Summary
I detta arbete beskrivs ett protokoll som använder en komponentlösad metod för att studera sensibilisering mot gräs pollenallergener i en kohort av patienter från södra Kina med allergisk rinit och / eller astma.
Abstract
Sensibilisering till gräs pollen innebär en global risk för allergiska luftvägssjukdomar. Trots att förebyggandet är beroende av lokal undersökning av pollenallergenerna är data om detta ämne begränsat i södra Kina. Eventuell tillgänglig data erhölls genom självrapporterade frågeformulär, hudprickprov och totalt eller specifikt IgE-test med hjälp av råa extrakt. Av många anledningar är dessa metoder opålitliga. Serum sIgE reaktivitet mot Bermuda gräs, Timothy gräs och Humulus skandensallergener i en kohort av patienter från Greater Guangzhou (södra Kinas största stad och dess utkanter) med allergisk rinit och / eller astma undersöktes med hjälp av en helautomatiserad immunanalysanalysator som en komponent -lösta diagnostikverktyget (CRD).
För första gången visades en betydande hög prevalens av Bermuda gräs sIgE positivitet hos kinesiska sydstäder med allergisk rinit och / eller astma. I dessa patienter är en subtil förekomst av sensibiliseringTill Timothy gräs och Humulus skandaler noterades också, vilket kan uppstå genom korsreaktivitet, eftersom de senare två inte är vanliga i regionen. Detta stöddes också av detektering av allergenkomponenter.
Fullautomatiserade immunanalysatorer kan erbjuda tillfredsställande konsistens mellan regioner, laboratorier och institutioner och över tiden. Instrumentets automatik kan möjliggöra en standardiserad detektering som inte lätt skulle ha avslöjats före CRDs framkomst.
Detta är en studie som använder en CRD-metod för att undersöka sensibilisering mot gräs pollenallergener i södra Kina. Det lägger till aktuella bevis i litteraturen. Framtida studier behövs för att validera dessa resultat. Även om CRD är ett användbart verktyg, bör resultaten som gjorts med den helautomatiska immunanalysanalysatorn inte ersätta andra laboratorieundersökningar, kliniska utvärderingar och läkarkompetens.
Introduction
Gräs pollen står för nästan 50% av immunoglobulin E (IgE) -relaterade allergier och orsakar på grund av sin luftburna natur en global risk för allergiska luftvägssjukdomar, särskilt astma och allergisk rinit 1 , 2 , 3 , 4 . Förebyggande av gräs pollenallergier i en region är beroende av information om lokalfördelningen av pollenallergenerna. Tyvärr varierar spektrumet hos de sensibiliserande allergenerna från plats till plats-en observation som allmänt kallas regional specificitet.
I Kina är ett stort östasiatiskt territorium den regionala specificiteten av gräns pollensensibilisering ytterligare komplicerad av begränsade data som för närvarande finns tillgängliga från den södra delen av landet under de senaste decennierna 5 . En sådan brist på data har lett till en svårighet att visa den övergripande gräs pollen sensiI detta stora land 6 . Dessutom var de mycket begränsade uppgifterna om kinesiska sydstäder i stor utsträckning erhållna från självrapporterade frågeformulär, hudprickprov (i stället för laboratorieserumtester), totala IgE-mätningar (i stället för allergenspecifika IgE (sIgE)) och sIgE-detektion på allergener ( Snarare än till allergenkomponentmolekyler).
Självrapporteringen av allergiska symptom kan vara opålitlig när specifika allergener berörs. Hudprickningstester, även om de är allmänt tillgängliga, inbegriper användningen av icke-standardiserade, råa allergenextrakt, vilka själva kan innehålla andra sensibiliserande komponenter som förvirrar resultattolkningen. Tillförlitligheten hos hudpricktestet beror också kritiskt på skicklig manipulation av allergiker eller specialistvårdare, ny användning av histamin och patientöverensstämmelse (ibland mycket svårt för små barn). Total IgE är användbar för screening av en allergi men bestämmer inte förnuftigtE förekommande allergener hos en patient. Dessutom innehåller nästan alla allergener ett antal allergenkomponentmolekyler. Sensibilisering till huvudkomponenterna ( dvs. Der p 1 och Der p 2 från husdammmider) kan föreslå en "äkta" allergi (allergi mot ett specifikt allergen, i stället för falsk positivitet på grund av korsreaktioner med andra allergener), men sensibilisering Till vissa ( dvs den korsreaktiva Der p 10, ett tropomyosin) får inte 7 .
