRD'nin ortaya çıkmasından önce kolaylıkla ortaya çıkarılamayacak standart bir tespiti mümkün kılabilir.
Bu, Güney Çin'de çim polen allerjenlerine duyarlılığı araştırmak için CRD yaklaşımını kullanan bir çalışmadır. Literatürdeki mevcut kanıtlara ek olarak. Bu bulguları doğrulamak için gelecek çalışmalara ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, CRD'nin yararlı bir araç olmasına rağmen, tam otomatik immüno-analiz analizörü ile yapılan bulgular, diğer laboratuvar araştırmaları, klinik değerlendirmeler ve doktor uzmanlığının yerini almamalıdır.
Introduction
Çim poleni, immunglobulin E (IgE) ile ilişkili alerjilerin yaklaşık% 50'sini oluşturur ve havadaki yapısı nedeniyle, küresel bir alerjik hava yolu hastalıkları riski, özellikle astım ve alerjik rinit 1 , 2 , 3 , 4 etkiler. Bir bölgedeki ot polen alerjilerine karşı önleme, polen allerjenlerinin yerel dağılımı hakkında bilgilere dayanır. Ne yazık ki duyarlılaştırıcı allerjenlerin spektrumu yerden yere farklılık göstermektedir - genellikle bölgesel özgüllük olarak bilinen gözlem.
Geniş bir Doğu-Asya bölgesi olan Çin'de, otlak poleni hassasiyetinin bölgesel spesifikliği, günümüzde bu ülkenin güney kesiminde son on yıl boyunca mevcut olan sınırlı verilerle karmaşıktır5. Verilerdeki bu kadar azlık, çimen poleni sensinin genel olarak gösterilmesinde bir zorluğa neden olmuşturBu büyük ülkede tazeleme 6 . Ayrıca, Çinli güney kökenli insanlar hakkındaki çok sınırlı veriler büyük oranda kendi kendini raporlama anketlerinden, cilt prick testlerinden (laboratuvar serum testlerinden ziyade), toplam IgE ölçümlerinden (alerjen spesifik IgE'den (sIgE'den ziyade)) ve alerjenlere sIgE saptamadan ( Alerjen bileşen moleküllerinden ziyade).
Alerjik belirtilerin kendi kendine bildirilmesi, spesifik alerjenler söz konusu olduğunda güvenilmez olabilir. Deri prick testleri, yaygın olarak erişilebilir olmakla birlikte, sonuçta yorumlanmayı karıştıran diğer hassaslaştırıcı bileşenleri de içerebilen standartlaştırılmamış ham allerjen ekstraktlarının kullanılmasını içerir. Cilt prick testinin güvenilirliği, alerjik uzmanların veya uzman hemşirelerin becerikli manipülasyonuna, histamin kullanımına ve hasta uyumluluğuna (bazen küçük çocuklar için çok zor) bağlıdır. Total IgE, bir alerjinin taranması için yararlıdır ancakBir hastada alerjenleri rahatsız ediyorum. Dahası, hemen hemen tüm alerjenler bir dizi alerjen bileşeni molekülü içerir. Ana bileşenlere ( yani ev tozu akarlarından Der p 1 ve Der p 2'ye duyarlılaştırma), "gerçek" bir alerji (diğer allerjenlerle çapraz reaksiyonlardan ötürü yanlış pozitiflikten ziyade spesifik bir alerjene alerji) önerebilir, ancak duyarlılaşma Bazılarına ( örn. , Çapraz reaktif Der p 10, bir tropomiyozin) 7 olamaz.
Bileşen çözülmüş teşhis (CRD) kullanılmaya başlanmadan önce hayal kırıklığı yaratan bu gerileme, Çin'deki alerjen çalışmalarını engelledi. CRD, bir alerjenin bileşenlerini, rekombinant veya saflaştırılmış alerjen molekülleri kullanarak tam olarak algılar ve böylece ölçümü kolaylıkla nicelleştirilebilir ve karakterize edilebilir hale getirir 8 . Geçtiğimiz on yıllarda, alerji çalışmaları sıklıkla, birçok alâkasız bileşen içeren kaçınılmaz olarak allerjenlerden oluşan ham özleri kullandı. Bu ortakların birçoğuDönüşçüler etkisizdir, ancak zaman zaman, bazıları karıştırıcı olumlu reaksiyonlara neden olabilir. CRD'de rekombinant veya saflaştırılmış alerjen moleküllerinin kullanılması bunun önüne geçebilir ve bu nedenle daha iyi test doğruluğu sağlayabilir. Mikrodizilerde işlendiğinde, CRD yaklaşımı bireysel kişilerde yüzlerce allerjen molekülüne duyarlılığı hızla tarar veya tanımlar. Güney Çin'de çimlerin polen duyarlılığı üzerine iyi tasarlanmış bir CRD çalışması şimdilik eksiktir. İdeal olarak, böyle bir araştırma, Çin'de yaygın olarak bildirilen çimen polenlerini açıklayan önemli bir coğrafi kapsama alanındaki yerel bir nüfusu içermeli ve yukarıda belirtilen teknik hususlara dikkat etmelidir. Pratik düzeyde klinik önemi kazanmak ve serum örneklerinin alınmasını kolaylaştırmak için, çim polenlerine karşı inhalant allerjenlere karşı duyarlılığın erken araştırılması, genel popülasyondan ziyade allerjik solunum bozukluğu olan hastalar üzerinde yoğunlaşabilir.
