Summary
Клетки нейронов мыши, культивируемые на многоэлектродных матрицах, проявляют увеличение ответа после электрической стимуляции. Этот протокол демонстрирует, как культивировать нейроны, как записывать активность, и как установить протокол для обучения сетей, чтобы реагировать на модели стимуляции.
Abstract
Микроэлектродные массивы (MEA) могут использоваться для исследования токсичности лекарственных средств, конструктивных парадигм для персонализированной медицины нового поколения и изучения динамики сети в культурах нейронов. В отличие от более традиционных методов, таких как фиксация патчей, которые могут записывать активность только из одной ячейки, МЭС могут одновременно выполнять запись с нескольких сайтов в сети, не требуя сложной задачи размещения каждого электрода в отдельности. Более того, многочисленные конфигурации управления и стимуляции могут быть легко применены в одной и той же экспериментальной установке, что позволяет исследовать широкий диапазон динамики. Одной из ключевых динамик интереса к этим исследованиям in vitro было то, насколько культурные сети проявляют свойства, указывающие на обучение. Клетки нейронов мыши, культивируемые на МЭС, проявляют увеличение ответа после тренировки, вызванной электрической стимуляцией. Этот протокол демонстрирует, как культивировать нейронные клетки на МЭС; Успешно реШнур из более чем 95% покрытых блюд; Разработать протокол для обучения сетей в ответ на модели стимуляции; И сортировать, строить график и интерпретировать результаты таких экспериментов. Показана возможность использования запатентованной системы для стимуляции и регистрации нейронных культур. Программные пакеты также используются для сортировки нейронов. Пользовательский графический интерфейс пользователя используется для визуализации постиндустриальных гистограмм времени, интервалов между пакетами и длительности всплесков, а также для сравнения клеточного ответа на стимуляцию до и после протокола обучения. Наконец, обсуждаются репрезентативные результаты и будущие направления этого исследования.
Introduction
Микроэлектродные массивы (MEAs) могут использоваться для исследования токсичности лекарственных средств, конструктивных парадигм для персонализированной медицины нового поколения и исследования динамики сети в культурах нейронов 1 . В отличие от более традиционных методов, таких как фиксация патчей, которые могут регистрировать активность только из одной клетки, или полевая запись со стеклянной пипеткой, которая может регистрировать внеклеточные ответы от нейронов, окружающих электрод, в одном месте - МЭС могут одновременно Запись с нескольких сайтов в культуре клеток, не требуя трудной задачи размещения каждого электрода в отдельности. Это позволяет изучать динамические взаимодействия между группами клеток, которые образуют сеть внутри этой культуры. Кроме того, эффекты электрической стимуляции на схемах сетевого зажигания 2 , 3 , 4 , 5 и управление сетью 6 </ Sup> в культурах нейронов хорошо документированы, и многочисленные конфигурации электростимуляции и контроля могут быть легко применены в рамках одной и той же экспериментальной установки, что позволяет исследовать широкий диапазон пространственно-временной динамики.
Одна из ключевых динамик интереса к этим исследованиям in vitro заключалась в том, насколько культурные сети проявляют свойства, указывающие на обучение 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Лаборатория Peixoto ранее изучала эффекты высокочастотных обучающих сигналов, как описано в Ruaro et al. 14 , в сетях мышиных нейронов, нанесенных на микроэлектродные массивы 15 . В этих экспериментах сети демонстрировали увеличение числа повторных ответовВызванное электростимуляцией. Повышенный ответ рассматривался как форма обучения через распознавание стимула, посредством чего сети последовательно реагировали на изменение стимула после применения специального протокола стимуляции ( то есть тренировки).
Этот протокол демонстрирует, как культивировать нейронные клетки на МЭС, успешно регистрировать из более чем 95% покрытых блюд, создать протокол для обучения сетей, чтобы реагировать на модели стимуляции, сортировать отдельные единицы активности, строить гистограммы и интерпретировать результаты из Такие эксперименты. Продемонстрирована возможность использования собственной системы (см. Таблицу материалов ) для стимуляции и регистрации нейронных культур, а также применения пакетов программного обеспечения (см. Таблицу материалов ) для сортировки нейронных единиц. Пользовательский графический интерфейс пользователя (см. Таблицу материалов ) используется для визуализации post-sВременные гистограммы времени, интервалы между пакетами и длительность пакета, а также сравнить клеточный ответ с стимуляцией до и после протокола обучения.
Protocol
Все процедуры по уходу за животными следуют рекомендациям NIH и / или Политике служб общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и находятся под одобренным институтом протоколом по уходу и использованию животных (IACUC) в Университете Джорджа Мейсона.
1. Подготовка материала
- Автоклавируйте следующие материалы: 5,75-дюймовые стеклянные пипетки, расположенные вертикально в (2) стаканах по 500 мл, приблизительно 24 части фильтровальной бумаги (диаметр 150 мм, каждый разрезают на 8 клиньев, размер пор не имеет значения), 1000 мкл фильтрованной пипетки Советы, 200 мкл фильтрованных наконечников пипеток, 10 мкл фильтрованных наконечников для пипеток и деионизированную (DI) воду для промывок (по меньшей мере 200 мл).
- Подготовьте реактивы и носители.
- Подготовьте все реагенты и среды в биоте с использованием асептических методов.
- Подготовьте поли-D-лизин (PDL) согласно таблице 1 .
- Смешайте PDL со стерильной водой DI до конечной c.Концентрация 50 мкг / мл, как изложено ниже. Используйте стерильную серологическую пипетку для переноса 96 мл стерильной дистиллированной воды в автоклавированную стеклянную бутыль с реагентом.
- Используйте стерильную серологическую пипетку, чтобы добавить 4 мл стерильной дистиллированной воды в флакон производителя, содержащий PDL. Растворите PDL с помощью пипетки. Используйте ту же пипетку, чтобы перенести раствор PDL в стеклянную колбу с реагентом, содержащую 96 мл стерильной дистиллированной воды.
- Закройте бутылку, прежде чем удалять ее из биоты и встряхивайте раствор. В биоте разделить раствор на аликвоты по 5 мл; Замораживать любой неиспользованный раствор при -20 ° C. Размороженный PDL можно повторно заморозить один раз. Отменить размороженный раствор, если он был повторно заморожен раньше.
- Приготовьте раствор ламинина в соответствии с таблицей 2 .
- Смешайте ламинин с PBS до конечной концентрации 20 мкг / мл, как изложено ниже. Используйте стерильную серологическую пипетку для переноса 49 мл PBS в 50 мл центрифужную пробирку.
- Используйте стерильную серологиюЛ пипеткой, чтобы добавить 1 мл PBS в пробирку производителя, содержащую соответствующий вес ламинина. Растворить ламинин пипетированием. Используйте ту же пипетку для переноса раствора ламинина в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 49 мл ЗФР.
- Закройте пробку, прежде чем вынимать ее из биоты и встряхивайте раствор. В биоте разделить раствор на 5 мл аликвоты; Замораживать любой неиспользованный раствор при -20 ° C. Талый ламинин нельзя повторно замораживать; Отменить любой неиспользованный раствор.