Innan komponentupplöst diagnostik (CRD) infördes, hindrade dessa nedslående motgångar allergiframkallande studier i Kina. CRD detekterar precis komponenterna i ett allergen genom användning av rekombinanta eller renade allergenmolekyler, varigenom mätningen lätt kan kvantifieras och karakteriseras 8 . Under de senaste decennierna har allergi studier ofta använt råa extrakt av allergener som oundvikligen innehåller ett antal irrelevanta komponenter. Många av dessa coMponents är inerta, men ibland kan vissa leda till störningar av positiva reaktioner. Användningen av rekombinanta eller renade allergenmolekyler i CRD kan kringgå detta och ger därför bättre testnoggrannhet. När det behandlas i mikroarrays, skärmar en CRD-metod snabbt eller identifierar sensibilisering till hundratals allergenmolekyler i enskilda ämnen. En väl utformad CRD-studie om gräns pollen sensibilisering i södra Kina saknas för närvarande. Helst bör en sådan studie innefatta en lokal befolkning med stor geografisk täckning, redogöra för gräspollen som vanligtvis rapporteras i Kina och ta itu med de tekniska aspekter som nämns ovan. För att nå en praktisk nivå av klinisk relevans och för att underlätta rekryteringen av serumprover kan även tidig undersökning av sensibilisering mot gräs pollen som inhalationsallergener vara inriktad på patienter med allergiska respiratoriska störningar, snarare än hos den allmänna befolkningen.
I det här arbetet beskrivs en metodAnvänds för att testa serum-reaktivitet mot Bermuda-gräs, Timothy-gräs och Humulus- skandon hos patienter från Greater Guangzhou (södra Kinas största stad och dess utkanter) med allergisk rinit och / eller astma med hjälp av CRD-metoden 5 . Dessa fynd om sensibilisering till dessa subtropiska och tempererade gräs pollen i södra Kina lägger till viktiga bevis för det som för närvarande finns i litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studieprotokollet, inklusive användning av humant serumprov, godkändes av etikkommittén, Förbunds Sjukhus i Guangzhou Medical University. Alla deltagare erbjöd skriftligt informerat samtycke, antingen självständigt eller via sina föräldrar (när det gäller barn). Protokollet har registrerats online (Kinesiska kliniska prövningsregistret, Reg nr: ChiCTR-DCC-13004003, se http://www.chictr.org/cn/).
1. Identifiering av studiebefolkningen
ANMÄRKNING: Allergiinformationsförteckningen för State Key Laboratory of Respiratory Disease (AIR-SKLRD) är den främsta källan till patientrekrytering, eftersom AIR är den mest väl dokumenterade stora databasen av patienter för allergenstest i södra Kina 9 , 10 . AIR har lagrat serumprover av patienter i nästan ett decennium. Kortfattat framställdes dessa lagrade prover tidigare genom centrifugering 5 ml oF-flebotomiserat venöst blod i 10 min vid 3000 xg och utvinning av supernatanten. Serumproverna placerades i -80 ° C kylskåp för långvarig lagring. Prover som uppfyllde kriterierna för patientintegration var redo att användas för alla test i den aktuella studien.
- Från AIR-databasen hämtar du data om patienter med allergisk rinit och / eller astma som genomgått serumtester för gräsallergensalgE mellan januari 2013 och juni 2015, den förutformade studieperioden.
- Välj patienter med mild till måttlig allergisk rinit och / eller astma i enlighet med Allergic Rhinitis och dess effekter på astma (ARIA) 11 och Globala initiativet för astma (GINA) 12 riktlinjer. Tilldela dem som "studiegrupp".
- Undanta patienter med ofullständiga journaler, de som förloras för uppföljning, de som vägrar att ge informerat samtycke om användningen av deras serumprover för vetenskapliga ändamål, de med identifieradeMmunodeficiency, de för närvarande på immunterapi eller immunmodulerande medel, eller de som har funnit parasitiska infektioner.
- Välj en samtida kohort av patienter med icke-respiratoriska allergier ( dvs. eksem, allergisk dermatit och matallergi) enligt samma uteslutningskriterier och tilldela dem som "kontrollgrupp".
- Se till att serumproverna samlades innan några recept eller behandlingar gavs för att minimera förvirrande effekter på laboratoriefynden. Uteslut eventuellt serumprov som inte uppfyller detta krav.
- Se till att alla ämnen är permanenta invånare från alla delar av Greater Guangzhou ( dvs. födda eller bott där i mer än 10 år).
2. Studieflöde och mätningar av intresse
- Hämta serumproverna av berättigade patienter från bio-banken. För att testa en allergen / allergen komponent, använd 140 μL serum (inklusive 100 μL för att fyllaUpp det döda rummet).