Bu çalışma,CRD yaklaşımını kullanarak allerjik rinit ve / veya astımı olan Büyük Guangzhou'dan (güney Çin'in en büyük şehri ve eteklerinde) hastalardaki Bermuda çimenleri, Timothy çimi ve Humulus tarikatlarına karşı serum sIgE reaktivitesini test etmek için kullanıldı. Güney Çin'deki bu subtropikal ve ılıman çimen polenlerine duyarlılık üzerine yapılan bu bulgular şu anda literatürdeki bilgiler için önemli kanıtlar sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan serum numunesi kullanımı da dahil çalışma protokolü Guangzhou Tıp Üniversitesi'nin İlk Bağlı Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı. Tüm katılımcılar ya bağımsız ya da ebeveynleri aracılığıyla (çocuklarda) yazılı bilgilendirilmiş onay almayı teklif ettiler. Protokol çevrimiçi kaydedildi (Çin Klinik Araştırması Kayıt Defteri, Kayıt No: ChiCTR-DCC-13004003, http://www.chictr.org/cn/ adresine bakın).
1. Araştırmanın Nüfusunun Belirlenmesi
NOT: AIR, güney Çin'de alerjen testleri için hastaların en iyi belgelenmiş büyük veri tabanı olduğundan, Solunum Hastalığının Devlet Anahtar Laboratuvarının (AIR-SKLRD) Alerji Bilgi Deposu hastanın işe alımının birincil kaynağıdır 9,10. AIR, yaklaşık on yıldır serum örneklerini saklıyor. Kısaca, bu muhafaza edilmiş numuneler daha önce 5 mL o santrifüj3.000 xg'de 10 dakika boyunca venöz kan alınmış ve süpernatanı geri kazanmıştır. Serum örnekleri, uzun süreli depolamada -80 ° C buzdolaplarına yerleştirildi. Hasta dahil etme kriterlerini karşılayan örnekler, bu çalışmada tüm testler için kullanılmaya hazırdı.
- AIR veritabanından, önceden tasarlanmış çalışma süresi olan Ocak 2013 ile Haziran 2015 tarihleri arasında çimen alerjen testi için serum testleri yapılan alerjik rinit ve / veya astımı olan hastalar hakkında veri alın.
- Allerjik Rinit ve Astımdaki Etkisi (ARIA) 11 ve Astım için Küresel Girişim (GINA) 12 kılavuzlarına göre hafif ila orta şiddette alerjik rinit ve / veya astımı olan hastaları seçin. Onları "çalışma grubu" olarak atayın.
- Eksik olan tıbbi kayıtları olan, takipleri kaybedilen, serum örneklerinin bilimsel amaçla kullanımı konusunda bilgilendirilmiş onayı reddeden, tanımlanmış olanlarlaŞu anda immünoterapi veya bağışıklık düzenleyici ajanlar üzerinde bulunan veya paraziter enfeksiyonlara sahip bulunan kişiler.
- Aynı dışlama kriterlerine göre , respiratuar olmayan alerjilere (egzama, alerjik dermatit ve gıda alerjisi) sahip çağdaş bir hasta grubunu seçin ve onları "kontrol grubu" olarak atayın.
- Laboratuvar bulguları üzerindeki karıştırıcı etkileri en aza indirgemek için herhangi bir reçete veya tedavi verilmeden önce serum numunelerinin toplandığından emin olun. Bu gereksinimi karşılamayan herhangi bir serum örneğini dışarıda bırakın.
- Tüm kişilerin Büyükşehir'in her yerinden kalıcı sakinler olduğundan emin olun ( yani, doğmuş ya da orada 10 yıldan fazla yaşamış olmak).
2. Çalışma Akışı ve İlgi Alanlarının Ölçümü
- Uygun biyolojik bankalardan uygun hastaların serum örneklerini alın. Bir alerjen / alerjen bileşenini test etmek için, 140 uL serum (100 uL içerenÖlü alanı kaldırın).
NOT: Bu çalışmada her hasta için gereken maksimum toplam serum hacmi şöyledir: 3 spesifik allerjenler ve 8 alerjen bileşeni, sIgE = 140 μL * 11 = 1,540 μL. - Bu enstrümanı kullanırken öncelikle serum örneklerini, Bermuda otu, Timothy otu ve Humulus scandensinin alerjenlerine karşı sIgE'ler için test edin. Bölüm 3'teki talimatları uygulayın.
NOT: Timothy çim 17 , 18 , 19 , Tropikal'den ılımana kadar değişen ortamlarda yaşayan tipik bir bitki türü iken , Bermuda çim 13 , 14 , 15 ve Humulus tarikatları 16 yaygın olarak Çin'de bildirilmiştir, çünkü bu polenler ölçüler için seçilmiştir. Ve en çok dünya üzerinde çalışılmıştır. - İkincil olarak, adım 2.3'te tanımlanan serum örneklerini,Bermuda'nın alerjen bileşenleri için sIgE'lerin mevcudiyeti için bütün allerjenlere karşı sİGER ler, Timothy [Phlp1 (g205), Phlp4 (g208), Phlp5 (g215), Phlp6 (g209) ), Phl p 7 (g 210), Phl p 11 (g 211) ve Phl p 12 (g1212)] ve çapraz reaktif karbonhidrat belirleyicileri [CCD (o214)]. Bölüm 3'teki talimatları uygulayın.
3. İmmünoassay Analiz Sistemini kullanarak tam otomatik test prosedürü
NOT: Tamamen otomatik olan ve başka yerlerde 7 , 8 , 9 , 10'da tanımlanan allerjen testi prosedürünün tüm prosedürü üreticinin protokolünü izler.
- Tam otomatik immünoassay analizörünü ( örn. ImmunoCAP1000) başlatın ve çalışma boyunca immünoassayeyi gerçekleştirmek için kullanın. Dahili Bilgi Veri Yönetimi (IDM) bilgisayarını açın.
NOT: İmmünoassay analYzer düzenli olarak bekleme modundadır. - "Birincil Gç" açıkken "Sistem Gücü" nü açın ve dahili yazılım başlatılana kadar 3 dakika bekleyin. "Yıkama Çözeltisini Yıkama" ve "Yıkama Çözeltisini Yükle" yi tıklayın.
- Her alerjen / alerjen bileşeni testi için bir tüp içine 140 μL serum ekleyin. Her serum için 140 uL içeren her şişeyi, her hastaya özgü bir tanımlama numarası ile etiketleyin.
- IDM arayüzünden menüye tıklayarak aşağıdaki adımları uygulayın.
- "SIgE" nin seçilen test yöntemi olduğundan emin olmak için IDM'deki "İstek Listesi" penceresine bakın.
- Numune tüplerini örnek raflarına, kalite kontrol tüplerini kalite kontrol raflarına barkotlarla yükleyin.
NOT: Her bir hasta için başlangıçta sIgE için 3 spesifik allerjen ve 8 alerjen bileşeni veya 346 * 11 (3.806) numune tüpü için test planlanmıştır. Her numune tüpü için, 3 kalite kontrol tüpüDüşük, orta ve yüksek düzeyde sIgE kontrolü içeren (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız) eşleştirildi. Sonunda, birincil testte (adım 2.3) pozitif çıkan sadece 58 hasta ikincil testte (basamak 2.3) ayrıntılı olarak incelendi. Tüplerin yüklenmesi bilgisayar konsolunda otomatik olarak ayarlanabilir. - "Test İşlemi" ekranında "Reaktifleri Yükle" yi seçin. "Yükleme Listesi" ne göre numune ve kalite kontrol rafları, geliştirme çözeltisi, konjugat, kalibratörler, taşıyıcı, pipet uçları, durdurma çözeltisi ve yıkama solüsyonunun yüklenmesini tamamlayın ( ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın).
- "Yükle ve Başlat" bölümünde "Tamam" a basın.
NOT: Ölçüm sonunda, sonuçlar IDM'de görünür. - IDM arabiriminden dışa aktarılacak verileri seçin. "Menü", "Onayla" ve "Farklı Kaydet" i tıklayın ve sIgE ölçüm sonuçlarını bir elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarın. Elektronik tablo dosyasını istatistiksel bir yazılıma ( örn., SPSS) 10 aktarın. SPSS menüsünden Spearman katsayıları için belirli bir modül kullanarak, bu çimen polenleri (tüm alerjen için pozitif SIÇ) ve polen bileşenleri (alerjen moleküllerine karşı pozitif SIAG) arasındaki sensitizasyon arasındaki korelasyonları analiz edin.
4. sIgE Reaktivitesinin Tanımı
NOT: Seyreltilmemiş serum örneği için spesifik IgE ölçüm aralığı 0.35 ila 100 kU / L arasındadır.
- Numuneleri> 100 kU / L 1: 5 sIgE değerleri ile seyreltin ve tekrar test edin. Değeri 100 kU / L'den yüksek tuttuğunda, 1000 kU / L'ye kadar bir son nokta seviyesine ulaşana kadar daha fazla seyreltme yapın.
- 0.35 kU / L eşik değerine dayanarak, 0,35 kU / L'yi aşan bir sIgE seviyesi 5 , 7 , 10 pozitif olacak şekilde düşünülmelidir. Tepki oranını hesaplaSınıf 1 (≥0.35 ve <0.70 kU / L), sınıf 2 (≥0.70 ve <3.50 kU / L), sınıf 3 (≥3.50 ve <17.50 kU / L), sınıf 4 (≥ 17.50 ve 50.00 kU / L), sınıf 5 (≥50.00 ve <100.00 kU / L) ve sınıf 6 (≥100.00 kU / L).
5. İstatistiksel Analiz
- Verileri istatistiksel yazılım ( örneğin, SPSS) ile analiz edin 10 . Kantitatif verileri, ortalama ve standart sapma, meditasyon ve çeyrekler arası aralıklar (IQR) olarak nitel verileri ve olumlu sonuçların oranı olarak kategorik verileri rapor edin.
- Oranlar arasındaki grup karşılaştırması, niceliksel veriler için eşleştirilmemiş t-testi ve nitel veri için bir sıralama-toplam testi için ki-kare testi kullanın.
- "R" olarak ifade edilen korelasyon katsayıları ve parametrik olmayan değerler için Spearman'ın testi ile parametrik veriler arasındaki korelasyon analizleri için Pearson testini kullanın;Korelasyon katsayılarını " r s " olarak ifade eder. P- değerleri <0.05 olduğunda, istatistiksel önemi düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada kullanılan tam otomatik immünoassay analiz cihazı, hastadan serum örneklerinde ilgi molekülleri (sIgE) ile reaksiyona giren kovalent bağlama alerjenleri veya alerjen bileşenleri ile kaplanmış bir katı faz yapısına sahiptir. Otomatik bir program ile, analizör, 150 uL durulama çözeltisi ile tüm spesifik olmayan IgE'leri yıkar ve bunu 5 kez tekrarlar. Ardından, bir kompleks oluşturmak için enzimle işaretlenmiş anti-IgE antikorları (50 uL) ekler. Enzim etiketli anti-IgE antikoru (konjugat) spesifik bir IgE'ye bağlanan sekonder bir antikordur. Bağlanmamış anti-IgE antikorları 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkanarak yok edilir (3 kez tekrarlanır). Bağlanan kompleks, gelişmekte olan bir madde (50 uL) ile 9 dakika 37 ° C'de muamele edilir. Gelişmekte olan ajan, bağlı tüm anti-IgE antikorlarını kesen bir enzim sindirici maddedir. İkincisi alkalin koşullar altında floresan yayar. Reaksiyon,Alkalin durdurma çözeltisinin ilavesi. Bundan sonra, enstrüman eluatı sıkmak ve sonuçtaki eluatın flüoresanını 470 nm'lik bir dalga boyunda ölçmek için katı faz yapısını sıkıştırır. Floresans, elüattaki ilgili analit moleküllerinin mutlak seviyesine doğrusal olarak korelasyonludur. Daha yüksek bir floresans değeri, serum örneğinde daha fazla serum anlamına gelir. Test sonuçlarını yorumlamak için sistem, bir kalibrasyon eğrisi kullanarak numunelerin yanıtlarını konsantrasyonlara otomatik olarak dönüştürür. Ölçüm verileri elektronik olarak analitik sonuçların hesaplanması, istatistiklerin hesaplanması ve sonuç raporlaması için fonksiyonları entegre eden IDM yazılımına aktarılır.
Dahil etme ve dışlama kriterlerini takiben, bu çalışma 346 hastadan serum incelendi. Çalışma grubunda tek başına allerjik riniti olan 78 hasta, tek başına 92 astımlı ve 88 eşlik eden 78 hastaAstım ve rinit ile. Kontrol grubuna, solunumla ilgili olmayan alerjisi olan 88 hasta dahil edildi. Bu hastalar, 1-87 yaş aralığındaydı ve hedef bölge olan Greater Guangzhou'nın her yerinden daimi ikamet ettikleri doğrulandı. Tüm çalışma grupları ve kontrol grubu, cinsiyet, yaş ve aile öyküsü gibi demografik ve sosyal özelliklerle karşılaştırılabilir düzeydeydi. Çalışma grubundaki hastaların % 22.5'i Bermuda çim,% 13.6'sı Timothy çimen,% 7.0'si Humulus tarikatlarına test edildi. Çalışma grubunda, herhangi bir çimen polenine duyarlılaşma oranı kontrol grubuna göre çok daha yüksekti ( Tablo 1 ). Bermuda çim sIgE negatif hastaların tümü Timothy çim ve Humulus skandallarına da negatifti . Allerjik rinit ve / veya astımı olan hastaların diğer alerjilere (n = 4,% 4.5) göre Bermuda çimlerine (n = 58,% 22.5) duyarlılaştırma oranını belirgin şekilde yüksek olduğunu belirtmek ilgi çekicidir.
Humulus skandanları veya CCD için pozitif testlerin olasılığı% 30'un altında idi. Buna karşılık, sınıf-4 Bermuda çimen sIgE reaktivitesi olan hastalar, Cyn d 1, Timothy çimen allerjenleri, Humulus skandanları veya CCD'ye eş zamanlı pozitiflik şansı% 67-100'tü ( Şekil 1 ). Bermuda çim sIgE reaktivitesi seviyeleri, diğer çim poleni IgE'lerine pozitif olma ihtimali ile anlamlı bir korelasyon gösterdi ( r s = 0.669, P <0.001).
