خلايا الخلايا العصبية الماوس مثقف على صفائف متعدد القطب عرض زيادة في الاستجابة التالية التحفيز الكهربائي. يوضح هذا البروتوكول كيفية زراعة الخلايا العصبية، وكيفية تسجيل النشاط، وكيفية إنشاء بروتوكول لتدريب الشبكات للرد على أنماط التحفيز.
ويمكن استخدام صفائف الإلكترودات الدقيقة (مياس) للتحقيق في سمية الدواء، ونماذج تصميم الجيل التالي من الطب الشخصي، ودراسة ديناميات الشبكة في الثقافات العصبية. وعلى النقيض من الأساليب التقليدية الأخرى، مثل التصحيح اللقطي، الذي لا يسجل سوى نشاط خلية واحدة، يمكن للاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف أن تسجل في وقت واحد من مواقع متعددة في الشبكة، دون الحاجة إلى المهمة الشاقة المتمثلة في وضع كل قطب على حدة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق العديد من تكوينات التحكم والتحفيز بسهولة في نفس الإعداد التجريبي، مما يسمح لمجموعة واسعة من الديناميات التي سيتم استكشافها. واحدة من الديناميات الرئيسية للاهتمام في هذه الدراسات في المختبر هو مدى عرض الشبكات المستزرعة خصائص تدل على التعلم. خلايا الخلايا العصبية الماوس المستزرعة على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تظهر زيادة في الاستجابة بعد التدريب الناجم عن التحفيز الكهربائي. يوضح هذا البروتوكول كيفية زراعة الخلايا العصبية على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. بنجاحالحبل من أكثر من 95٪ من الأطباق مطلي. ووضع بروتوكول لتدريب الشبكات على الاستجابة لأنماط التحفيز؛ والفرز، والمؤامرة، وتفسير النتائج من هذه التجارب. ويتجلى استخدام نظام الملكية لتحفيز وتسجيل الثقافات العصبية. وتستخدم حزم البرمجيات أيضا لفرز وحدات الخلايا العصبية. يتم استخدام واجهة المستخدم الرسومية المصممة خصيصا لتصور الرسوم البيانية وقت ما بعد التحفيز، فترات بين انفجر، ومدة انفجار، وكذلك لمقارنة الاستجابة الخلوية للتحفيز قبل وبعد بروتوكول التدريب. وأخيرا، نوقشت النتائج التمثيلية والتوجهات المستقبلية لهذا الجهد البحثي.
الصفائف الدقيقة القطب (مياس) يمكن استخدامها للتحقيق في سمية المخدرات، وتصميم نماذج للجيل القادم من الطب شخصية، ودراسة ديناميات الشبكة في الثقافات العصبية 1 . على النقيض من الأساليب التقليدية أكثر مثل التصحيح لقط، والتي يمكن أن تسجل فقط النشاط من خلية واحدة، أو تسجيل الحقل مع ماصة الزجاج، والتي يمكن أن تسجل ردود خارج الخلية من الخلايا العصبية المحيطة القطب في موقع واحد يمكن لل مياس في وقت واحد سجل من مواقع متعددة في ثقافة الخلية دون الحاجة إلى مهمة شاقة وضع كل قطب على حدة. وهذا يسمح لدراسة التفاعلات الديناميكية بين مجموعات من الخلايا التي تشكل شبكة داخل تلك الثقافة. وعلاوة على ذلك، فإن آثار التحفيز الكهربائي على أنماط اطلاق الشبكة 2 ، 3 ، 4 ، 5 ومراقبة الشبكة 6 </ سوب> في الثقافات العصبية تم توثيقها بشكل جيد، والعديد من تكوينات التحفيز الكهربائي والضوابط يمكن تطبيقها بسهولة في نفس الإعداد التجريبي، مما يسمح لمجموعة واسعة من الديناميات المكانية والزمانية إلى استكشافها.