OBS: Den maximala totala serumvolymen som behövs för varje patient i denna studie är: 3 specifika allergener och 8 allergenkomponenter, sIgE = 140 μL * 11 = 1 540 μL. - Vid användning av detta instrument testar man i första hand serumproverna för sIgEs på hel allergener av Bermuda gräs, Timothy gräs och Humulus skandon . Följ anvisningarna i avsnitt 3.
OBSERVERA: Dessa pollen valdes för mätningarna eftersom Bermuda gräs 13 , 14 , 15 och Humulus skandon 16 har rapporterats mycket i Kina, medan Timothy gräs 17 , 18 , 19 är en typisk växtart som lever i miljöer från tropiskt till tempererat Zoner och är mest studerade över hela världen. - Testa sekundärt serumproverna identifierade i steg 2.3 att haSuger till hel allergener för närvaron av sigger till allergenbeståndsdelar i Bermuda [Cyn d 1 (g216)], Timothy [Phlp 1 (g205), Phl p4 (g208), Phl p5 (g215), Phl p6 (g209) ), Phl p7 (g210), Phl p 11 (g211) och Phl p12 (g212)] och korsreaktiva kolhydratdeterminanter [CCD (o214)]. Följ anvisningarna i avsnitt 3.
3. Fullautomatiserad testprocedur med hjälp av immunanalyssystemet
OBS! Hela proceduren för allergen sIgE-testning, som är helt automatiserad och har beskrivits någon annanstans 7 , 8 , 9 , 10 , följer tillverkarens protokoll.
- Starta den helautomatiska immunanalysanalysatorn ( t.ex. ImmunoCAP1000) och använd den för att utföra immunanalysen genom hela studien. Slå på den inbyggda informationsdatahanterings (IDM) -datorn.
OBS: Immunanalysen analYzer är rutinmässigt i standby-läge. - Med "Primary Power" på, sätt på "System Power" och vänta 3 minuter tills den inbyggda programvaran startar. Klicka på "Ladda sköljlösning" och "Ladda tvättlösning."
- Tillsätt 140 μL serum till en ampull för varje allergen / allergenkomponenttest. Märk varje flaska innehållande 140 μl serum med ett identifikationsnummer som är unikt för varje patient.
- Från IDM-gränssnittet, utför följande steg genom att klicka på menyn.
- Kontrollera fönstret "Request List" på IDM för att se till att "sIgE" är testmetoden som valts.
- Fyll provrören i provhållarna och kvalitetskontrollrören i kvalitetskontrollställen med streckkoder.
ANMÄRKNING: För varje patient var testningen initialt planerad för sIgE till 3 specifika allergener och 8 allergenkomponenter, eller 346 * 11 (3 806) provrör. För varje provrör, 3 kvalitetskontrollrörSom innehåller låga, medelstora och höga nivåer av sIgE-kontroll (se Materialetabellen för detaljer) matchades. Så småningom undersöktes endast 58 patienter som testade positivt i primärtestet (steg 2.3) i sekundärtestet (steg 2.3). Laddningen av rör kan automatiskt ställas in på datorkonsolen. - Välj "Ladda reagenser" på skärmen "Analysbehandling". Komplettera provtagningen och kvalitetskontrollställen, utvecklingslösningen, konjugat, kalibratorer, bärare, pipettspetsar, stopplösning och tvättlösning enligt "Lastlistan" (se materialet för detaljer).
- I "Ladda och starta" trycker du på "OK".
OBS! I slutet av mätningen visas resultaten på IDM. - Välj den data som ska exporteras från IDM-gränssnittet. Klicka på "Meny", "Godkänn" och "Spara som" och exportera sIgE-mätresultaten som en kalkylarkfil. Importera kalkylarkfilen till en statistisk programvara ( t.ex. SPSS) 10 . Använd en specifik modul för Spearmans koefficienter från SPSS-menyn, analysera korrelationerna i sensibilisering mellan dessa gräspollen (positiva sIgE till hel allergen) och pollenkomponenter (positiva sIgE mot allergenmolekyler).
4. Definition av sIgE Reaktivitet
OBS: För ett ospädd serumprov är intervallet av specifikt IgE-mätning 0,35-100 kU / L.
- Späd provet med sIgE-värden> 100 kU / L 1: 5 och ompröva. Om värdet förblir högre än 100 kU / L fortsätt med ytterligare utspädningar tills en slutpunktsnivå upp till 1000 kU / L uppnås.
- Baserat på tröskelvärdet 0,35 kU / L, anser en sIgE-nivå överstigande 0,35 kU / L vara positiv 5 , 7 , 10 . Betygsätt den reaktivaKlass 1 (≥0,70 och <3,50 kU / L), klass 3 (≥3,50 och <17,50 kU / L), klass 4 (≥0,70 och <0,70 kU / L) 17,50 och <50,00 kU / L), klass 5 (≥50,00 och <100,00 kU / L) och klass 6 (≥100,00 kU / L).
5. Statistisk analys
- Analysera data med statistisk programvara ( t.ex. SPSS) 10 . Ange kvantitativa data som medel- och standardavvikelsen, de kvalitativa data som median- och interkvartilintervallet (IQR) och de kategoriska data som andelen positiva resultat.
- Använd ett chi-kvadrattest för mellangrupps-jämförelse av proportioner, ett upparat t-test för kvantitativ data och ett rangsumtest för kvalitativ data.
- Använd Pearsons test för korrelationsanalyser mellan parametriska data, med korrelationskoefficienterna uttryckta som "r" och Spearmans test för icke parametriska värden, med tHan korrelationskoefficienter uttryckta som " r s ." Tänk på statistisk signifikans när P -värden är <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den helautomatiserade immunanalysanalysatorn som användes i denna studie har en fastfasstruktur som är täckt med kovalent kopplingsallergener eller allergenkomponenter som reagerar med intressanta molekyler (sIgE) i serumprover från patienten. Med ett automatiskt program tvättar analysatorn av alla icke-specifika IgE med 150 μL sköljlösning och upprepar detta 5 gånger. Därefter tillsätter det enzymmärkta anti-IgE-antikroppar (50 μl) för att alstra ett komplex. Den enzymmärkta anti-IgE antikroppen (konjugat) är en sekundär antikropp som binder till ett specifikt IgE. Obundet anti-IgE-antikroppar elimineras genom tvättning med 150 | il tvättlösning (upprepad 3 gånger). Det bundna komplexet behandlas med ett utvecklingsmedel (50 | il) under 9 minuter vid 37 ° C. Utvecklingsmedlet är ett enzym-smältande medel som skär bort alla bundna anti-IgE antikroppar. Den senare avger fluorescens under alkaliskt tillstånd. Reaktionen stoppas medTillsatsen av alkalisk stopplösning. Därefter komprimerar instrumentet fastfasstrukturen för att pressa ut eluatet och att mäta fluorescensen hos det resulterande eluatet vid en våglängd av 470 nm. Fluorescensen är linjärt korrelerad med den absoluta nivån av analytmolekylerna av intresse i eluatet. Ett högre fluorescensvärde betyder mer sIgE i serumprovet. För att tolka testresultaten, omvandlar systemet automatiskt svaren på prover till koncentrationer med hjälp av en kalibreringskurva. Mätdata överförs elektroniskt till IDM-mjukvaran, som integrerar funktioner för beräkning av analysresultat, beräkning av statistik och resultatrapportering.
Efter insättnings- och uteslutningskriteriet undersökte föreliggande studie serum från 346 patienter. Studiegruppen inkluderade 78 patienter med enbart allergisk rinit, 92 tillsammans med astma och 88 samtidigtLider av astma och rinit. Kontrollgruppen inkluderade 88 patienter med icke-respiratoriska allergier. Dessa patienter var i åldern 1-87 år och bekräftades att de var permanenta invånare från alla delar av Greater Guangzhou, målområdet studie. Alla studiegrupper och kontrollgruppen var jämförbara i demografiska och sociala egenskaper, inklusive kön, ålder och familjehistoria. Av patienterna i studiegruppen testades 22,5% positivt mot Bermuda gräs, 13,6% till Timothy gräs och 7,0% för Humulus skandon . I studiegruppen var sensibiliseringshastigheten för någon gräspollen mycket högre än i kontrollgruppen ( tabell 1 ). Alla Bermudas gräsegal-negativa patienter var också negativa mot Timothy gräs och Humulus skandon . Det är av intresse att notera att patienter med allergisk rinit och / eller astma visade en anmärkningsvärt högre sensibiliseringsgrad för Bermuda gräs (n = 58, 22,5%) än de med andra allergier (n = 4, 4,5%).
Humulus skandon eller CCD under 30%. Däremot hade patienter med klass 4-Bermuda-gräsens reaktivitet 67-100% chans för samtidig positivitet mot Cyn d 1, Timothy gräsallergener, Humulus- skandon eller CCD ( Figur 1 ). Bermuda gräs sIgE reaktivitetsnivåer visade en signifikant korrelation med chanserna för positivitet mot andra gräs pollen IgE ( r s = 0.669, P <0.001).
Timothy gräs sensibilisering bedömdes vidare av SIgE till Timothy gräs komponenter. Bland de 35 timotiska gräspositiva patienterna var den vanligaste detekterade allergenkomponenten Phl p 4 (100%, 35/35) följt av Phl p 1(17,1%, 6/35). Tre patienter vardera (3/35, 8,6%) var positiva för någon av Phl p 5, 6, 7, 11 och 12 ( tabell 2 ). Serum Phl p 4 sIgE-nivåer korrelerade starkt med totala Timothy gräs allergen och CCD sIgE nivåer ( r s = 0,941 respektive 0,928, P <0,001, Tabell 3 ). 41,4% (24/58) av Bermuda gräspositiva patienter och 68,6% (24/35) av Timothy gräsens sensibiliserade patienter var sIgE positiva mot CCD. Spearmans rangkorrelationsanalys visade en signifikant association i sensibilisering mellan CCD och andra gräsallergener ( Tabell 3 ).
Figur 1: Kombisensibilisering bland patienter positiva mot Bermuda Grass SIgE.
Denna figur visar andelen patienter med olika klasser av sIgE-reaktivitet mot Bermuda-gräs (n = 58) och en sammanhängandeAnt sensibilisering till Timothy gräs, Humulus skandon , CCD och andra gräs allergen komponenter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Graden av positiva tester [% (n / patienter)] | |||
| Bermuda gräs | Timothy gräs | Humulus skandon | |
| Patienter med AR och / eller AS | 22,5% (58/258) †† ‡ | 13,6% (35/258) † | 7,0% (18/258) |
| Patienter med AR | 21,8% (17/78) †† | 10,2% (8/78) | 7,7% (6/78) |
| Patienter med AS | 22,8% (21/92)†† | 14,1% (13/92) † | 5,4% (5/92) |
| Patienter med AR och AS | 22,7% (20/88) †† | 15,9% (14/88) | 8,0% (7/88) |
| Ålder | |||
| <14 år eller yngre | 18,6% (8/43) | 14,0% (6/43) | 7,0% (3/43) |
| > 4 år | 23,3% (50/215) | 13,5% (29/215) | 7,0% (15/215) |
| Sex | |||
| Manlig | 25,7% (35/136) | 13,9% (19/136) | 7,4% (10/136) |
| Kvinna | 18,8% (23/122) | 13,1% (16/122) | 6,6% (8/122) |
| Patienter med annan allergi | 4,5% (4/88) ** | 1,1% (1/88) ** | 0 * |
Tabell 1: Patienter med sIgE-positiva test för Bermuda Grass, Timothy Grass och Humulus skandon Baserat på sjukdomsenhet och demografiska detaljer. En högre andel patienter med allergiska respiratoriska sjukdomar var positiva för Bermuda gräs (χ 2 = 14,35, P <0,001), Timothy gräs (χ 2 = 10,88, P <0,001) och Humulus skandon (χ 2 = 5,14, P = 0,02 ) Jämfört med andra allergikontroller ( ** P <0,01, * P <0,05). Andelen patienter med positivt Bermuda gräs test var anmärkningsvärt högre än andelen för Timothy gräs ( ‡; P <0,05) och Humulus-skandon ( †† P <0,01). Andelen patienter med positivt Timothy gräsprov var högre än Humulus skandon ( † P <0,05). Andelen positiva test på Bermuda gräs, Timothy gräs och Humulus skandon sIgE varade inte signifikant mellan de mindre och vuxna grupperna (x 2 = 0,07, P = 0,79; x 2 = 0,06, P = 0,80; x 2 = 0,11, P = 0,74). Priserna på gräspollen känsligheter var inte statistiskt olika mellan män och kvinnor (χ2 = 1,338, P = 0,25; x 2 = 0,063, P = 0,80; x 2 = 0,38, P = 0,54). På liknande sätt indikerades inga signifikanta skillnader i känslighetsnivåer mellan rinit- och astmapatienterna (x 2 = 0,030, P = 0,985; x 2 P = 0,558; X2 = 0,528, P = 0,768; respektive).
| Patienter (%) | Phl p 4 | Phl p 1 | Phl p 5 | Phl p 6 | Phl p 11 | Phl p 7 | Phl s 12 | |
| 28 (80,0%) | + | |||||||
| 4 (11,4%) | + | + | ||||||
| 1 (2,9%) | + | + | + | + | + | + | ||
| 2 (5,7%) | + | + | + + | + | + | + | ||
| Total | 35 (100%) | 6 (17,1%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | |
| SIgE a (kU / L) | 0,52, 0,06-2,02 | 0,02, 0,01-0,10 | 0,04, 0,03-0,24 | 0,12, 0,03-0,34 | 0,05, 0,02-0,27 | 0,03, 0,02-0,36 | 0,10, 0,04-0,28 |
Tabell 2: Sensibilisering av Timothy Grass enligt SägE Positivitet och nivåer av Timothy Grass Components (N = 35). +, Positiva test A , sIgE nivåer (kU / L) visas som median och IQR. Av de 35 timotiska gräset-positiva patienterna var 80,0% enbart Phlp4-positiv, medan 11,4% var positiva mot Phlp4 eller Phl p1.
| allergen | Bermuda | Timothy | Humulus skandon | CCD |
| Bermuda | - | 0,709 ** | 0,682 ** | 0,565 ** |
| Cyn d 1 | 0,583 ** | 0,787 ** | 0,751 ** | 0,865 ** |
| Timothy | 0,709 ** | - | 0,921 ** | 0,856 ** |
| Phl p 4 | 0,645 ** | 0,941 ** | 0,886 * | 0,928 ** |
| Phl p 1 | 0,616 ** | 0,681 ** | 0,712 ** | 0,507 ** |
| Phl p 5 | 0,46 | 0,273 | 0,590 * | 0,624 * |
| Phl p 6 | 0.445 | 0,306 | 0,583 * | 0,569 |
| Phl p 7 | 0,681 * | 0,481 | 0,632 * | 0,531 |
| Phl p 11 | 0,589 * | 0,372 | 0,620 * | 0,568 |
| Phl s 12 | 0,671 * | 0,411 | 0,565 | 0,446 |
| Humulus skandon | 0,682 ** | 0,921 ** | - | 0,853 ** |
Tabell 3: Korrelationskoefficienter † för positivitet mellan CCD och gräspollenallergenerna. † presenteras som korrelationskoefficienten r s ; Spearmans korrelationsanalyser utfördes för denna icke-parametriska dataset. * P <0,05, ** P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fullautomatiserade immunanalysatorer kan erbjuda tillfredsställande konsistens mellan regioner, laboratorier och institutioner och över tiden. En sådan automatisk procedur har visat sig väsentligt stödja bänkforskning och kliniska studier, möjliggöra standardiserad detektion av många allergener och / eller allergenkomponenter och identifiera sannolik allergen-korsreaktivitet som inte skulle ha blivit lätt avslöjad före tillkomsten av CRD. Dessutom kan hela provningsförfarandet kompletteras med strikt kvalitetskontroll, vilket möjliggör hög genomströmningsmetoder, vilket krävs i en undersökning av en stor geografisk region. Även om testproceduren för det mesta drivs av en datorkonsol, bör flera kritiska problem uppmärksammas. Det är obligatoriskt att instrumentet används i strikt överensstämmelse med användarmanualen. Eventuell aberration kan leda till onödiga testfel, mekanisk skada eller personskada från laserstråle eller hög elektrisk spänning. Alltid enSäkerställ att en korrekt och korrekt kalibreringskurva har lagrats i systemet, eftersom detta är kopplat till testets noggrannhet. I annat fall bör sIgE-koncentrationen av en specificerad kalibrator mätas före serumprovprov. Därefter kan systemet automatiskt beräkna och lagra kalibreringskurvan för efterföljande användning. Precis som vid andra laboratorietekniker är det också viktigt att iaktta säkerheten hos human serummanipulation för att skydda tekniker mot infektioner och för att undvika att förorena miljön.
För första gången visade den här undersökningen för första gången en stor förekomst av Bermuda gräs sIgE positivitet (22,5%) hos patienter med allergisk rinit och / eller astma i Guangzhou, södra Kina, genom att använda en helautomatiserad immunanalysanalysator som ett CRD-tillvägagångssätt. Eftersom Timothy gräs och Humulus skandaler inte är vanliga, inte ens existentiella, i Guangzhou, positiviteten hos Timothy gräs (13,6%) och Humulus scandens sIgE (7,0%) mAy tillskrivas korsreaktivitet bland gräs pollen.
Genom att analysera gräspollenallergener visades det tydligt att alla Timoteys gräs IgE-positiva patienter också var positiva mot det specifika Timothy gräsantigenet Phl p 4. Mycket få (17,1%) testades positivt på Phl p 1, vilket var överraskande annorlunda än data I Europa där positiviteten för Phl p 1 är mycket högre än den för Phl p 4 18 , 20 , 21 . Eftersom Phl p 1 är huvudkomponenten i Timothy-gräset, kan den övervägande frekvensen av Phl p4 positivitet över Phl p 1 i denna studiepopulation också föreslå sannolik korsreaktivitet annan än "äkta" sensibilisering, eftersom Phl p 4 delar en strukturell likhet Med CCD och ett antal andra allergener, inklusive träd, grönsaker och tropiska frukter 19 , 22 , 23, 24 . Den kliniska relevansen av denna observation kan vara att majoriteten av Timothys gräspositiva patienter i denna studie aldrig skulle ha fått råd att ta emot Timothy gräsimmunterapi, som för närvarande använder Phl p 1 25 .
Flera begränsningar av studiemetoderna och teknikerna måste nämnas. För det första, eftersom upp till 3 olika kalibratorremsor kan placeras i ett pipett / reagensfack i immunanalysanalysatorn, kan maximalt tre provbatcher köras samtidigt. När en stor arbetsbörda krävs, som i en större regional undersökning, tar det fortfarande en betydande tid att bearbeta. För det andra är korsreaktiviteten med humant IgA, IgD, IgM och IgG obefintlig vid fysiologiska koncentrationer vid användning av analysatorn från denna studie, så andra undersökningsförfaranden behövs när korsreaktivitet med dessa immunoglobuliner är berörda. För det tredje, trots den deviciska sofistikenE, resultaten som gjordes med den helautomatiserade immunanalysanalysatorn bör inte ersätta andra laboratorieundersökningar, kliniska utvärderingar och läkarexpertis när en definitiv diagnos görs. För det fjärde, på grund av den sena introduktionen av allergen-CRD i Kina är flera kommersiella produkter av subtropiska gräspollenkomponenter otillgängliga eller inte godkända för forskning förrän nyligen. Att använda denna teknik som ett CRD-tillvägagångssätt för allergener beror därför på kommersiell tillgänglighet av produkttillbehör från tillverkaren för specifikt bruk i en region. I tropiska och subtropiska regioner med allmänt förekommande växtpollenämnen kan en CRD-studie vara otillräcklig och svår på grund av brist på motsvarande allergenprodukter för testen. Ett sådant dilemma kan kraftigt äventyra effektiviteten hos denna teknik.
Ändå är det enligt vår senaste kunskap en banbrytande studie som använder CRD-metoden tO undersöka sensibilisering mot gräs pollenallergener i södra Kina. Ytterligare studier kan fortsätta i denna åder och validera dessa resultat.
Hittills har tekniker som använder den helautomatiska immunanalysanalysatorn accepterats som guldstandard för in vitro allergen sIgE-test 26 , 27 . Med tanke på de mycket begränsade uppgifterna om allergensensibilisering inom Kinas stora territorium kan storprovstudier som använder den helautomatiska immunanalysen som ett CRD-tillvägagångssätt fylla luckorna och lägga till de tillgängliga uppgifterna inom detta område. Det är viktigt att notera att sådana studier, vanligtvis multicenter och rikstäckande samarbeten, kan kräva nätverksammanställning av immunanalyser baserat på ett standardprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Yueming Su för hans hjälp med att förbereda figuren. Denna studie finansierades av Guangdong Science and Technology Foundation (Projekt nr: 2014A020212352), Guangzhou Education Bureau (1201630044; 1201630393) och National Natural Science Foundation of China (NSFC 81572063, NSFC 81601394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImmunoCAP 1000 Instrument | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3800-01 | |
| Phadia Information Data Manager Software Package | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-11 | |
| Software Package, ImmunoCAP 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-12 | |
| g2 (Bermuda grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4131-01 | |
| g6 (Timothy grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4100-01 | |
| w22 (Japanese Hop) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4452-01 | |
| g216 (nCyn d 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4972-01 | |
| g205 (rPhl p 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5234-01 | |
| g208 (nPhl p 4) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5288-01 | |
| g215 (rPhl p 5b) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5338-01 | |
| g209 (rPhl p 6) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5289-01 | |
| g210 (rPhl p 7) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5290-01 | |
| g211 (rPhl p 11) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5291-01 | |
| g212 (rPhl p 12) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5292-01 | |
| o214 Cross-reacting carbohydrate determinants (CCDs) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5339-01 | |
| Specific IgE Conjugate 400 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9310-08 | |
| Specific IgE Calibrator Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9459-08 | |
| Specific IgE Curve Control Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9312-08 | |
| Specific IgE Anti-IgE ImmunoCAP | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4417-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Negative Control | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9445-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control L | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9528-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control M | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9529-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control H | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9530-01 | |
| Development Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9439-08 | |
| Stop Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 34-2271-58 | |
| Washing Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9202-08 | |
| FluoroC | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9264-01 | |
| Maintenance Solution Kit | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9476-01 |
References
- Scadding, G. K. BSACI guidelines for the management of allergic and non-allergic rhinitis. Clin Exp Allergy. 38 (1), 19-42 (2007).
- Pollart, S. M., Reid, M. J., Fling, J. A., Chapman, M. D., Platts-Mills, T. A. Epidemiology of emergency room asthma in northern California: association with IgE antibody to rye grass pollen. J Allergy Clin Immunol. 82 (2), 224-230 (1988).
- Wang, Q. Lower airway inflammation and hyperresponsiveness in non-asthmatic patients with non-allergic rhinitis. J Thorac Dis. 7 (10), 1756-1764 (2015).
- Ma, Y. The link between mold sensitivity and asthma severity in a cohort of northern Chinese patients. J Thorac Dis. 7 (4), 585-590 (2015).
- Luo, W. Major grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Mol Immunol. 78, 105-112 (2016).
- Zhang, Y., Zhang, L. Prevalence of allergic rhinitis in china. Allergy Asthma Immunol Res. 6 (2), 105-113 (2014).
- Zeng, G., Zheng, P., Luo, W., Huang, H., Wei, N., Sun, B. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Mol Immunol. 74, 1-9 (2016).
- Kleine-Tebbe, J., Matricardi, P. M., Hamilton, R. G. Allergy work-up including component-resolved diagnosis: how to make allergen-specific immunotherapy more specific. Immunol Allergy Clin North Am. 36 (1), 191-203 (2016).
- Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, southern China. PLoS One. 9 (5), e94776 (2014).
- Zeng, G. Component-resolved diagnostic study of Dermatophagoides pteronyssinus major allergen molecules in a southern Chinese cohort. J Investig Allergol Clin Immunol. 25 (5), 343-351 (2015).
- Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma (ARIA). Management of Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma Pocket Guide. , Available from: http://www.whiar.org/docs/ARIA_PG_08_View_WM.pdf (2015).
- Global Initiative for Asthma (GINA). Pocket Guide for Asthma Management and Prevention. , Available from: http://ginasthma.org/wp-content/uploads/2016/01/GINA_Pocket_2015.pdf (2015).
- Liu, J., Guo, A., Guo, H. Morphological variation and types of Cynodon dactylon. Acta Prataculture Sinica. 12 (6), 99-104 (2003).
- Zhang, H., Xi, J. Study on the germplasm resource and ecological characteristics of wild carpet grass (Axonopus compressus) in Guangdong. Grassland and Turf. 13 (1), 25-28 (2005).
- Kao, S. H., Su, S. N., Huang, S. W. Sub-proteome analysis of novel IgE-binding proteins from Bermuda grass pollen. Proteomics. 5 (14), 3805-3813 (2005).
- Ouyang, Y. H., Zhang, D. S., Fan, E. Z., Li, Y., Zhang, L. Correlation between symptoms of pollen allergic rhinitis and pollen grain spreading in summer and autumn. Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Waike Zazhi. 47 (8), 623-627 (2012).
- Westritschnig, K. Analysis of the sensitization profile towards allergens in central Africa. Clin Exp Allergy. 33 (1), 22-27 (2003).
- Rossi, R. E., Monasterolo, G., Monasterolo, S. Measurement of IgE antibodies against purified grass-pollen allergens (Phl p 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, and 12) in sera of patients allergic to grass pollen. Allergy. 52 (12), 1180-1185 (2001).
- Zafred, D., Nandy, A., Pump, L., Kahlert, H., Keller, W. Crystal structure and immunologic characterization of the major grass pollen allergen Phl p 4. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 696-703 (2013).
- Chabre, H. Molecular variability of group 1 and 5grass pollen allergens between Pooideae species: implications for immunotherapy. Clin Exp Allergy. 40 (3), 505-519 (2010).
- Mari, A. Skin test with a timothy grass (Phleum pratense) pollen extract vs.IgE to a timothy extract vs. IgE to rPhl p 1 rPhl p 2, nPhl p 4, rPhl p 5, rPhl p 6, rPhl p 7, rPhl p 11, and rPhl p 12: epidemiological and diagnostic data. Clin Exp Allergy. 33 (1), 43-51 (2003).
- Grote, M., Stumvoll, S., Reichelt, R., Lidholm, J., Rudolf, V. Identification of an allergen related to Phl p 4, a major timothy grass pollen allergen, in pollens, vegetables, and fruits by immunogold electron microscopy. Biol Chem. 383 (9), 1441-1445 (2002).
- Andersson, K., Lidholm, J. Characteristics and immunobiology of grass pollen allergens. Int Arch Allergy Immunol. 130 (2), 87-107 (2003).
- Tripodi, S. Molecular profiles of IgE to Phleum pratense in children with grass pollen allergy: implications for specific immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 129 (3), 834-839 (2012).
- Stumvoll, S., et al. Purification, structural and immunological characterization of a timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen Phl p 4, with cross-reactive potential. Biol Chem. 383 (9), 1383-1396 (2002).
- Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Ann Allergy Asthma Immunol. 99 (1), 34-41 (2007).
- Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (IgE) tests performed by different assay systems. J Allergy Clin Immunol. 121 (5), 1219-1224 (2008).