Timothy çim duyarlılığı, sIgE'den Timothy çim bileşenlerine kadar daha da fazla değerlendirildi. Otuz üç Timothy çıplak hastanın arasında en sık algılanan alerjen bileşeni Phl p 4 (% 100, 35/35), bunu Phl p 1(% 17.1, 6/35). Her üç hasta (3/35,% 8.6) Phl p 5, 6, 7, 11 ve 12'den herhangi biri için pozitifti ( Tablo 2 ). Serum Phl p 4 sIgE düzeyleri, toplam Timothy çim allerjeni ve CCD sIgE düzeyleri ile kuvvetli korelasyon gösterdi (sırasıyla r s = 0.941 ve 0.928, P <0.001; Tablo 3 ). Bermuda çim pozitif hastaların% 41.4 (24/58) ve Timothy çimen duyarlı hastaların% 68.6'sı (24/35), CCD'ye karşı sIgE pozitifti. Spearman'ın rütbe korelasyon analizi, CCD ve diğer çim alerjenlerinin sensitizasyonu arasında anlamlı bir ilişki olduğunu gösterdi ( Tablo 3 ).
Şekil 1: Bermuda Çim Üzerine Olumlu Hastalarda Eş-sensitizasyon.
Bu rakam, Bermuda çimine farklı sınıflarda sIgE reaktivitesi (n = 58) olan hastaların yüzdesini ve bir eşlik edenTimothy çim, Humulus scandens , CCD ve diğer çim alerjen bileşenlerine karınca hassaslaşması. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Pozitif test oranı [% (n / hasta)] | |||
| Bermuda çimi | Timothy grass | Humulus tarikatları | |
| AR ve / veya AS'li hastalar | % 22.5 (58/258) †† | % 13.6 (35/258) † | % 7.0 (18/258) |
| AR hastaları | % 21.8 (17/78) †† | % 10.2 (8/78) | % 7.7 (6/78) |
| AS olan hastalar | % 22.8 (21/92)†† | % 14.1 (13/92) † | % 5,4 (5/92) |
| AR ve AS'li hastalar | % 22.7 (20/88) †† | % 15.9 (14/88) | % 8.0 (7/88) |
| Yaş | |||
| <14 yaş veya daha genç | % 18.6 (8/43) | % 14.0 (6/43) | % 7.0 (3/43) |
| > 4 yıl | % 23.3 (50/215) | % 13.5 (29/215) | % 7.0 (15/215) |
| Seks | |||
| Erkek | % 25.7 (35/136) | % 13.9 (19/136) | % 7.4 (10/136) |
| Kadın | % 18.8 (23/122) | % 13.1 (16/122) | % 6,6 (8/122) |
| Diğer allerjisi olan hastalar | % 4.5 (4/88) ** | % 1.1 (1/88) ** | 0 * |
Tablo 1: Bermuda Çimen, Timothy Çimeni ve Hümülüs skandalları için Hastalık Oluşumuna ve Demografik Detaylara Göre sIgE -pozitif Testleri Yapan Hastalar. Allerjik solunum yolu hastalığı olan hastaların daha yüksek bir oranı, Bermuda otı (χ 2 = 14.35, p <0.001), Timothy otu (χ 2 = 10.88, p <0.001) ve Humulus skandanları (χ 2 = 5.14, p = 0.02) ) Diğer alerji kontrollerine ( ** P <0.01, * P <0.05) karşı. Bermuda çim testinde pozitif olan hastaların oranı Timothy çim oranlarından belirgin derecede yüksektir ( ‡; P <0.05) ve Humus skandaları ( † P <0.01). Timothy çim testi pozitif olan hastaların oranı Humulus tarikatlarına göre daha yüksekti ( † P <0.05). Bermuda otu, Timothy çimesi ve Humulus skandalı sIgE'ye pozitif testlerin oranı, küçük ve yetişkin gruplar arasında (χ 2 = 0.07, P = 0.79; χ 2 = 0.06, P = 0.80; χ 2 = 0.11, P = 0.74; Çim polen duyarlılık oranları, erkekler ve dişiler arasında istatistiksel olarak farklı değildi (χ2 = 1.338, P = 0.25; χ2 = 0.063, P = 0.80; χ2 = 0.38, p = 0.54). Benzer şekilde, rinit ve astım hastaları arasında duyarlılık oranlarında anlamlı farklılıklar bulunmamıştır (χ 2 = 0.030, p = 0.985; χ 2 P = 0.558; Χ2 = 0.528, P = 0.768; sırasıyla).
| Hastalar (%) | Phl p 4 | Phl p 1 | Phl p 5 | Phl p 6 | Phl p 11 | Phl 7 | Phl p 12 | |
| 28 (% 80.0) | + | |||||||
| 4 (% 11.4) | + | + | ||||||
| 1 (% 2.9) | + | + | + | + | + | + | ||
| 2 (% 5.7) | + | + | + + | + | + | + | ||
| Genel Toplam | 35 (% 100) | 6 (% 17.1) | 3 (% 8.6) | 3 (% 8.6) | 3 (% 8.6) | 3 (% 8.6) | 3 (% 8.6) | |
| SİGE a (kU / L) | 0,52, 0,06-2,02 | 0.02, 0.01-0.10 | 0.04, 0.03-0.24 | 0.12, 0.03-0.34 | 0.05, 0.02-0.27 | 0.03, 0.02-0.36 | 0.10, 0.04-0.28 |
Tablo 2: Timothy Grass Bileşenleri'nin sIgE Pozitifliği ve Seviyelerine Göre Timothy Grass Sensitization (N = 35). +, Pozitif testler; A , sIgE düzeyleri (kU / L), medyan ve IQR olarak gösterilir. Timothy çim sEgE pozitif 35 hastanın% 80.0'i Phl p 4-pozitifti,% 11.4'ü Phl p 4 veya Phl p 1'e pozitifti.
| alerjen | Bermuda | Timothy | Humulus tarikatları | CCD |
| Bermuda | - | 0.709 ** | 0.682 ** | 0.565 ** |
| Cyn d 1 | 0.583 ** | 0.787 ** | 0.751 ** | 0.865 ** |
| Timothy | 0.709 ** | - | 0.921 ** | 0.856 ** |
| Phl p 4 | 0.645 ** | 0.941 ** | 0,886 * | 0.928 ** |
| Phl p 1 | 0.616 ** | 0.681 ** | 0.712 ** | 0.507 ** |
| Phl p 5 | 0.46 | 0.273 | 0,590 * | 0.624 * |
| Phl p 6 | 0.445 | 0.306 | 0.583 * | 0.569 |
| Phl 7 | 0.681 * | 0.481 | 0.632 * | 0.531 |
| Phl p 11 | 0.589 * | 0.372 | 0.620 * | 0.568 |
| Phl p 12 | 0.671 * | 0.411 | 0.565 | 0.446 |
| Humulus tarikatları | 0.682 ** | 0.921 ** | - | 0.853 ** |
Tablo 3: CCD ve çim poleni allerjenlerinin pozitifliği için korelasyon katsayıları. † korelasyon katsayısı r s olarak sunulmuştur; Bu non-parametrik veri seti için Spearman korelasyon analizi yapıldı. * P <0.05, ** P <0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tam otomatik immüno-analizör, bölgeler, laboratuvarlar ve kurumlar arasında ve zamanla tatmin edici bir tutarlılık sağlayabilir. Böyle bir otomatik prosedürün büyük oranda tezgah araştırması ve klinik çalışmaları desteklediği, pek çok allerjen ve / veya alerjen bileşeninin standartlaştırılmış tespitini mümkün kıldığı ve muhtemel alerjen çapraz reaktivitesini, CRD'lerin gelmesinden önce kolaylıkla ortaya çıkmayacak şekilde tespit ettiği bulunmuştur. Ayrıca, tüm test prosedürü, geniş bir coğrafi bölgenin yüzey araştırmasında gerekli olduğu gibi, yüksek verimlilik yöntemlerine olanak tanıyan sıkı kalite kontrolü ile tamamlanabilir. Test prosedürü çoğunlukla bir bilgisayar konsolu tarafından yürütülmesine rağmen, birkaç kritik konuya dikkat edilmelidir. Cihazın kullanım kılavuzuna titizlikle uyulması zorunludur; Herhangi bir sapma lazer ışını veya yüksek voltaj geriliminden gereksiz test hataları, mekanik hasar veya kişisel yaralanmalara neden olabilir. Her zaman enEmin ve doğru bir kalibrasyon eğrisinin sistemde saklandığından emin olun, çünkü bu test doğruluğuyla bağlantılıdır. Aksi takdirde, belirtilen kalibratörün sIgE konsantrasyonu, serum numunesi testlerinden önce ölçülmelidir. Ardından sistem, sonraki kullanım için kalibrasyon eğrisini otomatik olarak hesaplayabilir ve saklayabilir. Diğer laboratuvar tekniklerinde olduğu gibi, teknisyeni enfeksiyonlardan korumak ve çevreyi kirletmemek için insan serum manipülasyonunun güvenliğini gözlemlemek de önemlidir.
İlk kez, CRD yaklaşımı olarak tamamen otomatik bir immüno-analizör analizörü kullanarak, bu çalışma, güney Çin'deki Guangzhou'da alerjik rinit ve / veya astımı olan hastalarda Bermuda çim SEg pozitifliğinin (% 22.5) önemli bir prevalansını gösterdi. Timothy çim ve Humulus tarikatları Guangzhou'da yaygın olmayan, hatta var olmayan bir yana, Timothy otunun pozitiflik oranları (% 13.6) ve Humulus scandens sIgE (% 7.0) mÇimen polenleri arasındaki çapraz reaktiviteye atfedilebilir.
Ot polen allerjenlerini analiz ederek, tüm Timothy çim IgE pozitif hastaların, aynı zamanda, belirli Timothy çimen antijen Phl p 4 için pozitif oldukları açıkça gösterildi. Çok az (% 17.1) Phl p 1'e pozitif test edildi, bu, şaşırtıcı bir şekilde veriden farklıydı Avrupa'da, Phl p 1'e pozitiflik oranı Phl p 4 18 , 20 , 21'den çok daha yüksektir. Phl p 1, Timothy otunun ana bileşeni olduğundan, bu çalışma popülasyonunda Phl p 4 pozitifliği, bu çalışma popülasyonunda Phl p 1 üzerindeki pozitif oranı, "gerçek" duyarlılaştırmadan başka muhtemel çapraz reaktiviteyi de gösterebilir, çünkü Phl p 4, yapısal bir benzerliği paylaşır CCD ve bir dizi allerjenle birlikte, ağaçlar, sebzeler ve tropik meyveler dahil 19 , 22 , 23, 24 . Bu gözlemin klinik önemi, bu çalışmadaki Timothy çimen hastalarının çoğunluğunun Phl p 1 25'i kullanan Timothy çim immünoterapisini almaları önerilmemelidir.
Çalışma yöntem ve tekniklerinin çeşitli kısıtlamaları belirtilmelidir. İlk olarak, 3 adete kadar farklı kalibratör şeridi, immüno-analiz analizöründeki bir pipet / reaktif Kasetine yerleştirilebildiğinden maksimumda üç test partisi aynı anda çalıştırılabilir. Daha büyük bir bölgesel araştırmada olduğu gibi yoğun bir iş yükü gerektiği zaman, işlenmesi hala çok zaman alır. İkincisi, bu çalışmadaki analizörü kullanırken insan IgA, IgD, IgM ve IgG ile çapraz reaktivite fizyolojik konsantrasyonlarda mevcut değildir, bu nedenle bu immünoglobülinler ile çapraz reaktivite söz konusu olduğunda diğer araştırma yaklaşımlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Üçüncüsü, devicinin karmaşıklığına rağmenE, tam otomatik immüno-analizör ile yapılan bulgular, kesin bir teşhis konulduğunda diğer laboratuvar araştırmaları, klinik değerlendirmeler ve doktor uzmanlığının yerini almamalıdır. Dördüncüsü, Çin'de allerjen CRD'nin geç girişi nedeniyle, subtropikal çimen polen bileşenlerinin birkaç ticari ürünü mevcut değildir veya yakın zamana kadar araştırmalar için onaylanmamıştır. Bu nedenle, bu tekniği allerjenler için bir CRD yaklaşımı olarak kullanmak, bir bölgedeki belirli kullanım için üretici firmanın ürün tedariklerinin ticari olarak bulunabilirliğini esas almaktadır. Bitki polenlerinin her yerde karmaşıklığına sahip tropikal ve subtropikal bölgelerde, CRD çalışması, testler için karşılık gelen allerjen ürünlerinin olmaması nedeniyle yetersiz ve zor olabilir. Böyle bir ikilem, bu tekniğin verimliliğini büyük ölçüde tehlikeye atabilir.
Bununla birlikte, en son bilgilerimize göre, bu CRD yaklaşımını kullanan öncü bir çalışmadır tO Çin'in güneyindeki çim polen allerjenlerine duyarlılığı inceleyin. Bu konuda daha ileri çalışmalar devam edebilir ve bu bulguları doğrulayabilir.
Şimdiye kadar, tam otomatik immüno-analizör analizörü kullanan teknikler , in vitro allerjen testleri 26 , 27 için altın standart olarak kabul edilmiştir. Çin'in geniş topraklarında allerjene duyarlık konusunda çok sınırlı veri göz önüne alındığında, CRD yaklaşımı olarak tam otomatik immünoassay'ı kullanarak yapılan geniş örneklem çalışmaları, boşlukları doldurabilir ve bu alandaki mevcut kanıtlara katkıda bulunabilir. Genellikle çok merkezli ve ülke çapında yapılan işbirliğinin olduğu bu tür çalışmaların standartlaştırma protokolüne dayanan immünoassayların ağ bağlantısını gerektirebileceğini belirtmek önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yueming Su'ya figürün hazırlanmasında yardımından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Guangdong Bilim ve Teknoloji Vakfı (Proje No .: 2014A020212352), Guangzhou Eğitim Bürosu (1201630044; 1201630393) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC 81572063; NSFC 81601394) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImmunoCAP 1000 Instrument | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3800-01 | |
| Phadia Information Data Manager Software Package | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-11 | |
| Software Package, ImmunoCAP 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-12 | |
| g2 (Bermuda grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4131-01 | |
| g6 (Timothy grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4100-01 | |
| w22 (Japanese Hop) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4452-01 | |
| g216 (nCyn d 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4972-01 | |
| g205 (rPhl p 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5234-01 | |
| g208 (nPhl p 4) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5288-01 | |
| g215 (rPhl p 5b) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5338-01 | |
| g209 (rPhl p 6) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5289-01 | |
| g210 (rPhl p 7) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5290-01 | |
| g211 (rPhl p 11) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5291-01 | |
| g212 (rPhl p 12) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5292-01 | |
| o214 Cross-reacting carbohydrate determinants (CCDs) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5339-01 | |
| Specific IgE Conjugate 400 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9310-08 | |
| Specific IgE Calibrator Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9459-08 | |
| Specific IgE Curve Control Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9312-08 | |
| Specific IgE Anti-IgE ImmunoCAP | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4417-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Negative Control | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9445-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control L | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9528-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control M | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9529-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control H | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9530-01 | |
| Development Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9439-08 | |
| Stop Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 34-2271-58 | |
| Washing Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9202-08 | |
| FluoroC | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9264-01 | |
| Maintenance Solution Kit | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9476-01 |
References
- Scadding, G. K. BSACI guidelines for the management of allergic and non-allergic rhinitis. Clin Exp Allergy. 38 (1), 19-42 (2007).
- Pollart, S. M., Reid, M. J., Fling, J. A., Chapman, M. D., Platts-Mills, T. A. Epidemiology of emergency room asthma in northern California: association with IgE antibody to rye grass pollen. J Allergy Clin Immunol. 82 (2), 224-230 (1988).
- Wang, Q. Lower airway inflammation and hyperresponsiveness in non-asthmatic patients with non-allergic rhinitis. J Thorac Dis. 7 (10), 1756-1764 (2015).
- Ma, Y. The link between mold sensitivity and asthma severity in a cohort of northern Chinese patients. J Thorac Dis. 7 (4), 585-590 (2015).
- Luo, W. Major grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Mol Immunol. 78, 105-112 (2016).
- Zhang, Y., Zhang, L. Prevalence of allergic rhinitis in china. Allergy Asthma Immunol Res. 6 (2), 105-113 (2014).
- Zeng, G., Zheng, P., Luo, W., Huang, H., Wei, N., Sun, B. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Mol Immunol. 74, 1-9 (2016).
- Kleine-Tebbe, J., Matricardi, P. M., Hamilton, R. G. Allergy work-up including component-resolved diagnosis: how to make allergen-specific immunotherapy more specific. Immunol Allergy Clin North Am. 36 (1), 191-203 (2016).
- Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, southern China. PLoS One. 9 (5), e94776 (2014).
- Zeng, G. Component-resolved diagnostic study of Dermatophagoides pteronyssinus major allergen molecules in a southern Chinese cohort. J Investig Allergol Clin Immunol. 25 (5), 343-351 (2015).
- Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma (ARIA). Management of Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma Pocket Guide. , Available from: http://www.whiar.org/docs/ARIA_PG_08_View_WM.pdf (2015).
- Global Initiative for Asthma (GINA). Pocket Guide for Asthma Management and Prevention. , Available from: http://ginasthma.org/wp-content/uploads/2016/01/GINA_Pocket_2015.pdf (2015).
- Liu, J., Guo, A., Guo, H. Morphological variation and types of Cynodon dactylon. Acta Prataculture Sinica. 12 (6), 99-104 (2003).
- Zhang, H., Xi, J. Study on the germplasm resource and ecological characteristics of wild carpet grass (Axonopus compressus) in Guangdong. Grassland and Turf. 13 (1), 25-28 (2005).
- Kao, S. H., Su, S. N., Huang, S. W. Sub-proteome analysis of novel IgE-binding proteins from Bermuda grass pollen. Proteomics. 5 (14), 3805-3813 (2005).
- Ouyang, Y. H., Zhang, D. S., Fan, E. Z., Li, Y., Zhang, L. Correlation between symptoms of pollen allergic rhinitis and pollen grain spreading in summer and autumn. Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Waike Zazhi. 47 (8), 623-627 (2012).
- Westritschnig, K. Analysis of the sensitization profile towards allergens in central Africa. Clin Exp Allergy. 33 (1), 22-27 (2003).
- Rossi, R. E., Monasterolo, G., Monasterolo, S. Measurement of IgE antibodies against purified grass-pollen allergens (Phl p 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, and 12) in sera of patients allergic to grass pollen. Allergy. 52 (12), 1180-1185 (2001).
- Zafred, D., Nandy, A., Pump, L., Kahlert, H., Keller, W. Crystal structure and immunologic characterization of the major grass pollen allergen Phl p 4. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 696-703 (2013).
- Chabre, H. Molecular variability of group 1 and 5grass pollen allergens between Pooideae species: implications for immunotherapy. Clin Exp Allergy. 40 (3), 505-519 (2010).
- Mari, A. Skin test with a timothy grass (Phleum pratense) pollen extract vs.IgE to a timothy extract vs. IgE to rPhl p 1 rPhl p 2, nPhl p 4, rPhl p 5, rPhl p 6, rPhl p 7, rPhl p 11, and rPhl p 12: epidemiological and diagnostic data. Clin Exp Allergy. 33 (1), 43-51 (2003).
- Grote, M., Stumvoll, S., Reichelt, R., Lidholm, J., Rudolf, V. Identification of an allergen related to Phl p 4, a major timothy grass pollen allergen, in pollens, vegetables, and fruits by immunogold electron microscopy. Biol Chem. 383 (9), 1441-1445 (2002).
- Andersson, K., Lidholm, J. Characteristics and immunobiology of grass pollen allergens. Int Arch Allergy Immunol. 130 (2), 87-107 (2003).
- Tripodi, S. Molecular profiles of IgE to Phleum pratense in children with grass pollen allergy: implications for specific immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 129 (3), 834-839 (2012).
- Stumvoll, S., et al. Purification, structural and immunological characterization of a timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen Phl p 4, with cross-reactive potential. Biol Chem. 383 (9), 1383-1396 (2002).
- Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Ann Allergy Asthma Immunol. 99 (1), 34-41 (2007).
- Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (IgE) tests performed by different assay systems. J Allergy Clin Immunol. 121 (5), 1219-1224 (2008).