- Подготовьте носитель данных, как указано в таблице 3 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Среда хранения используется для хранения ткани в течение месяца при уровнях CO 2 окружающей среды. Его можно приобрести (см. Таблицу материалов) или его можно приготовить по общему рецепту: среда для хранения СО 2 клеток + 2% бессывороточная добавка для культуры нервных клеток + 0,5 мМ культуральная среда для клеток, которая содержит стабилизированный Форме L-глутамина (см. Таблицу материалов),- Чтобы сделать 10 мл среды для хранения, переносите 10 мл среды для хранения эмбриональной ткани без CaCl 2 в 15-мл центрифужную пробирку. Добавьте 210 мкл бессывороточной добавки для культуры нервных клеток и 55 мкл стабилизированной формы L-глутамина. Аккуратно перемешайте путем инверсии.
- Поскольку носитель данных является светочувствительным, защитите его, закрыв 15-мл центрифужные пробирки алюминиевой фольгой. Алиготе 2 мл среды для хранения на пробирку, всего 5 аликвот. Хранить в холодильнике до 2 недель или до готовности к использованию, но не замораживать.
- Подготовьте среду DMEM 5/5, как показано в таблице 4 .
- Аликвоты оттаивания бессывороточной добавки для культуры нервных клеток, сыворотки лошади (HS), фетальной бычьей сыворотки (FBS) и аскорбиновой кислоты. Разморозьте аликвоту pen-strep, если необходимо, чтобы контролировать бактериальное загрязнение. Внесите каждый ингредиент в пробирку для центрифугирования объемом 50 мл. Убедитесь, что наконечники пипеток не касаются каких-либо поверхностей или предметовц.
- Внутри биоты подсоедините фильтр к вакуумной трубке, пока вакуум еще не отключился. Вылейте смесь в верхнюю часть фильтра и закройте ее. Включите вакуум в биоте и дайте среднему фильтру опуститься на дно контейнера. Перед отключением вакуума отключите фильтр от вакуума.
- Затяните крышку контейнера для стерильной среды, нанесите на нее этикетку и сохраните неиспользуемую среду при температуре 4 ° C на срок до одного месяца. Откройте контейнер внутри биоты, чтобы сохранить среду стерильной.
- Подготовьте среду DMEM +, как показано в таблице 5 .
- Оттепель аликвоты бессывороточной добавки для культуры нервных клеток и аскорбиновой кислоты (и pen-strep, если необходимо). Внесите каждый ингредиент в пробирку для центрифугирования объемом 50 мл. Повторите шаги 1.2.5.2-1.2.5.3 для оставшегося процесса.
2. Подготовка массива к тарелке
ПРИМЕЧАНИЕ. MEA, используемые в процедуре, представляют собой 60-канальные массивы oRganized в 8 х 8 квадратных. Межэлектродное расстояние составляет 200 мкм, и каждый электрод имеет диаметр 10 мкм. Проводящим материалом для дорожек является титан, а сами электроды изготовлены из TiN. Стекло вокруг электродов имеет высоту 6 мм с наружным диаметром 24 мм. Крышка, изготовленная из полиоксиметилена (POM), используется для покрытия MEA, а газопроницаемая / непроницаемая для жидкости фторированная этилен-пропиленовая пленка (FEP) используется для предотвращения загрязнения во время сеансов регистрации и стимуляции.
- За день до покрытия.
- Сделать неиспользованные МЭС гидрофильными, подвергая их воздействию плазмы; Это обычно не требуется после первого использования. Убедитесь, что покровные стекла, используемые для контрольных культур, также получают плазменную обработку.
ПРИМЕЧАНИЕ. Пластиковые чашки Петри (35 мм) также могут использоваться в качестве контрольных чашек и не нуждаются в предварительной обработке.- Администрирование плазменной обработки с использованием плазменного гранулятора в течение 40-60 с при половинной мощности (50 Вт), wiЕ. Давление в камере должно быть 100-150 мТл.
- Незамедлительно заполните МЭС водой с ДИ. Погрузите покровные стекла в чашку Петри, наполненную водой DI. Оставьте воду DI в контакте с обработанными поверхностями в течение приблизительно 15 минут.
- Внутри биоты всасывайте воду DI. Заполните MEAs до краев 70% этанолом. Удалите воду DI из чашки Петри, содержащей покровные стекла, и заполните чашку Петри этанолом, пока покровные стекла полностью не погрузятся в воду. Дайте этому посидеть 10-15 минут.
- Пометьте все чашки Петри и блюда для контроля с идентификатором MEA ID #, датой операции, типом клетки и инициалами. Затем поместите каждое МЭА в его маркированное блюдо Петри.
- Поместите МЭС в отдельные чашки Петри и удалите этанол с помощью вакуумного отсоса. Заполните MEAs стерильной водой DI, чтобы удалить остаточный этанол. Для удаления дистиллированной воды используйте вакуумный отсос. Пусть МЭС воздушно-сухие внутри биотии.
- Добавить 40-70 мкл 50 мкг / мл поли-D-лизинаE (PDL; высокая молекулярная масса, по меньшей мере 50 кДа) в центр каждого МЕА и 0,2 мл для контроля с использованием стерильных наконечников пипеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не прикасайтесь к центру МЭА пипеткой, так как это может повредить электроды. Точное количество распределяемого PDL зависит от гидрофильности поверхности. - Поместите небольшой кусочек лабораторной салфетки в каждое блюдо и намочите его стерильной водой, чтобы избежать испарения PDL в течение ночи. Закройте все блюда, прежде чем удалять их из биоты. Поместите блюда в инкубатор при 37 ° C на ночь.
- Сделать неиспользованные МЭС гидрофильными, подвергая их воздействию плазмы; Это обычно не требуется после первого использования. Убедитесь, что покровные стекла, используемые для контрольных культур, также получают плазменную обработку.
- Плакировка день.
- В день посева оттаивают 1 аликвоту ламинина (20 мкг / мл); Для каждого МЕА требуется 40-50 мкл ламинина, и для каждой контрольной чашки требуется 0,2 мл ламинина. Вычислите необходимый объем ламинина исходя из количества используемых МЭС и контролей.
- Передайте все блюда из инкубатора в биоту.
- Заполнить все МПС стерильнымDI используя стерильную серологическую пипетку и дайте им посидеть 10-15 минут. Аспирируйте дистиллированную воду, используя стерильные пипетки Пастера, и повторите процедуру дважды.
- Добавьте 40-50 мкл талого ламинина в центр каждого МЕА и 0,2 мл ламинина к контрольным планшетам, используя стерильные наконечники пипеток. Покройте все МЭС и контрольные чашки в биоте и передайте их в инкубатор при 37 ° C в течение 1 часа.
- Аккуратно удалите лишний ламинин из центра МЭС с помощью всасывания стерильными пипетками Пастера и дайте поверхности высохнуть на воздухе перед нанесением покрытия.
- Оставьте блюда в биоте или поместите их в инкубатор, пока не будете готовы к тарелке клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Блюда могут оставаться в инкубаторе до следующего дня. Однако, если требуется больше времени, рекомендуется очистить чашки и начать с этапа поли-D-лизина (этап 2.1.6).
3. Удаление эмбрионов и мозгэкстракция
- Налейте среду L-15 (лейбовица) в 4 из 100-миллиметровых чашек Петри. Покройте их и поместите в морозильник -20 ° C до тех пор, пока среда не станет мягкой консистенции, но не будет замороженной (~ 40-60 мин).
- Делайте это примерно за 40 минут до 1 часа до вскрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ. Это быстро охладит эмбрионы и мозг, так что они будут иметь твердую консистенцию и не дезинтегрироваться после экстракции. - Подготовьте область вскрытия для удаления эмбрионов.
- Поместите поднос со льдом рядом с раковиной и выложите хирургические инструменты и материалы для удаления эмбрионов. Они включают в себя 4 чашки Петри с холодной слякотью L-15, бумажные полотенца, распылитель с 70% -ным этанолом, пинцеты с тупыми носами, тонкие щипцы, небольшие хирургические ножницы и большие ножницы ( рис. 1 ).
- Подготовьте область рассечения для извлечения мозга.
- Поставьте стеклянную чашку Петри faCe вниз в подносе, полном льда.
- Разложите хирургические инструменты и материалы для извлечения мозга, включая бумажные полотенца, маленькие хирургические ножницы, тонкую двустенную лопатку, баллон с распылителем, заполненный 70% -ным этанолом, и пластиковый пакет для утилизации туши ( рис. 2 ).
- Наденьте лабораторный халат, маску и перчатки. Распылите все рабочие поверхности, включая перчатки, 70% -ным этанолом.
ПРИМЕЧАНИЕ. Хотя это не стерильная процедура, лучше всего максимально снизить вероятность загрязнения. - Euthanize мыши E-timed-беременная E17, следуя руководящим принципам NIH 16 и / или Политике служб общественного здравоохранения о гуманном уходе и использовании лабораторных животных и в соответствии с одобренным учреждением протоколом ухода и использования животных (IACUC) для удушения CO 2 . Не забудьте медленно выпускать газ CO 2 в камеру в течение 3 - 5 минут, чтобы избежать вызывать панику или дискотекуМфорт в мышь.
- Обезглавьте мышь и поместите ее на бумажное полотенце, брюшную сторону вверх. Спрей его нижней части живота с 70% этанола. Используя маленькие хирургические ножницы, сделайте V-образный разрез кожи и подкожного жира нижней части живота, протягивая разрез на дистальные концы грудной полости и обнажая матку.
- С помощью щипцов осторожно поднимите матку между эмбрионами. Отрежьте соединительную ткань рассекающими ножницами, пока вся матка не станет свободной. Коротко ополосните матку 70% этанолом, чтобы удалить любую кровь и поместите ее в одну из 4 чашек Петри, наполненных холодной L-15.
- Освободите каждый эмбрион от матки и внутреннего эмбрионального мешка с помощью пары тонких наконечников. Убедитесь, что пуповина была разорвана и плацентарный мешок удален. Поместите освобожденных эмбрионов во второе блюдо, полное холода L-15. Обезглавьте эмбрионы щипцами и ножницами. Используя щипцы, перенесите головы на третью чашку Петри и телаК четвертому, оба полны холодной L-15.
4. Удаление лобной коры
- В биотии поместите клин автоклавной фильтровальной бумаги на охлажденный стакан чашки Петри. Поместите одну головку эмбриона на фильтровальную бумагу. Захватите череп, поместив пару пинцет через окулярные полости с недоминирующей рукой. Удалите кожу и основные мышечные ткани с помощью пары ножниц с ирисовой диафрагмой.
- Поместите режущую кромку нижней части ножниц диафрагмы в основание черепа. Хранение нижней части на внутренней поверхности черепа, в стороне от мозга, прорезается через затылочную пластину, а затем по средней линии между теменными пластинами. Продолжайте резать рострально между хрящевыми лобными пластинками черепа.
- Начиная с середины затылочной пластинки, сделайте перпендикулярный разрез слева и справа от среза центра.
- Удалите мозг, аккуратно сдвинув небольшой шпатель между вентральной поверхностьюГоловного мозга и нижних пластинок черепа, пока он полностью не находится под мозгом. Поднимите шпатель вверх; Весь мозг выйдет неповрежденным.
- Поместите несколько капель среды L-15 на фильтровальную бумагу, чтобы мозг не прилипал к бумаге и осторожно сдвиньте мозг со шпателя на фильтровальную бумагу, вентральную сторону вниз. Тщательно отрежьте обонятельную луковицу кончиком шпателя.
- Используя чистый шпатель, рассекайте лобную долю по трапецеидальному рисунку. Перенесите ткань в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую среду для хранения. Повторите вышеуказанные действия с оставшимися эмбрионами. Обязательно используйте свежий клин фильтровальной бумаги каждый раз ( т.е. один клин фильтровальной бумаги на головку).
5. Диссоциация клеток
- В биотии соберите элементы, перечисленные в таблице 6 .
- Используйте стерильную серологическую пипетку для добавления 5 мл DMEM + в пробирку с папаином; Нагретый DMEM + можно использовать для лучшего растворения папаина. осторожноПипеткой для смешивания раствора.
- Используйте стерильную микропипетку, чтобы добавить 0,5 мл DMEM + во флакон с ДНКазой. Избегайте сильных пипетирования при принятии раствора ДНКазы, потому что ДНКаза чувствительна к денатурации сдвига.
- Переместите 2,5 мл раствора папаина в стерильную пробирку центрифуги и добавьте 125 мкл ДНКазы в ту же пробирку. Смешайте раствор, осторожно переворачивая пробирку с центрифугой в колпачке приблизительно 8 раз.
- Используя стерильную пипетку с широким отверстием, удалите ткань из трубки, содержащей среду для хранения, и поместите ее в стерильную 35-мм чашку Петри. Соберите как можно меньше среды. Используйте стерильную пипетку, чтобы удалить как можно больше избыточной среды для хранения, не удаляя ткань. Ткань не должна плавать в среде, но она должна быть влажной.
- Используйте две стерильные лезвия скальпеля для измельчения ткани. Используйте стерильную серологическую пипетку, чтобы добавить 2.5 мл смеси ДНКазы / папаина к рубленой ткани в чашке Петри. Осторожно закрутите чашку Петри, чтобы убедиться, что тШляпа, вся ткань свободна в растворе и не прилипает к основанию чашки. Поместите блюдо в инкубатор 37 ° C в течение 15 минут.
- В биотии используйте стерильную пипетку с широким отверстием для переноса всех сред и тканей в стерильную криогенную трубку объемом 5 мл. Поместите наконечник той же пипетки с широким отверстием, расположенную ближе к нижней части трубки. Аккуратно растирайте, медленно пипетируя в течение 10-15 раз.
- Избегайте образования пузырьков во время пипетирования. Повторите процедуру с помощью пипетки с небольшим отверстием, пока не будет достигнута гомогенная смесь. Если ткань не диссоциирована, растирайте ее, используя 1000 мкл пипетки.
- Добавьте 2 мл нагретой DMEM 5/5 к смеси диссоциированных клеток. Закройте пробирку для центрифугирования, пока она еще находится в биоте. Аккуратно перемешайте путем инверсии. Центрифуга приблизительно при 573 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре (20-25 ° С).
- В биотии используйте стерильную серологическую пипетку для удаления и удаления всего супернатанта, не нарушаягранулы. Используйте стерильную пипетку, чтобы добавить 1 мл нагретой DMEM 5/5 в таблетку в пробирку, чтобы повторно суспендировать клетки. Используйте стерильную переносящую пипетку с небольшим отверстием, чтобы разбить гранулу, осторожно запивая пипеткой вверх и вниз, пока смесь не станет однородной.
ПРИМЕЧАНИЕ. Избегайте образования пузырьков во время пипетирования. Если было собрано очень мало ткани, добавьте только 0,5 мл DMEM 5/5. - Внутри биоты используйте стерильную пипетку для переноса 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку. Вне биоты добавьте 10 мкл трипанового синего к 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот этап не требует стерильности. - Загрузите 10 мкл суспензии клеток Трипанового синего в одноразовый чип гемоцитометра для подсчета клеток.
6. Покрытие клеток
- В биотии используйте стерильную микропипетку, чтобы перенести 50 мкл клеточной суспензии в центр каждого массива и каждую контрольную чашку Петри. Использовать один пиPette tip на блюдо. Убедитесь, что ячейки расположены точно в центре массива. Повторно смачивайте лабораторную папиросную бумагу, которая была в чашке со стерильной водой, или поместите новую салфетку в каждое блюдо. Закройте посуду.
- Поместите покрытые чашки Петри в инкубатор, установленный на 37 ° C и 10% CO 2 в течение 3-4 часов.
- В биоте, аккуратно добавьте 1 мл нагретого DMEM 5/5 к каждому MEA.
ПРИМЕЧАНИЕ. Избегайте отмывания ячеек от центра массива при добавлении носителя (важно!). Очень осторожно, используйте стерильную микропипетку, чтобы добавить по одной капле за один раз вокруг внутренних краев. - Поместите колпачок, содержащий газопроницаемую мембрану FEP, на каждый MEA. Верните их в инкубатор на два дня.
ПРИМЕЧАНИЕ. Крышка предотвращает загрязнение и испарение. Следуйте асептической технике, просушивая колпачки в биоте с 100% этанолом, прежде чем положить их в MEA. Культуры должны быть ограничены в рамках биопородности и должны оставаться увенчанными всегда.
7. ГлавнаяКультивирования
- Через два дня выполните полную замену среды прогретым DMEM +.
- Передавайте только несколько блюд из инкубатора в биоту в то время, чтобы не слишком нагружать культуры.
- Используйте стерильную микропипетку объемом 1 мл, чтобы вытащить всю среду из чашки, аккуратно положив кончик пипетки на внутреннюю стенку чашки, избегая прикосновения к ячейкам в центре. Во избежание распространения загрязнения используйте только один наконечник пипетки.
- Используйте стерильную микропипетку для дозировки 1 мл теплого DMEM +, осторожно поместив кончик пипетки на внутреннюю стенку чашки.
- Выполните 50% средних изменений с подогретым DMEM +, как описано выше, 2-3 раза в неделю и не более 4 дней между кормлениями.
- Используйте стерильную микропипетку 1 мл, чтобы вытянуть 500 мкл среды из чашки. Используйте стерильную микропипетку для дозирования 500 мкл теплого DMEM +. </ Li>
8. Визуальные осмотры и запись
- Осмотрите образцы посуды через день под микроскопом, чтобы найти клеточное покрытие по массиву (с увеличением 4X и 10X) и загрязнение (с использованием 20-кратного увеличения), либо бактериальное, либо грибковое.
ПРИМЕЧАНИЕ. На рисунке 3a показан пример оптимального покрытия ячейки, тогда как на рис. 3b показана культура с плохими плотностями клеток. - Через две недели после посева, проверьте образец посуды МЕА на спонтанную активность. Запишите из MEAs, как описано ниже, в течение 3-5 минут. Спайки будут обнаружены, если активность присутствует ( рисунок 4 ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Экспериментатор должен определить, когда следует начинать тестирование, исходя из типа исследуемого эксперимента и гипотезы.- Для записи активности в MEA используйте следующее оборудование: источник питания, усилитель, headstage / preamplifier, Регулятор температуры и генератор стимуляции (см. Таблицу материалов и рисунок 5 ).
- Перед тем, как вынуть культуры из инкубатора, подключите регулятор температуры и включите систему, включив питание (в соответствии с инструкциями производителя), чтобы нагретая базовая пластина предусилителя достигла 35 ° C.
- Поместите культивированную культуру в предусилитель так, чтобы черная линия в MEA хорошо выровнялась с опорным основанием. Убедитесь, что контакты предварительного усилителя выровнены, что верхняя часть предусилителя закреплена, и что колпачок культуры все еще включен.
- После того, как культура помещена в планшет, снимите флажок «Изменить MEA» на программном обеспечении сбора данных (см. Таблицу материалов для названий программ и руководств пользователя). Кроме того, снимите флажок «Blanking» перед выполнением любых записей.
- Выберите «Загрузить» в «MEA_Select» после tКультура помещается в систему. Перед продолжением убедитесь, что программа показывает «Загрузить OK».
- Нажмите «Пуск» в программной среде, чтобы начать визуализацию сигналов. В главном окне выберите «Спайки» → «Обнаружение» → «Автоматически», измените значение «Стандартное отклонение» на «5» и нажмите «Обновить», чтобы сбросить пороговое значение.
ПРИМЕЧАНИЕ. В окне «Шипы» показаны всплески, которые прошли порог. - В главном окне выберите «Диктофон» → «Диктофон» → «Обзор». Измените путь и имя файла, чтобы определить дату, время, блюдо и эксперимент. Установите лимит времени ( например, до 5 минут). Нажмите «Стоп», «Запись» и «Воспроизведение». Обратите внимание: запись останавливается автоматически.
- Откройте программу стимуляции. Выберите «Recorder» → «Recorder» → «Browse», чтобы создать файл и установить timE limit. Нажмите «Остановить», «Запись» и «Воспроизвести», чтобы начать запись. Нажмите «Download and Start» (на программе стимуляции) для стимуляции, которая будет доставлена на блюдо.
- Выберите кнопку «Change MEA» в программном управлении, чтобы менять посуду.
ПРИМЕЧАНИЕ. Нельзя выносить культуру из инкубатора более 30 минут за один раз без системы для поддержания атмосферы CO 2 вокруг культуры. Если требуется больше сеансов записи, используйте коммерчески доступный адаптер для подачи CO 2 .
9. Учебные сети
ПРИМЕЧАНИЕ. На рисунке 6 представлен обзор шагов 9.1-9.3, описанных ниже.
- Запишите 5-минутный базис спонтанной активности из клеточной культуры (как описано в шаге 8). После того, как базовый уровень был установлен, назначьте 5-минутную предварительную стимуляцию зондирования, состоящую из двухфазного 0,5 ГцИмпульс с длительностью импульса 200 мкс и амплитудой импульса 900 мВ ( рис. 7а ) через выбранные электроды стимуляции, как показано на рисунке 8 (см. Руководство по программному обеспечению в таблице материалов для деталей по выбору электродов для стимуляции).
- По завершении предпродажной стимуляции, администрируйте «обучающий» протокол к сетям, используя те же электроды, что и при стимуляции зондированием. Поставляйте высокочастотные поезда один раз каждые 2 с, как описано в Hamilton et al. 15 ( фиг.7b и фиг.7c ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Обучающий сигнал состоит из 40 импульсных цепей. Каждая последовательность импульсов состоит из 100 двухфазных импульсов с 4 мс между импульсами, длительностью 200 мкс и амплитудой импульса в 900 мВ. - После завершения периода обучения, провести 5-минутную стимуляцию после тренировки в клетках,Идентична предварительной стимуляции тренировки. После окончания стимуляции после тренировки запишите 5 минут спонтанной активности после стимуляции из сети (как описано в шаге 8).
- Используйте отдельную контрольную группу МЭС для учета возможных изменений в реакции сети из-за естественных колебаний или нестационарности системы. Администрирование того же экспериментального протокола, описанного выше, к тем контрольным группам, за исключением того, что контрольные группы получают фиктивный тренировочный период, в котором нет фактического обучающего сигнала.
10. Анализ данных
Примечание. Файлы данных сохраняются, а затем сортируются в нейронные единицы, используя запатентованное программное обеспечение для сортировки (см. Таблицу материалов). Пользовательский графический интерфейс пользователя (GUI) используется для загрузки единиц и анализа моделей активности в культурах, интервалах между пакетами, продолжительности всплеска и гистограмме времени постимулирования (PSTH) (см. Таблицу материалов). PSTH являетсяНаиболее важный график для анализа, так как он отображает активность сети в размерах бина (переменной длины), таким образом обеспечивая визуальное представление отклика сети на представленную стимуляцию.
- Преобразуйте файлы данных .mcd в формат .plx с помощью специального программного обеспечения для сортировки (см. Таблицу материалов для названий программ и руководств пользователя). Экспортируйте файл .plx в новый .plx-файл в той же программе. Отсортируйте каналы в нейронные единицы ( Рисунок 9 ). После завершения сортировки экспортируйте данные в виде файла .nex.
- Откройте файл .nex в соответствующем программном обеспечении (см. Таблицу материалов ) и сохраните его как .mat-файл для анализа с помощью пользовательского GUI, который доступен для свободного использования (см. Таблицу материалов ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Графический интерфейс пользователя (см. Таблицу материалов) отображает PSTH в соответствии с пользовательским вводом ( то есть, популяция PSTH, смещение среднего PSTH или индивидуальный канал PSTH), что позволяет получить обзор эксперимента по стимуляции и непосредственного сравнения между файлами после и перед стимулами. Он также отображает начальные и конечные PSTH, которые сравнивают сетевой ответ с первым 6 и с последними 6 стимулами. Графический интерфейс выполняет несколько других функций, таких как скорость спайка, интервал между спайками, всплески на пакет, интервал между пакетами и длительность пакета, как для файлов стимуляции, так и для файлов со спонтанной активностью. - Сначала выберите файл .mat с переменными, содержащими пики шпилек, и одну переменную, содержащую артефакт стимуляции; Скрипт проанализирует данные, а главный графический интерфейс отобразится со средним графиком PSTH справа ( рисунок 10 ).
- Нажмите на кнопки с активным электродом, чтобы увидеть индивидуальный PSTH (синий) по сравнению со средним PSTH (красным).
ПРИМЕЧАНИЕ. Активные электроды будут окрашены, чтобы показать карту высокой температуры, где более высокие значения (более красные)Пиковые значения PSTH, что указывает на более сильный ответ на стимуляцию. - Выберите параметр анализа, используя всплывающее меню. Выберите кнопку «Biased Average» для выбора подмножества электродов и построения среднего значения этого подмножества; Это полезно для сравнения поведения подсетей в пределах культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ. Во всплывающем меню выбрано несколько различных параметров анализа, и все они описаны в кнопке «Справка» в программном обеспечении. - Нажмите кнопку «Сохранить график», чтобы сохранить отображаемый в данный момент график в виде JPEG-файла с высоким разрешением. Нажмите кнопку «Таблица данных», чтобы экспортировать данные в электронную таблицу.
- Нажмите на кнопки с активным электродом, чтобы увидеть индивидуальный PSTH (синий) по сравнению со средним PSTH (красным).
Representative Results
Используя методику, представленную здесь ( рис. 11 ) , 60-канальные МЭА, покрытые клетками нейрональной мыши Е17, инкубировали до тех пор, пока культуры не покрыли массивы здоровым слоем клеток ( рис. 12 и рис. 3а ) . После 3 недель инкубации при 10% CO 2 и 37 ° C культуры проверяли на спонтанную активность, используя коммерческую регистрирующую систему (см. Таблицу материалов ). Во время процедуры регистрации температуру поддерживали на уровне 37 ° С с использованием регулятора температуры, так как температура влияет на активность нейронов и скорость обжига.
Тестирование активности
Спонтанно активные сети обычно демонстрируют различные шаблоны сигналов. Средняя активная культура может регистрировать активность вОколо 40% электродов. Из этих активных участков электродов почти половина регистрирует спонтанные сигналы, причем скорость обжига составляет от 5 до 10 Гц. На рис. 4а показан репрезентативный растровый график спонтанной активности. Эти отметки обозначают временные метки потенциалов действия, записанные от 9 активных электродов в течение 20 с, с частотой регистрации 25 кГц и диапазоном полосового фильтра между 300 Гц и 3 кГц. На рисунке 4b показаны базовый шум и отфильтрованный необлученный сигнал в течение 8 всплесков активности перед процедурой сортировки. Чтобы отделить потенциалы действия от шума, пороговые значения для каждого канала устанавливаются в 5 раз больше стандартного отклонения базового шума и рассчитываются в окне 500 мс 15 .
Перед анализом зарегистрированные пики для каждого электрода сортировались в автономном режиме, чтобы различать физиоЛогической активности и артефактов стимуляции с использованием алгоритма k-средних и анализа компонентов. Сигналы, которые были идентифицированы как физиологические ответы, были сгруппированы вместе для создания популяционной реакции у каждого электрода ( рис. 13 и рисунок 9 ) 15 .
Обучение нейронных сетей с электрической стимуляцией
Сети обучались с использованием электрической стимуляции, применяемой к культуре непосредственно через электроды MEA, используя генератор стимулов (см. Таблицу материалов). В этом наборе репрезентативных результатов использовалась конфигурация «L», состоящая из 13 электродов ( фиг. 8 ), хотя могут быть использованы многие другие конфигурации. Пробуждение и тренировка были основаны на параметрах, определенных в Руаро и др. 14 .
Первоначально исходный уровень был установлен путем записи 5 минут спонтанной активности перед стимуляцией. После установления базовой линии через выбранные места стимуляции ( т. Е. «L») вводили стимуляцию через 5 мин перед тренировкой, состоящую из двухфазного импульса 0,5 Гц с длительностью импульса 200 мкс и амплитудой импульса 900 мВ ( рисунок 7а ) -образный). Затем в сети каждые 2 с вводили протокол обучения с использованием одного и того же набора электродов. Обучающий сигнал состоял из 40 последовательных импульсов, каждый из которых содержал 100 двухфазных импульсов с периодом между импульсами 4 мс, длительностью импульса 200 мкс и амплитудой импульса в 900 мВ ( фиг.7b и фиг.7c). Затем этот тренировочный период сопровождался 5-минутным этапом после тренировки, аналогичным стимуляции перед тренировкой. Протокол был тогдаЗавершилась 5-минутной регистрацией спонтанной активности после стимуляции.
Тот же экспериментальный протокол был применен к контрольной группе культур для учета естественных флуктуаций сетевого ответа. Единственное различие в протоколе управления, однако, заключалось в применении фиктивного тренировочного периода, в течение которого не вводился фактический обучающий сигнал.
Статистический анализ наборов данных ( т. Е. Обучение против контроля) проводился с использованием одностороннего дисперсионного анализа с переменной «обучение» в качестве межфакторного фактора. Латентность использовалась в качестве субъектного фактора. Если обнаружено существенное взаимодействие, была выполнена post-hoc процедура Tukey. Результаты показали предварительный ответ в течение 20 мс после стимула, хотя диапазон активности был непоследовательным после первого ответа. Однако послеучебная деятельность проявлялась не только Ответ в течение первых 20 мс постстимуляций, что наблюдалось во время предварительной подготовки, но также проявлял значительную активность через 30-50 мс после стимула ( рис. 14 и рис. 15 ) 15 . Была также статистически значимая корреляция между частотой «спайка» и «временем после стимула» и «достоверностью спайка» по сравнению с «временем после стимула». «Надежность спайка» может быть определена как вероятность увидеть ответ сети на стимуляцию, где отклику на каждый стимул назначается максимальное значение 1. На рисунке 16 показано почти 50% -ное увеличение частоты спайка, а также 30 -50% увеличение надежности спайка для обученных сетей по сравнению с контролем в диапазоне 20-50 мс после стимула. Эти результаты говорят о том, что обучение фундаментально изменило динамику сети.
1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/>
Рисунок 1 : Инструменты и материалы, используемые для удаления эмбрионов. ( A ) Заполненный льдом лоток. ( B ) Чашки Петри, наполненные холодной L-15 "слякотью". ( C ) Бумажное полотенце. ( D ) Баллон для распыления с 70% этанолом. ( E ) Тонкие щипцы (x2). ( F ) Маленькие хирургические ножницы. ( G ) Пинцеты с тупыми носами. ( H ) Большие ножницы. ( I ) Сумка для тела. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Инструменты и материалы, используемые для экстракции мозга. ( A B ) чашку Петри, содержащую головки эмбриона. ( C ) Пробирка с центрифугой с фольгой и носителем для хранения. ( D ) Перевернутая стеклянная чашка Петри. ( E ) Автоклавная фильтровальная бумага. ( F ) с 70% этанолом. ( G ) Пластиковая пипетка. ( H ) ножницы Ирис. ( I ) Тонкие пинцеты. ( J ) Тонкий двойного шпателя. ( K ) Бумажное полотенце. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 : Оптимальные и не оптимальные культуры. ( A ) показывает здоровый ковер клеток, покрывающих массивы, в отличие от ( B ),В которых наблюдается слабая пролиферация клеток. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рис. 4 : Представительские результаты спонтанной активности. ( A ) Репрезентативный растровый график спонтанной активности. Эти отметки указывают потенциалы действия, зарегистрированные с 9 активных электродов в течение 20 с-окном при скорости регистрации 25 кГц и диапазоне полосового фильтра между 3 кГц и 300 Гц. ( B ) Представитель отфильтровал потенциал внеклеточного действия от активного сайта. Рисунок изменен из ссылки 15 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версиюП этой цифры.
Рисунок 5 : Настройка записи. ( A ) Генератор стимуляции. ( B ) Регулятор температуры. ( C ) Электропитание. ( D ) Усилитель. ( E ) Headstage / preamplifier. ( F ) Capped MEA. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6 : Схематическое представление электрического обучающего протокола. Запишите исходный базис в течение 5 мин и стимуляцию зонда в течение 3 мин. Применять тетанические стимуляторы На 90 секунд, что не записывается. Применяют и регистрируют вторую стимуляцию зонда в течение 3 мин и конечную базовую линию в течение 5 мин. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7 : Параметры стимуляции и тренировки зондирования. ( A ) стимуляция зондирования состоит из двухфазных импульсов ± 900 мВ, вводимых с частотой 0,5 Гц. ( B ) Импульсные поезда состоят из 100, ± 900 мВ двухфазных импульсов с частотой 250 Гц. ( C ) Обучающий сигнал состоит из 40 импульсов, вводимых каждые 2 с. Рисунок изменен из ссылки 15 ."_blank"> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8 : Представление конфигурации формы «L». Квадраты представляют отдельные электроды из МЭС. Синие квадраты указывают электроды, используемые для стимуляции, тогда как все остальные используются для записи. Рисунок изменен из ссылки 15 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9 : Отличительные единицы от артефактов шума и стимуляции. Несколько верхних панелей ( A -
Рисунок 10 : Гистограмма постиндустриального времени (PSTH). Графический интерфейс пользователя (см. Таблицу материалов ) отображает PSTH в соответствии с пользовательским вводом ( то есть, популяция PSTH, смещенный средний PSTH или отдельныйКанал PSTH), что позволяет получить обзор эксперимента по стимуляции и для непосредственного сравнения между файлами пост-и пред-стимулов. Он также отображает начальную и конечную PSTH; Это сравнивает ответ сети на первые 6 и последние 6 стимулов. Графический интерфейс выполняет несколько других функций, таких как скорость спайка, интервал между спайками, всплески на пакет, интервал между пакетами и длительность пакета, как для файлов стимуляции, так и для файлов со спонтанной активностью. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11 : Обзор подготовки и покрытия клеток. ( A ) Беременную мышь E17 эвтаназируют CO 2 . ( B ) Мышь обезглавленаEd и матка удаляется. ( C ) Эмбрионы высвобождаются и обезглавливаются. ( D ) мозг извлекается из каждого эмбриона и лобные доли удаляются. ( E ) Клетки диссоциируют. ( F ) Диссоциированные клетки суспендируют в среде. ( G ) Подвешенные ячейки помещают на 60-канальные многоэлектродные массивы (MEAs). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 12 : Нейронные культуры, нанесенные на микроэлектродные массивы. Эмбриональные мышиные нейроны высевают на 60-канальные МЭА, что позволяет одновременно регистрировать нейронную активность по сети от каждого электрода. (Рисунок измененИз ссылки 15 ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 13 : Программа сортировки, используемая для сортировки осциллограмм с каждого канала. Программа сортировки (см. Таблицу материалов ) загружает файл данных и отображает все единицы, первоначально полученные для каждого канала. Один из нескольких способов выбирается для назначения сигналов конкретным устройствам. В этом примере был выбран алгоритм кластеризации k-средних, и была идентифицирована желтая единица (обозначенная как «единица a» в нижнем окне). Другая программа (см. Таблицу материалов ) затем используется для экспорта файла .nex в файл .mat, который является входным файлом для пользовательского GUI (см.
Рисунок 14 : Измененная сетевая активность в ответ на стимуляцию после тренировочного периода. Типовой растровый график активности от восьми электродов. Красная вертикальная линия указывает время стимула, а черные галочки обозначают потенциалы действия. В предварительном обучении ( A ), есть непосредственная реакция на импульс стимула по каналам. В пост-тренинге ( В ) сеть проявляет более продолжительный ответ активности, а также немедленный ответ на стимуляцию 15 ..jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 15 : Обученные сети имеют значительно измененные частоты спайка. Частоту распространения сети для управляющих сетей рассчитывают путем интегрирования числа всплесков через 50 мс сразу после каждой стимуляции и деления на этот период. Показано среднее число 12 подготовленных и 10 контрольных сетей (погрешности показывают стандартную ошибку среднего значения). Звездочка (*) указывает статистическую разницу ( p-значение <0,05) между двумя наборами данных. Рисунок изменен из ссылки 15 . Нажмите здесь, чтобы посмотреть larВерсии этого рисунка.
Рисунок 16 : Синаптично-опосредованные ответы значительно изменены в обученных сетях. ( A ) Надежность пика, измеренная в ячейках 10 мс и нормированная на сети управления, не показывает изменений для непосредственной активации нейронов вблизи электродов (0-20 мс). Следовательно, нет статистической разницы между элементами управления и обученными сетями для этих бункеров. С другой стороны, ответы с большей задержкой (30-50 мс) синаптично опосредуются, указывая, что этот метод обеспечивает более детальное исследование надежности, чем на рисунке 15 , выше. ( B ) Частота всплеска популяции повторяет поведение надежности и не показывает изменений для прямой активации (0-20 мс), тогда как статДля долгосрочных ответов (30-50 мс) найдено статистически значимое различие. Это поведение согласуется с усредненными результатами в предыдущем рисунке 15 . Шкалы ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего значения, рассчитанную для 10 сетей управления и 12 подготовленных сетей. (*) P-значение <0,05; (**) p-значение <0,001. Рисунок изменен из ссылки 15 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Кол - во | Пункт |
| 1 | Бутылка с реактивом из автоклавного стекла (не менее 100 мл) |
| 20 | 15 мл стерильные центрифужные пробирки |
| 1 | 10 мл стерильной серологической пипетки |
| 4 | 25 мл стерильнойСерологическая пипетка |
| 2 | 50 мл стерильная серологическая пипетка |
| 1 | Стойка для трубки центрифуги |
| 150 мл | Стерильная дистиллированная вода |
| 5 мг | Поли-D-лизиновый флакон |
Таблица 1: Подготовка PDL - Список материалов и реагентов.
| Кол - во | Пункт |
| 1 | 50 мл стерильные центрифужные пробирки |
| 10 | 15 мл стерильные центрифужные пробирки |
| 2 | 1 мл стерильной серологической пипетки |
| 2 | 50 мл стерильная серологическая пипетка |
| 1 | Стойка для трубки центрифуги |
| 1 мл | ФосфатБуферный солевой раствор (PBS) |
| 1 мг | Laminin |
Таблица 2: Подготовка ламинина - список материалов и реагентов.
| Кол - во | Пункт |
| 1 | Бутылка с реактивом из автоклавного стекла (не менее 100 мл) |
| 20 | 15 мл стерильные центрифужные пробирки |
| 1 | 10 мл стерильной серологической пипетки |
| 4 | 25 мл стерильная серологическая пипетка |
| 2 | 50 мл стерильная серологическая пипетка |
| 1 | Стойка для трубки центрифуги |
| 150 мл | Стерильная дистиллированная вода |
| 5 мг | Поли-D-лизиновый флакон |
Таблица 3: Подготовка носителя информации - Список материалов и реагентов.
| Кол - во | Пункт |
| 44 мл | DMEM с стабилизированной формой L-глутамина (см. Таблицу материалов) |
| 1 мл | Бессывороточная добавка для культуры нервных клеток (см. Таблицу материалов) |
| 2,5 мл | Лошадиная сыворотка |
| 100 мкл | Аскорбиновая кислота [4 мг / мл] |
| 2,5 мл | Фетальная бычья сыворотка (FBS) |
| 0,5 мл | Pen strep (опционально) |
| 1 | 50 мл стерильные центрифужные пробирки |
| 2 | 25 мл стерильная серологическая пипетка |
| 2 | 10 мл стерильной серологической пипетки </ TD> |
| 2 | 1 мл стерильной серологической пипетки |
| 1 | 250 мл фильтр |
Таблица 4: Подготовка среды DMEM 5/5 - Список материалов и реагентов.
| Кол - во | Пункт |
| 49 мл | DMEM с стабилизированной формой L-глутамина (см. Таблицу материалов) |
| 1 мл | Бессывороточная добавка для культуры нервных клеток (см. Таблицу материалов) |
| 100 мкл | Аскорбиновая кислота [4 мг / мл] |
| 0,5 мл | Pen strep (опционально) |
| 1 | 50 мл стерильные центрифужные пробирки |
| 2 | 25 мл стерильная серологическая пипетка |
| 2 | 1 мл стерильной серологической пипетки |
| 1 | 250 мл фильтр |
Таблица 5: Подготовка среды DMEM + - список материалов и реагентов.
| Кол - во | Пункт |
| 1 | Папаин 140 U / флакон |
| 1 | Dnase 1,260 U / vial |
| 7 мл | DMEM + (охлажденный) |
| 5 мл | DMEM 5/5 (нагретый) |
| 10 мкл | Трипановый синий |
| 2 | Лезвия скальпеля |
| 1 | 35-мм стерильная чашка Петри |
| 4 | 15 мл стерильные центрифужные пробирки |
| 2 | 5 мл стерильных криогенных пробирок |
| 2 | 2 мл стерильных криогенных пробирок |
| 1 | 50 мл стерильные центрифужные пробирки |
| 1 | Микроцентрифужная трубка |
| 2 | Пипетка с большим отверстием |
| 3 | Пипетка с маленьким отверстием |
| 5 | 2 мл стерильной серологической пипетки |
| 5 | 1 мл стерильной серологической пипетки |
| 2 | 10 μL стерильные наконечники микропипетки |
| 1 | 1000 мкл стерильных наконечников микропипетки |
| 1 | Чип для гемоцитометра |
Таблица 6: Диссоциация клеток - список материалов и реагентов.
Discussion
Шаги, изложенные в этом протоколе, предоставляют достаточно подробные сведения для новичка, чтобы он мог размещать свои собственные культуры нейронов на МЭС и записывать сетевую активность. Этот протокол поможет гарантировать, что культуры прилипают должным образом, образуя слой ковра клеток над электродными решетками, и остаются здоровыми и не загрязняющими в течение нескольких месяцев.
Хотя лучше всего придерживаться всех частей протокола, на протяжении всего процесса есть шаги, которые имеют решающее значение для успешного результата. Использование асептической техники на протяжении всего процесса является обязательным условием для предотвращения заражения культур. Новые МПС должны быть сделаны гидрофильными, как описано в протоколе, иначе это приведет к плохой клеточной адгезии. Избегая резкой пипетирования и образования пузырьков воздуха во время диссоциации, вы уменьшите количество поврежденных клеток и получите более высокий и более здоровый урожай. Переключение с DMEM 5/5 на DMEM + после первогоКормление также важно. DMEM 5/5 содержит лошадиную сыворотку, которая заставит глиальные клетки доминировать в культуре при непрерывном использовании и приведет к низкой активности нейронов, хотя культуры будут выглядеть здоровыми 17 . Кормление культур по расписанию и поддержание их в надлежащих условиях инкубации также имеет решающее значение.
Покрытие клеточных культур на МЭС включает в себя много переменных, которые могут привести к результатам, которые не являются оптимальными. Хотя цель - идеальный «ковер» ячеек, отказ от упомянутых выше критических шагов приведет к плохому созреванию клеток или загрязнению. Плохая клеточная адгезия, которая отличается от плохой созревания клеток, также вызывает беспокойство. Это может быть вызвано несколькими факторами, в том числе плохой подготовкой МЭА перед нанесением покрытий или использованием старой среды. Если старая среда, содержащая стабилизированную форму L-глутамина и бессывороточную добавку для культуры нервных клеток (см. Таблицу материалов), Клетки первоначально придерживаются, но затем уплывают примерно через две недели. Если бактериальная контаминация является постоянной проблемой, к среде можно добавить антибиотик, такой как ампициллин или пен-стреп. Есть также фунгициды, доступные для лечения грибкового загрязнения. Это некоторые из наиболее распространенных переменных, которые могут повлиять на результаты культур. Есть много других, которые будут встречаться только после времени и опыта.
По сравнению с использованием стеклянных микроэлектродов этот метод отлично подходит для изучения динамики сети и фармакологических реакций. Это позволяет использовать множество различных пространственно-временных шаблонов стимуляции и позволяет регистрировать реакции нейронов сразу из нескольких областей. Предыдущие группы продемонстрировали интересные результаты, используя протоколы, аналогичные описанным здесь 18 . Поскольку культуры сохраняются в течение недель или месяцев и могут быть повторно использованы одни и те же культуры, этот метод также являетсяLlows для нескольких экспериментов с течением времени в одной и той же сети.
Тем не менее, существуют ограничения в этом методе. МПС являются неинвазивными. Поэтому они могут регистрировать внеклеточную активность, в отличие от фиксации патчей или внутриклеточной записи с помощью пипеток. Более того, поскольку каждый электрод в массиве покрыт несколькими ячейками, невозможно разрешить активность одного нейрона. И наоборот, поскольку они являются культурами in vitro , они не могут полностью воспроизвести структурные свойства сетей в головном мозге. Кроме того, активность может регистрироваться только в течение менее 30 мин за один раз, без какого-либо механизма, обеспечивающего атмосферу СО 2, чтобы клетки сохраняли свой рН-баланс.
После того, как этот метод освоен, можно изучить фармакологические манипуляции с электрической стимуляцией или без нее. Новые протоколы для исследования обучения и формирования памяти в нейронных сетях также могут быть спроектированы и протестированы вместе с pРотоки для сетей гиппокампа или спинного мозга. Ранее были опубликованы протоколы для стимулирования и обучения сетей, некоторые из которых были дополнительно развиты в протоколы in vivo , такие как «селективная адаптация», предложенная Eytan et al. 19 . Были протестированы несколько протоколов. Однако только результаты модификации процедуры столбняка, предложенной Руаро в 2005 году, представлены здесь 14 , 20 .
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась грантом Национального научного фонда CMMI-1300007. Мы хотели бы поблагодарить предыдущих членов лаборатории, которые помогли в разработке этих протоколов и поддержании культуры на протяжении более пяти лет в Университете Джорджа Мейсона: д-р Джозеф Дж. Панкрацио, д-р Хамид Чарккар, д-р Гретхен Кнаак , Д-ром Францем Гамильтоном, Майклом Макерой и Робертом Грэмом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4 mg/mL aliquots |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
| Beakers - glass - 100 mL | VWR | 13912-160 | |
| Beakers - glass - 500 mL | VWR | 10754-956 | |
| Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
| Cryogenic vial - sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Cryogenic vial - sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
| DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
| DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
| Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
| Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
| GlutaMAX -- I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
| Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
| Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
| Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
| MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
| MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
| MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
| MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
| MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
| MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
| Media storage bottle - glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
| Micropipette tips - 10 μL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
| Micropipette tips - 1,000 μL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
| Micropipette tips - 200 μL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
| Micropipetter - 10 μL | Thermo Fisher | 4641170N | |
| Micropipetter - 1,000 μL | Thermo Fisher | 4641210N | |
| Micropipetter - 200 μL | Thermo Fisher | 4641230N | |
| Papain - 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
| Petri dishes -100 mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes -100 mm glass | VWR | 10754-788 | |
| Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| Phosphate buffer saline (PBS) (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
| Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
| Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
| Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
| Scissors - iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
| Scissors - large | World Precision Instruments | 14214 | |
| Scissors - small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
| Serological pipette - sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
| Serological pipette - sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Serological pipette - sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
| Serological pipette - sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
| Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
| Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
| Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
| Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
| Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
| Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
| Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
| Spatula - small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
| Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
| Transfer pipette - large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
| Transfer pipette - small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
| Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |
References
- Charkhkar, H., Frewin, C., et al. Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing. Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).
- Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development. Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).
- Fröhlich, F., McCormick, D. A. Endogenous electric fields may guide neocortical network activity. Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C.
- Ozen, S., Sirota, A., et al. Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats. J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).
- Shahaf, G., Marom, S.
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Marom, S., Eytan, D. Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons. Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors. Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays. Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S.
- le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons. PloS one. 5 (1), 8871 (2010).
- Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures. IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).
- Hamilton, F., Graham, R., et al. Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation. PloS one. 10 (11), 0142399 (2015).
- Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf (2016).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells: Business Source. , MIT Press. Cambridge. (1998).
- Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array. J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).
- Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons. J. Neurosci. 23 (28), (2003).
- Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. Statistical properties of information processing in neuronal networks. Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).