واحدة من الديناميات الرئيسية للاهتمام في هذه الدراسات في المختبر وقد تم عرض مدى الشبكات المستزرعة عرض خصائص تدل على التعلم 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 . فحص بيكسوتو مختبر سابقا آثار إشارات التدريب عالية التردد، كما هو موضح في رورو وآخرون. 14 ، على شبكات من الخلايا العصبية الماوس مطلي على صفائف ميكرولكترود 15 . في هذه التجارب، أظهرت الشبكات زيادة في استجابة المتابعةز التدريب الناجم عن التحفيز الكهربائي. واعتبرت زيادة الاستجابة شكلا من أشكال التعلم عن طريق الاعتراف التحفيز، حيث استجابت الشبكات بطريقة متسقة لتغيير في التحفيز بعد تطبيق بروتوكول التحفيز ( أي التدريب) محددة.
يوضح هذا البروتوكول كيفية زراعة الخلايا العصبية على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، وسجل بنجاح من أكثر من 95٪ من الأطباق مطلي، وإنشاء بروتوكول لتدريب الشبكات للرد على أنماط التحفيز، نوع النشاط وحدة واحدة، رسم بياني مؤامرة، وتفسير النتائج من مثل هذه التجارب. ويظهر استخدام نظام الملكية (انظر جدول المواد ) لتحفيز وتسجيل الثقافات العصبية، فضلا عن تطبيق حزم البرمجيات (انظر جدول المواد ) لفرز وحدات الخلايا العصبية. يتم استخدام واجهة مستخدم رسومية مصممة خصيصا (انظر جدول المواد ) لتصور ما بعد الصورةالوقت الرسم البياني الوقت، فترات بين انفجر، ومدة انفجار، وكذلك لمقارنة الاستجابة الخلوية للتحفيز قبل وبعد بروتوكول التدريب.
الخطوات المبينة في هذا البروتوكول توفر تفاصيل كافية للمبتدئين لوحة له / لها الثقافات الخلايا العصبية الخاصة على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف وسجل نشاط الشبكة. وهذا البروتوكول يساعد على ضمان أن الثقافات تلتزم بشكل صحيح، وتشكيل طبقة السجاد من الخلايا على صفائف القطب، وتبقى صحية والملوثة خالية لعدة أشهر.
على الرغم من أنه من الأفضل أن تلتزم جميع أجزاء البروتوكول، وهناك خطوات في جميع مراحل العملية التي تعتبر حاسمة في النتيجة الناجحة. استخدام تقنية العقيم طوال العملية برمتها أمر حتمي لمنع الثقافات من أن تصبح ملوثة. يجب أن تكون الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف جديدة ماء، كما هو موضح في البروتوكول، وإلا سوء التصاق الخلية سيؤدي. تجنب بيبتينغ قاسية وتشكيل فقاعات الهواء خلال التفكك سوف يقلل من عدد الخلايا التالفة مطلي وسوف يؤدي إلى عائد أعلى وأكثر صحة. التبديل من دمم 5/5 إلى دمم + بعد أولالتغذية هي أيضا مهمة. دمم 5/5 يحتوي على مصل الحصان، الأمر الذي سيسبب الخلايا الدبقية للسيطرة على الثقافة إذا ما استخدمت بشكل مستمر، وسوف يؤدي إلى ضعف نشاط الخلايا العصبية، على الرغم من أن الثقافات سوف تظهر صحية 17 . تغذية الثقافات كما كان مقررا وحفظها في ظروف احتضان المناسبة أمر بالغ الأهمية أيضا.
طلاء الثقافات الخلية على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ينطوي على العديد من المتغيرات التي يمكن أن تؤدي إلى نتائج أقل من الأمثل. على الرغم من أن الهدف هو "السجاد" الكمال من الخلايا، والفشل في معالجة الخطوات الحاسمة المذكورة أعلاه يؤدي إلى ضعف نضج الخلايا أو في التلوث. ضعف التصاق الخلايا، والذي يختلف عن ضعف نضج الخلايا، هو أيضا مصدر قلق. يمكن أن يكون سبب ذلك عدة عوامل، بما في ذلك سوء إعداد ميي قبل الطلاء أو استخدام المتوسطة القديمة. إذا كان الوسيط القديم يحتوي على شكل مستقر من L- الجلوتامين والمكمل خالية من المصل لاستزراع الخلايا العصبية (انظر جدول المواد)، وتلتزم الخلايا في البداية ولكن ثم تطفو بعيدا بعد حوالي أسبوعين. إذا كان التلوث البكتيري هو مشكلة مستمرة، يمكن إضافة مضاد حيوي، مثل الأمبيسلين أو القلم، بكتيريا، إلى الوسط. وهناك أيضا مبيدات الفطريات المتاحة لعلاج التلوث الفطري. هذه هي بعض المتغيرات الأكثر شيوعا التي يمكن أن تؤثر على نتائج الثقافات. هناك العديد من الآخرين التي لن تواجه إلا بعد الوقت والخبرة.
بالمقارنة مع استخدام ميكرولترودس الزجاج، وهذه التقنية ممتازة لدراسة ديناميات الشبكة والاستجابات الدوائية. فإنه يتيح استخدام العديد من مختلف أنماط التحفيز المكاني والزماني ويسمح لتسجيل ردود الخلايا العصبية من مناطق متعددة في وقت واحد. وقد أظهرت المجموعات السابقة نتائج مثيرة للاهتمام باستخدام بروتوكولات مماثلة لتلك الموصوفة هنا 18 . منذ الثقافات تستمر لأسابيع أو أشهر، ويمكن إعادة استخدام نفس الثقافات، وهذه التقنية أيضا أيضاعف تجارب متعددة مع مرور الوقت على نفس الشبكة.
ومع ذلك، هناك قيود على هذه التقنية. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف غير الغازية. لذلك، فإنها يمكن أن تسجل فقط النشاط خارج الخلية، بدلا من التصحيح لقط أو تسجيل داخل الخلايا مع ماصات. وعلاوة على ذلك، لأن كل قطب في صفيف يتم تغطيتها من قبل عدة خلايا، فإنه ليس من الممكن حل نشاط الخلايا العصبية واحدة. على العكس من ذلك، لأن هذه هي في المختبر الثقافات، فإنها لا يمكن أن تتكاثر تماما الخصائص الهيكلية للشبكات في الدماغ. أيضا، يمكن تسجيل النشاط فقط لمدة أقل من 30 دقيقة في وقت واحد دون بعض آلية توفير جو كو 2 للخلايا للحفاظ على توازن درجة الحموضة.
وبمجرد أن يتقن هذه التقنية، يمكن استكشاف التلاعب الدوائية مع أو بدون التحفيز الكهربائي. ويمكن أيضا تصميم بروتوكولات جديدة للتحقيق في التعلم وتكوين الذاكرة في الشبكات العصبية واختبارها، جنبا إلى جنب مع صروتوكولز لشبكات الحصين أو الحبل الشوكي. وقد تم نشر بروتوكولات لتحفيز وتدريب الشبكات سابقا، وبعضها تم تطويرها في بروتوكولات في الجسم الحي ، مثل "التكيف الانتقائي" التي اقترحها إيتان وآخرون. 19- تم اختبار العديد من البروتوكولات. ومع ذلك، فقط نتائج من تعديل لإجراء الكزاز التي اقترحها رورو في عام 2005 وترد هنا 14 ، 20 .
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية منحة كمي-1300007. نود أن نعترف أعضاء المختبر السابق، الذين ساعدوا في تصميم هذه البروتوكولات ومع الحفاظ على الثقافات لأكثر من خمس سنوات في جامعة جورج ميسون: الدكتور جوزيف J. بانكرازيو، الدكتور حامد شرخار، الدكتور غريتشن كناك ، والدكتور فرانز هاميلتون، ومايكل ماكيرا، وروبرت غراهام.
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |