Summary
Muisneuronale cellen die op multi-elektrode arrays worden gekweekt, tonen een toename van de respons na elektrische stimulatie. Dit protocol demonstreert hoe u neuronen kunt cultiveren, hoe u activiteiten opneemt en hoe u een protocol kunt opstellen om de netwerken op te leiden om te reageren op stimuleringspatronen.
Abstract
Micro-elektrode arrays (MEA's) kunnen worden gebruikt om de toxiciteit van geneesmiddelen te onderzoeken, ontwerpparadigma's voor de volgende generatie gepersonaliseerde medicijnen te onderzoeken en de netwerkdynamiek in neuronale culturen te bestuderen. In tegenstelling tot meer traditionele methoden, zoals patch-klemmen, die alleen de activiteit van een enkele cel kunnen opnemen, kunnen MEA's tegelijkertijd op meerdere locaties in een netwerk opnemen, zonder dat het nodig is om elke elektrode afzonderlijk te plaatsen. Bovendien kunnen talrijke controle- en stimulatieconfiguraties gemakkelijk worden toegepast binnen dezelfde experimentele opstelling, waardoor een breed scala aan dynamieken kan worden onderzocht. Een van de belangrijkste dynamieken van belangstelling in deze in vitro studies is in hoeverre gekweekte netwerken eigenschappen aanwijzen die indicatief zijn voor het leren. Muis-neuronale cellen die op MEA's zijn gekweekt, tonen een toename van de respons na training die wordt geïnduceerd door elektrische stimulatie. Dit protocol demonstreert hoe u neuronale cellen op MEA's kunt cultiveren; Succesvol reKoord van meer dan 95% van de platte schotels; Een protocol opstellen om de netwerken op te leiden om te reageren op stimuleringspatronen; En sorteer, plot en interpreteer de resultaten van dergelijke experimenten. Het gebruik van een eigen systeem voor het stimuleren en registreren van neuronale culturen wordt aangetoond. Softwarepakketten worden ook gebruikt om neuroneenheden te sorteren. Een custom-designed grafische gebruikersinterface wordt gebruikt om post-stimulus tijd histogrammen, inter-burst intervallen en burst duration te visualiseren, evenals de cellulaire respons op stimulatie voor en na een trainingsprotocol te vergelijken. Tenslotte worden representatieve resultaten en toekomstige aanwijzingen van deze onderzoeksinspanning besproken.
Introduction
Micro-elektrode arrays (MEA's) kunnen worden gebruikt om de toxiciteit van geneesmiddelen te onderzoeken, ontwerpparadigma's voor de volgende generatie gepersonaliseerde medicijnen te onderzoeken en de netwerkdynamiek in neuronale culturen te bestuderen 1 . In tegenstelling tot meer traditionele methoden, zoals patch-klemmen, die alleen de activiteit van een enkele cel kunnen registreren of veldopname met een glaspipet, die extracellulaire reacties opneemt van de neuronen die de elektrode omringen op een enkele plaats, kunnen MEA tegelijkertijd Opnemen van meerdere plaatsen in een celcultuur zonder dat de moeilijke taak nodig is om elke elektrode afzonderlijk te plaatsen. Dit zorgt voor de studie van de dynamische interacties tussen groepen cellen die een netwerk vormen binnen die cultuur. Bovendien zijn de effecten van elektrische stimulatie op netwerkbrandpatronen 2 , 3 , 4 , 5 en netwerkcontrole 6 </ Sup> in neuronale culturen zijn goed gedocumenteerd en talrijke configuraties van elektrische stimulatie en controles kunnen gemakkelijk worden toegepast binnen dezelfde experimentele opstelling, waardoor een breed scala aan spatio-temporale dynamiek kan worden onderzocht.
Een van de belangrijkste dynamieken van belangstelling in deze in vitro studies is in hoeverre gekweekte netwerken eigenschappen tonen die indicatief zijn voor het leren van 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . De Peixoto Lab heeft eerder de effecten van hoogfrequente trainingssignalen onderzocht, zoals beschreven in Ruaro et al. 14 , op netwerken van muisneuronen geplateerd op micro-elektrode arrays 15 . In deze experimenten vertoonden netwerken een toename van de responsvolgordeG training geïnduceerd door elektrische stimulatie. De verhoogde respons werd beschouwd als een vorm van leren via stimulusherkenning, waarbij de netwerken op een consistente manier reageren op een verandering in stimulus na de toepassing van een specifiek stimulatieprogramma ( dat wil zeggen training).
Dit protocol demonstreert hoe u neuronale cellen op MEA's kunt cultiveren, succesvol opnemen van meer dan 95% van de platte schotels, een protocol opstellen om de netwerken op te leiden om stimuleringspatronen te reageren, de activiteit van een eenheid te plannen, histogrammen te plotten en de resultaten te interpreteren Dergelijke experimenten. Het gebruik van een eigen systeem (zie de Tabel van Materialen ) voor de stimulatie en opname van neuronale culturen wordt aangetoond, evenals de toepassing van softwarepakketten (zie de Tabel van Materialen ) om neuroneenheden te sorteren. Een custom-designed grafische gebruikersinterface (zie de tabel van materialen ) wordt gebruikt om post-s te visualiserenTimulus tijd histogrammen, inter-burst intervallen en burst duration, evenals het vergelijken van de cellulaire respons op stimulatie voor en na een trainingsprotocol.
Protocol
Alle dierprocedures volgen de NIH-richtlijnen en / of het beleid inzake de volksgezondheidszorg over de humane zorg en het gebruik van laboratoriumdieren en zijn onder een institutioneel goedgekeurd diergezondheids- en gebruiks protocol (IACUC) bij de George Mason University.
1. Materiaalvoorbereiding
- Autoclaaf de volgende materialen: 5.75 inch lange glaspipetten verticaal aangebracht in (2) 500 mL bekers, ongeveer 24 stuks filterpapier (150 mm diameter, elk gesneden in 8 wiggen, de poriegrootte maakt niet uit), 1000 μL gefiltreerde pipette Tips, 200 μL gefilterde pipette tips, 10 μL gefilterde pipet tips, en gedeïoniseerd (DI) water voor de was (tenminste 200 ml).
- Bereid de reagentia en media voor.
- Bereid alle reagentia en media in het bio-leven in met behulp van aseptische technieken.
- Bereid Poly-D-lysine (PDL) volgens tabel 1 op .
- Meng de PDL met steriel DI water tot een laatste cConcentratie van 50 μg / ml, als volgt. Gebruik een steriele serologische pipet om 96 ml steriel DI water over te brengen op een fles met een geautoclaveerde glasreagens.
- Gebruik een steriele serologische pipet om 4 ml steriel DI water toe te voegen aan de injectieflacon met PDL. Los de PDL op door te pipetteren. Gebruik dezelfde pipet om de PDL-oplossing over te brengen naar de glazen reagensfles die het 96 ml steriel DI-water bevat.
- Doe de fles stevig vast voordat u het uit de biohood verwijdert en de oplossing vortex. Verdeel in de biochemie de oplossing in 5 ml alikvoten; Een ongebruikte oplossing bevriezen bij -20 ° C. Ontdooide PDL kan een keer opnieuw worden bevroren. Ontdooide ontdooide oplossing indien opnieuw bevroren.
- Bereid de laminineoplossing volgens tabel 2 op .
- Meng het laminine met PBS tot een eindconcentratie van 20 μg / ml, als volgt. Gebruik een steriele serologische pipet om 49 ml PBS over te brengen naar een 50 ml centrifugebuis.
- Gebruik een steriele serologica1 pipet om 1 ml PBS toe te voegen aan het flesje van de fabrikant die het juiste gewicht van laminine bevat. Los het laminine op door pipettering. Gebruik dezelfde pipet om de lamininoplossing over te brengen op de 50 ml centrifugebuis die de 49 ml PBS bevat.
- Pak de buis stevig vast voordat u het uit het bio-lichaam verwijdert en de oplossing wervelt. Verdeel in de biochemie de oplossing in 5 ml porties; Een ongebruikte oplossing bevriezen bij -20 ° C. Ontdooid laminine kan niet opnieuw worden bevroren; Weggooien eventuele ongebruikte ontdooide oplossing.
- Bereid opslagmedium op, zoals in tabel 3 .
OPMERKING: Opslagmedium wordt gebruikt voor het opslaan van weefsel voor maximaal een maand bij omgevingstemperaturen van CO 2 . Het kan worden gekocht (zie de tabel van materialen) of het kan worden bereid met behulp van het algemene recept van: omgevings-CO 2 cel opslagmedium + 2% serumvrij supplement voor neurale celkweek + 0,5 mM celcultuurmedium dat een gestabiliseerde Vorm van L-glutamine (zie de tabel van materialen).- Om 10 ml opslagmedium te maken, overbrengen 10 ml opslagmedium voor embryonale weefsel zonder CaCl2 naar een 15 ml centrifugebuis. Voeg 210 μL serumvrij supplement toe voor neurale celkweek en 55 μl van een gestabiliseerde vorm van L-glutamine. Meng zachtjes door inversie.
- Aangezien het opslagmedium lichtgevoelig is, bescherm het door de 15 ml-centrifuge buizen te bedekken met aluminiumfolie. Aliquot 2 ml opslagmedium per buis voor in totaal 5 aliquots. Bewaar in de koelkast gedurende maximaal 2 weken of tot het klaar is voor gebruik, maar niet vries.
- Bereid DMEM 5/5 medium, zoals bij Tabel 4 .
- Doe proefjes van serumvrij supplement voor neurale celkweek, paardserum (HS), foetaal runder serum (FBS) en ascorbinezuur. Doe een aliquot van pen-streep, indien nodig, om bacteriële besmetting te beheersen. Pipet elk ingrediënt in een 50 ml centrifugebuis. Zorg ervoor dat de pipet tips geen oppervlakken of objecten rakents.
- Bind het filter in de vacuümbuis in het biohood met het vacuüm nog steeds uit. Giet het mengsel in de filtertop en sluit het. Zet het vacuüm in de biohood in en laat het mediumfilter naar de bodem van de container. Haal het filter uit het vacuüm uit voordat u het vacuüm uitzet.
- Draai de deksel aan op de steriele mediumcontainer, label het en houd een ongebruikte medium op tot 4 ° C gedurende maximaal een maand. Open de container in het biohood om het medium steriel te houden.
- Bereid DMEM + medium op, zoals in tabel 5 .
- Doe proefjes van serumvrij supplement voor neurale celcultuur en ascorbinezuur (en penstrip, indien nodig). Pipet elk ingrediënt in een 50 ml centrifugebuis. Herhaal stappen 1.2.5.2-1.2.5.3 voor het resterende proces.
2. Array / Schotel Voorbereiding
OPMERKING: De MEA's die in de procedure worden gebruikt zijn 60-kanaals arrays oIn een 8 x 8 vierkant De interelektrodeafstand is 200 μm, en elke elektrode is 10 μm in diameter. Het geleidende materiaal voor de sporen is titanium, en de elektroden zelf zijn gemaakt van TiN. De glasring rond de elektroden is 6 mm hoog, met een buitenste diameter van 24 mm. Een cap gemaakt van polyoxymethyleen (POM) wordt gebruikt om het MEA te bedekken, en een gasdoorlaatbare / vloeistof-impermeabele gefluoreerde ethyleenpropyleenfilm (FEP) wordt gebruikt om verontreiniging tijdens opname- en stimulatiesessies te voorkomen.
- De dag voor het platen.
- Maak niet-gebruikte MEA's hydrofiel door bloot te stellen aan plasma; Dit is meestal niet nodig na het eerste gebruik. Zorg ervoor dat glazen deklagen die gebruikt worden voor controleculturen ook een plasmabehandeling ontvangen.
OPMERKING: Plastic Petri-schotels (35 mm) kunnen ook worden gebruikt als besturingsschotels en hebben geen voorbehandeling nodig.- Beheer de plasmabehandeling met behulp van een plasma etcher voor 40-60 s bij halfvermogen (50 W), wiDe kamerdruk is ingesteld op 100-150 mT.
- Vul de MEA onmiddellijk met DI water. Onderdompel de dekglazen in een Petri-schaal, gevuld met DI water. Laat het DI water in ongeveer 15 minuten in contact komen met behandelde oppervlakken.
- Zuig het DI water in het bio-leven uit. Vul de MEA's op de rand met 70% ethanol. Verwijder het DI-water uit de Petri-schotel die de dekglazen bevat en vul de Petri-schaal met ethanol tot de dekglazen volledig ondergedompeld zijn. Laat dit 10-15 minuten zitten.
- Benoem alle Petri-schotels en besturingsschotels met de MEA ID #, datum van operatie, celtype en initialen. Plaats vervolgens elke MEA in zijn label Petri-schotel.
- Plaats de MEA's in individuele Petrischalen en verwijder de ethanol met behulp van vacuümzuiging. Vul de MEA's met steriel DI water om eventuele resterende ethanol te verwijderen. Gebruik vacuümzuigers om het DI water te verwijderen. Laat de MEA's luchtdrogen in het bio-leven.
- Voeg 40-70 μl 50 μg / ml poly-D-lysine toeE (PDL, hoog molecuulgewicht, tenminste 50 kDa) naar het midden van elk MEA en 0,2 ml aan controles met behulp van steriele pipettips.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het middelpunt van het MEA niet met de pipet raakt, tip omdat dit de elektroden kan beschadigen. De exacte hoeveelheid PDL afgegeven hangt af van de hydrofiliciteit van het oppervlak. - Leg een klein stukje laboratoriumpapier in elk gerecht en nat het met steriel water om de PDL-verdamping overnacht te vermijden. Bedek alle gerechten voordat ze verwijderd worden uit de biohood. Plaats de afwas in een incubator bij 37 ° C overnacht.
- Maak niet-gebruikte MEA's hydrofiel door bloot te stellen aan plasma; Dit is meestal niet nodig na het eerste gebruik. Zorg ervoor dat glazen deklagen die gebruikt worden voor controleculturen ook een plasmabehandeling ontvangen.
- Plating dag.
- Op de plating dag ontdooien 1 aliquot van laminine (20 μg / ml); Elke MEA vereist 40-50 μL laminine, en elke controle schotel vereist 0,2 ml laminine. Bereken het benodigde volume van laminin op basis van het aantal MEA's en controles die u wilt gebruiken.
- Breng alle gerechten van de incubator naar de biohood over.
- Vul alle MEA's steriel inDI water met een steriele serologische pipet en laat ze 10 tot 15 minuten zitten. Aspirate het DI water met behulp van steriele Pasteur pipetten en herhaal het proces tweemaal.
- Voeg 40 - 50 μL ontdooid laminine toe aan het midden van elke MEA en 0,2 ml laminine aan de bedieningsplaten met behulp van steriele pipetpunten. Bedek alle MEA's en de besturingsschotels in het bio-leven en verplaats ze gedurende 1 uur aan een incubator bij 37 ° C.
- Verwijder het overtollige laminine voorzichtig uit het midden van de MEA met behulp van zuigsel met steriele Pasteurpipetten en laat het oppervlak luchtdrogen voordat het wordt geplateerd.
- Laat de afwas in de biohood, of plaats ze in een broeikas totdat ze klaar zijn om de cellen te platen.
OPMERKING: De gerechten kunnen tot de volgende dag in de incubator blijven. Echter, als er meer tijd nodig is, is het raadzaam om de afwas te reinigen en opnieuw te beginnen met de stap van poly-D-lysine (PDL) (stap 2.1.6).
3. Verwijdering van embryo en hersenenExtraction
- Giet L-15 (Leibovitz) medium in 4 van de 100 mm Petrischalen. Bedek ze en plaats ze in een -20 ° C diepvriezer tot het medium een slibige consistentie heeft maar niet vast wordt bevroren (~ 40-60 min).
- Doe dit ongeveer 40 minuten tot 1 uur voor dissectie.
OPMERKING: Dit zal de embryo's en de hersenen snel afkoelen, zodat ze een stevige consistentie hebben en niet ontdoen bij extractie. - Bereid het dissectiegebied voor het verwijderen van embryo uit.
- Plaats een bak met ijs bij een gootsteen en leg de chirurgische instrumenten en materialen uit voor het verwijderen van embryo's. Deze omvatten 4 Petrischalen met koude L-15 'snuisterij', papieren handdoeken, een spuitfles met 70% ethanol, duizelig duimtang, fijne tang, kleine chirurgische schaar en grote schaar ( figuur 1 ).
- Bereid het dissectiegebied voor hersenwinning voor.
- Leg een glas petrischaal faStop in een bak vol ijs.
- Leg de chirurgische instrumenten en materialen voor hersenwinning uit, met inbegrip van papieren handdoeken, kleine chirurgische scharen, een dunne dubbele spatel, een spuitfles met 70% ethanol en een plastic zak voor de verwijdering van het karkas ( Figuur 2 ).
- Zet een lab coat, een facemask en handschoenen aan. Spuit alle werkoppervlakken, inclusief de handschoenen, met 70% ethanol.
OPMERKING: Hoewel dit niet een steriele procedure is, is het het beste om de kans op verontreiniging zoveel mogelijk te verminderen. - Euthanize een E17 timed-pregnant mouse volgens de NIH-richtlijnen 16 en / of het beleid van de volksgezondheidszorg over de humane zorg en het gebruik van laboratoriumdieren en in een institutioneel goedgekeurd protocol voor dierverzorging en gebruik (IACUC) voor CO 2 -vergiftiging. Zorg ervoor dat het CO 2 -gas langzaam binnen 3 tot 5 minuten lang in de kamer komt om paniek of disco te voorkomenMfort in de muis.
- Decapiteer de muis en plaats deze op een papieren handdoek, ventrale zijde omhoog. Spuit zijn onderbuik met 70% ethanol. Met behulp van de kleine chirurgische schaar maakt u een V-vormige snede door de huid en het subcutane vet van de onderbuik, waardoor u de snede naar de distale uiteinden van de thoracale holte uitbreidt en de baarmoeder blootlegt.
- Met behulp van tang, lig de baarmoeder zorgvuldig tussen de embryo's. Knip het bindweefsel weg met dissectieschaar totdat het hele baarmoeder vrij is. Spoel de baarmoeder kortom met 70% ethanol om bloed te verwijderen en plaats in een van de 4 Petri-vaatjes, gevuld met koude L-15.
- Laat elk embryo uit de baarmoeder en het binnenembryonische zak los met behulp van een paar fijngespelde tang. Zorg ervoor dat het navelstreng is gescheiden en de placenta heeft verwijderd. Plaats de bevroren embryo's in de tweede schotel vol koude L-15. Decapiteer de embryo's met pincet en een schaar. Met behulp van tang, de kop overbrengen naar een derde Petri schotel en de lichamenTot een vierde, beide vol koude L-15.
4. Verwijdering van de frontale cortex
- Plaats in een biohood een wig autoklaaffilterpapier op het petri-schotelstadium van gekoelde glas. Plaats een enkele embryo kop op het filterpapier. Grijp de schedel door een paar tangjes door de oogholten te plaatsen met de niet-dominante hand. Verwijder de huid en onderliggende spierweefsel met een paar iris scharen.
- Plaats de snijrand van de onderste zijde van de iris schaar in de basis van de schedel. Door de oksipitale plaat en langs de middellijn tussen de pariëtische platen te houden, houd je de onderste zijde tegen het binnenvlak van de schedel, weg van de hersenen. Ga verder met rostralen, tussen de kraakbeenplaten.
- Begin in het midden van de occipitale plaat, maak een loodrecht snede aan de linkerkant en aan de rechterkant van het middelste snede.
- Verwijder de hersenen door voorzichtig een kleine spatel tussen het ventrale oppervlak te schuivenVan de hersenen en de onderste schedelplaten totdat het helemaal onder de hersenen is. Til de spatel op; Het hele brein komt intact uit.
- Plaats een paar druppels L-15 medium op het filterpapier zodat de hersenen niet aan het papier vallen en de hersenen voorzichtig van de spatel naar het filterpapier, ventrale zijde naar beneden glijden. Snijd de olfactieve gloeilamp zorgvuldig af met de punt van de spatel.
- Ontleed de frontale lob in een trapeziumpatroon met behulp van een schone spatel. Breng het weefsel over naar een 15 ml centrifugebuis die opslagmedium bevat. Herhaal het bovenstaande met de overige embryo's. Zorg ervoor dat u elke keer een nieuwe wig filterpapier gebruikt ( dwz een wig filterpapier per kop).
5. Cell Dissociation
- In de biohood assembleer de items die in tabel 6 zijn vermeld .
- Gebruik een steriele serologische pipet om 5 ml DMEM + toe te voegen aan een flesje papain; Verwarmde DMEM + kan gebruikt worden om de papain beter op te lossen. VoorzichtigPipet om de oplossing te mengen.
- Gebruik een steriele micropipet om 0,5 ml DMEM + toe te voegen aan een injectieflacon DNase. Vermijd krachtige pipettering tijdens het maken van de DNase-oplossing, omdat DNase gevoelig is voor scherpe denaturatie.
- Breng 2,5 ml papainoplossing over op een steriele centrifugebuis en voeg 125 μL van de DNase aan dezelfde buis toe. Meng de oplossing door de bedekte centrifugebuis voorzichtig om 8 keer te omkeren.
- Verwijder het weefsel uit het buishoudende opslagmedium met een steriele, brede boorpijp en plaats het in een steriele, 35 mm Petri-schotel. Verzamel zo weinig mogelijk medium. Gebruik een steriele pipet om zoveel mogelijk overtollig opslagmedium te verwijderen zonder het weefsel te verwijderen. Het weefsel mag niet in het medium zweven, maar het moet vochtig zijn.
- Gebruik twee steriele scalpelbladen om het weefsel te maagden. Gebruik een steriele serologische pipet om 2,5 ml van het DNase / papain mengsel aan het gehaktweefsel in de Petri-schotel toe te voegen. Zweel de Petri-schaal voorzichtig om te voorkomen dat tHoed alle weefsels zijn vrij in de oplossing en niet aan de onderkant van de schotel gehandhaafd. Plaats de schotel gedurende 15 minuten in een incubator 37 ° C.
- Gebruik in het bio-leven een steriele, brede boring-overdrachtpipet om alle media en weefsel over te brengen naar een steriele, 5 ml cryogene buis. Plaats de punt van dezelfde overbrenging pipette dicht bij de bodem van de buis. Zachtjes tritureren door 10-15 keer langzaam te pipetteren.
- Vermijd bubbels tijdens pipettering. Herhaal het proces met een kleine boring-overgangspipette tot een homogeen mengsel is bereikt. Als het weefsel niet gedissocieerd wordt, tritureren met een 1000 μL pipet.
- Voeg 2 ml warmte DMEM 5/5 toe aan het gedissocieerde celmengsel. Pak de centrifugebuis terwijl het nog in de biohood staat. Meng zachtjes door inversie. Centrifugeer bij ongeveer 573 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (20-25 ° C).
- Gebruik in het bio-leven een steriele serologische pipet om alle supernatanten te verwijderen en weggooien, zonder te brekenpellet. Gebruik een steriele pipet om 1 ml warmte DMEM 5/5 aan de pellet in de buis toe te voegen om de cellen opnieuw op te schorten. Gebruik een steriele, kleine boring transferpipette om de pellet te breken door voorzichtig te pipetteren omhoog en omlaag tot het mengsel homogeen is.
OPMERKING: Vermijd het vormen van bellen tijdens pipettering. Als er heel weinig weefsel is verzameld, voeg dan alleen 0,5 ml DMEM 5/5 toe. - Gebruik in het bio-leven een steriele pipet om 10 μL van de celsuspensie over te brengen naar een microcentrifugebuis. Buiten het bio-leven, voeg 10 μL Trypan Blue toe aan de 10 μL cel suspensie in de microcentrifugebuis.
OPMERKING: Deze stap vereist geen steriliteit. - Laad 10 μL van de Trypan-blauwe cel suspensie in een wegwerp hemocytometer chip om de cellen te tellen.
6. Plating cellen
- Gebruik in het bio-leven een steriele micropipet om 50 μL celvering naar het midden van elke array en elke controle Petri-schotel over te dragen. Gebruik een piPepertip per gerecht. Zorg ervoor dat u de cellen precies in het midden van de array plaatst. Re-nat het laboratoriumpapierpapier dat met steriel water in de schotel was, of plaats nieuw tissuepapier in elke schotel. Bedek de afwas.
- Leg de bedekte Petri-schotels in een incubator op 37 ° C en 10% CO 2 gedurende 3-4 uur.
- Voeg 1 ml warmte DMEM 5/5 per MEA in de biochemie toe.
OPMERKING: Vermijd het wassen van de cellen weg van de middelmatrix bij het toevoegen van het medium (belangrijk!). Zorgvuldig gebruik een steriele micropipette om één druppel per keer rond de binnenkanten toe te voegen. - Plaats een pet met een gasdoorlatend FEP membraan op elke MEA. Stuur ze twee dagen naar de incubator terug.
OPMERKING: De kap voorkomt vervuiling en verdamping. Volg aseptische techniek, droog de caps in de biohood met 100% ethanol voordat u ze op het MEA zet. De culturen moeten in het bio-leven worden afgedekt en moeten te allen tijde blijven.
7. HoofdHet houden van de culturen
- Na twee dagen, voer een complete medium vervanging met verwarmde DMEM +.
- Breng slechts een paar gerechten van de incubator naar het bio-leven op een keer om te voorkomen dat de culturen te lang worden benadrukt.
- Gebruik een steriele microlipet van 1 ml om het medium uit de schaal te trekken door de punt van de pipet zorgvuldig op de binnenkant van het gerecht te plaatsen, waarbij u de cellen niet in het midden raakt. Gebruik slechts één pipettip per schotel om te voorkomen dat de vervuiling wordt verspreid.
- Gebruik een steriele micropipette om 1 ml warme DMEM + af te geven, waarbij u de punt van de pipet zorgvuldig plaatst op de binnenmuur van de schotel.
- Voer 50% gemiddelde veranderingen uit met verwarmde DMEM +, zoals hierboven beschreven, 2-3 keer per week en maximaal 4 dagen tussen voedingen.
- Gebruik een steriel 1 ml micropipet om 500 μl medium uit de schaal te trekken. Gebruik een steriele micropipette om 500 μL warme DMEM + af te geven. </ Li>
8. Visuele inspecties en opname
- Controleer de schotelmonsters elke andere dag onder een microscoop om te zoeken naar de celdekking over de matrix (met behulp van 4X en 10X vergroting) en verontreiniging (met behulp van 20X vergroting), ofwel bacterieel of schimmel.
OPMERKING: Figuur 3a toont een voorbeeld van optimale celdekking, terwijl Figuur 3b een cultuur toont met een slechte celdichtheid. - Twee weken na plating, test een monster van de MEA-schotels voor spontane activiteit. Opnemen van MEA's, zoals hieronder beschreven, gedurende 3-5 minuten. Spikes worden gedetecteerd als de activiteit aanwezig is ( figuur 4 ).
OPMERKING: Het is aan de experimentator om te bepalen wanneer het testen moet beginnen, gebaseerd op het type experiment en hypothese dat wordt onderzocht.- Om de activiteit in een MEA op te nemen, gebruik de volgende apparatuur: voeding, versterker, hoofdletter / voorversterker, Temperatuurregelaar en stimulatiegenerator (zie tabel van materialen en figuur 5 ).
- Voordat u de culturen uit de broeikas neemt, sluit u de temperatuurregelaar aan en zet het systeem aan door de stroomtoevoer aan te zetten (volgens de instructies van de fabrikant), zodat de verwarmde basisplaat van de voorversterker 35 ° C kan bereiken.
- Plaats de afgedekte cultuur in de voorversterker zodat de zwarte lijn in het MEA goed in lijn staat met de referentiegrond. Zorg ervoor dat de voorversterkerspinnen op elkaar staan, dat de bovenkant van de voorversterker is bevestigd en dat de kweekkap nog steeds is ingeschakeld.
- Zodra de cultuur in de plaat is geplaatst, verwijder de optie "Change MEA" op de gegevensverzamelingssoftware (zie de tabel met materialen voor software namen en gebruikersgidsen). Deselecteer ook het vakje 'Blanking', met de naam 'Blanking', voordat u opnamen maakt.
- Selecteer "Download" in "MEA_Select" na tHij is in het systeem geplaatst. Controleer of het programma "Download OK" toont voordat u verder gaat.
- Druk op "Start" in de softwareomgeving om de signalen te visualiseren. Selecteer in het hoofdvenster: "Spikes" → "Detection" → "Automatic", verander de waarde "Std Dev" in "5" en klik op "refresh" om de drempel opnieuw in te stellen.
OPMERKING: Het venster "Spikes" toont spikes die de drempel hebben doorgegeven. - In het hoofdvenster selecteert u "Recorder" → "Recorder" → "Bladeren." Wijzig het pad en de bestandsnaam om de datum, tijd, schotel en experiment te identificeren. Stel de tijdslimiet in ( bijv. Tot 5 minuten). Klik op 'Stop', 'Opnemen' en 'Afspelen'. Merk op dat de opname automatisch stopt.
- Open de stimulatie software. Selecteer "Recorder" → "Recorder" → "Bladeren" om een bestand te maken en om de tim te zettenE limiet. Klik op "Stop", "Record" en "Play" om opnieuw op te nemen. Klik op "Downloaden en starten" (op de stimulatie software) om de stimulatie te leveren aan de schotel.
- Selecteer de "Change MEA" knop in de software control om gerechten te wijzigen.
OPMERKING: Houd de cultuur niet langer dan 30 minuten uit de incubator zonder een systeem om een CO 2 -atmosfeer rond de cultuur te handhaven. Als er langere opnamesessies nodig zijn, gebruik dan een in de handel verkrijgbare adapter om CO 2 te leveren.
9. Trainingsnetwerken
OPMERKING: Figuur 6 toont een overzicht van stappen 9.1-9.3, die hieronder beschreven worden.
- Noteer een 5 minuten basislijn van spontane activiteit uit de celcultuur (zoals beschreven in stap 8). Zodra de basislijn is vastgesteld, geef een stimulatie stimulatie van 5 minuten, die bestaat uit een 0,5 Hz bifasischePuls met een pulsduur van 200 μs en een 900 mV-pulsamplitude ( Figuur 7a ) via de geselecteerde stimulatie-elektroden, zoals getoond in Figuur 8 (zie de softwarehandleiding in de tabel van materialen voor meer informatie over het selecteren van de stimulatie-elektroden).
- Bij het voltooien van de pre-training stimulatie, geef een "training" protocol aan de netwerken met dezelfde elektroden als in de probing stimulatie. Levert de hoogfrequente treinen één keer per 2 s, zoals beschreven in Hamilton et al. 15 ( Figuur 7b en Figuur 7c ).
OPMERKING: Het trainingssignaal bestaat uit 40 puls treinen. Elke pulstrein bestaat uit 100 bifasische pulsen, met 4 ms tussen pulsen, een 200 μs pulsduur en een 900 mV pulse amplitude. - Na het afronden van de trainingsperiode, geef een 5 minuten post-training stimulatie aan de cellen,Identiek aan de pre-training stimulatie. Zodra de stimulatie na de training is beëindigd, record 5 minuten spontane activiteit na het stimuleren van het netwerk (zoals beschreven in stap 8).
- Gebruik een aparte controle groep MEAs om rekening te houden met mogelijke wijzigingen in netwerkrespons door natuurlijke fluctuaties of systeem niet-stationairheid. Beheer hetzelfde experimentele protocol als hierboven beschreven aan die controlegroepen, met dien verstande dat de controlegroepen een sham trainingsperiode ontvangen waarin geen werkelijk trainingssignaal wordt toegediend.
10. Gegevensanalyse
Opmerking: de gegevensbestanden worden opgeslagen en later gesorteerd in neuroneenheden met behulp van een eigen sorteersoftware (zie de tabel van materialen). Een aangepaste grafische gebruikersinterface (GUI) wordt gebruikt om de eenheden te laden en de activiteitspatronen in de culturen te analyseren, inter-burst intervallen, burst duration en post-stimulus time histogram (PSTH) (zie de tabel van materialen). De PSTH isDe belangrijkste grafiek die moet worden geanalyseerd, aangezien het de activiteit van het netwerk toont in binformaten (variabele lengte), waardoor een visuele weergave van het antwoord van het netwerk op de gepresenteerde stimulatie wordt gegeven.
- De .mcd-gegevensbestanden converteren naar .plx-formaat met behulp van een eigen sorteersoftware (zie de tabel met materialen voor software namen en gebruikersgidsen). Exporteer het .plx-bestand naar een nieuw .plx-bestand in hetzelfde programma. Sorteer de kanalen in neuroneenheden ( Figuur 9 ). Zodra de sortering is voltooid, exporteer de gegevens als een .nex bestand.
- Open het .nex bestand in de desbetreffende software (zie Material Table ) en sla het op als een .mat bestand dat geanalyseerd moet worden met de aangepaste GUI, die vrij beschikbaar is (zie Material Table ).
OPMERKING: De grafische gebruikersinterface (zie de tabel van materialen) beoordeelt PSTH's volgens de invoer van de gebruiker ( dwz populatie PSTH, bevooroordeeld gemiddelde PSTH of individueel kanaal PSTH), waardoor een overzicht van het stimulatie-experiment en de directe vergelijking tussen de post- en pre-stimulusbestanden mogelijk is. Het plot ook de initiële versus de laatste PSTH's, die het netwerkrespons vergelijkt met de eerste 6 en de laatste 6 stimuli. De GUI voert een aantal andere functies uit, zoals spikesnelheid, interspikesinterval, spikes per burst, inter-burst interval en burst duration, voor zowel stimulatiebestanden als bestanden met spontane activiteit. - Selecteer eerst een .mat bestand met variabelen die spike treinen bevatten en een variabele die het stimulatie artefact bevat; Het script zal de gegevens analyseren en de hoofd GUI verschijnt met een PSTH gemiddelde grafiek rechts ( Figuur 10 ).
- Klik op de actieve elektrodenknoppen om de individuele PSTH (in blauw) te zien in vergelijking met de gemiddelde PSTH (in het rood).
OPMERKING: De actieve elektroden zullen gekleurd worden om een hittekaart weer te geven, waarbij hogere waarden (meer rood) groter zijnPiek PSTH waarden, wat een sterkere respons op stimulatie aangeeft. - Selecteer een analyse-optie via het pop-upmenu. Selecteer de knop "Biased Average" om een subset van elektroden te selecteren en het gemiddelde van die subset te plotten; Dit is handig om het subnetwerkgedrag in een cultuur te vergelijken.
OPMERKING: Er zijn meerdere verschillende analysemogelijkheden geselecteerd via het pop-upmenu, en ze worden allemaal uitgelegd in de help-knop in de software. - Selecteer de 'Save Graph' knop om de huidige grafiek te bewaren als een JPEG-bestand met hoge resolutie. Selecteer de "Data Table" knop om de gegevens in een spreadsheet te exporteren.
- Klik op de actieve elektrodenknoppen om de individuele PSTH (in blauw) te zien in vergelijking met de gemiddelde PSTH (in het rood).
Representative Results
Met behulp van de hier geplaatste procedure ( Figuur 11 ) werden 60-kanaals MEA's geplateerd met E17 muisneuronale cellen geïncubeerd totdat de culturen de arrays in een gezond tapijt van cellen behandelden ( Figuur 12 en Figuur 3a ) . Na 3 weken incubatie bij 10% CO 2 en 37 ° C werden de culturen gecontroleerd op spontane activiteit onder gebruikmaking van een commercieel registratiesysteem (zie Material Table ). De temperatuur werd gehouden bij 37 ° C tijdens de opnameprocedure onder gebruikmaking van een temperatuurregelaar, aangezien temperatuur invloed heeft op neuronale activiteit en afbrandingssnelheden.
Testen voor activiteit
Spontaan actieve netwerken tonen normaal gesproken wisselende signaalpatronen. Een gemiddelde actieve cultuur kan activiteiten registreren in eenOngeveer 40% van de elektroden. Van deze actieve elektrodeplaatsen registreren bijna de helft spontane signalen, met afzettingssnelheden van 5 tot 10 Hz. Een representatieve raster plot van spontane activiteit is getoond in figuur 4a . De tiktekens geven de tijdstempels aan van actiepotenties die zijn geregistreerd uit 9 actieve elektroden gedurende een 20 s venster, bij een verwervingssnelheid van 25 kHz en een bandpasfilterbereik tussen 300 Hz en 3 kHz. Figuur 4b toont het baseline geluid en het gefilterde ruwe extracellulaire signaal gedurende 8 uitbarstingen van activiteit vóór de sorteerprocedure. Om de actiepotenties van het geluid te scheiden, worden de drempels voor elk kanaal ingesteld op 5 keer de standaardafwijking van het baseline geluid en worden berekend over een venster van 500 ms 15 .
Voor analyse werden geregistreerde spikes voor elke elektrode offline gesorteerd om tussen fysio te onderscheidenLogische activiteit en stimulatie artefacten met behulp van een k-middel algoritme en principe component analyse. Signalen die werden geïdentificeerd als fysiologische reacties werden samengevoegd om een populatie respons bij elke elektrode te creëren ( Figuur 13 en Figuur 9 ) 15 .
Training neurale netwerken met elektrische stimulatie
Netwerken werden getraind door gebruik te maken van elektrische stimulatie die direct via de MEA-elektroden op de cultuur werd toegepast, met behulp van een stimulusgenerator (zie de tabel van materialen). In deze reeks representatieve resultaten werd een L-vormige configuratie bestaande uit 13 elektroden gebruikt ( Figuur 8 ), hoewel veel andere configuraties kunnen worden toegepast. De probing en trainingsstimulatie waren gebaseerd op parameters gedefinieerd in Ruaro et al. 14 .
Een basislijn werd aanvankelijk ingesteld door opnemen van 5 minuten spontane activiteit voorafgaand aan stimulatie. Zodra de basislijn werd vastgesteld, werd een 5 minuten voorafgaande trainingstimulatie stimulatie bestaande uit een 0,5 Hz bifasische puls met een 200 μs pulsduur en een 900 mV pulsamplitude ( Figuur 7a ) toegediend via de geselecteerde stimulatieplaatsen ( dwz "L" -vormige). Een trainingsprotocol werd vervolgens elke 2 s aan de netwerken toegediend met dezelfde set elektroden. Het trainingssignaal was samengesteld uit 40 pulstreinen, die elk 100 bifasische pulsen bevatten, met een intermulsperiode van 4 ms, een pulsduur van 200 μs en een 900 mV pulsamplitude ( Figuur 7b en Figuur 7c ). Deze trainingsperiode werd vervolgens gevolgd door een 5-min post-training fase, vergelijkbaar met de pre-training stimulatie. Het protocol was toenAfgesloten met een 5-minuten opname van spontane activiteit na stimulatie.
Hetzelfde experimentele protocol werd toegepast op een controlegroep van culturen om rekening te houden met natuurlijke schommelingen in het netwerkrespons. Het enige verschil in het controleprotocol was echter de toepassing van een sham training periode, waarbij geen werkelijk trainingssignaal werd toegediend.
Statistische analyses van de datasets ( dwz training versus controle) werden uitgevoerd met een one-way ANOVA, met de variabele "training" als tussenfactor. De latentie werd gebruikt als een binnenfactor factor. Als er significante interactie werd gevonden, werd Tukey's post-hoc procedure uitgevoerd. De resultaten lieten een pre-training reactie zien binnen 20 ms post-stimulus, hoewel het bereik van de activiteit niet in overeenstemming was met de eerste reactie. Echter, post-training activiteit vertoonde niet alleen ar Esponse binnen de eerste 20 ms post-stimulus, zoals gezien tijdens de pre-training, maar het vertoonde ook een significante activiteit 30-50 ms post-stimulus ( Figuur 14 en Figuur 15 ) 15 . Er was ook een statistisch significante correlatie van "spike frequency" versus "time after stimulus" en van "piek betrouwbaarheid" versus "time after stimulus". "Spikbetrouwbaarheid" kan worden gedefinieerd als de kans om een netwerkrespons op een stimulatie te zien, waarbij een reactie op elke stimulus een maximumwaarde van 1 toegewezen is. Figuur 16 toont bijna 50% toename van de spijkfrequentie, evenals een 30 -50% toename van de piekbetrouwbaarheid van getrainde netwerken versus controle in het bereik van 20-50 ms post-stimulus. Deze resultaten suggereren dat de training fundamenteel de netwerkdynamiek veranderde.
1 "class =" xfigimg "src =" / bestanden / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/>
Figuur 1 : Gereedschap en materialen die worden gebruikt voor verwijdering van embryo's. ( A ) Ijsgevulde bak. ( B ) Petrischalen, gevuld met koude L-15 "Slush." ( C ) Papierhanddoek. ( D ) Spuitfles met 70% ethanol. ( E ) Fijne tang (x2). ( F ) Kleine chirurgische schaar. ( G ) Blunt-neus duim tang. ( H ) Grote schaar. ( I ) Lichaams tas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Gereedschappen en materialen gebruikt voor Brain Extractie. ( A B ) Petrischaal met embryo hoofden. ( C ) Foliebedekte centrifugebuis met opslagmedium. ( D ) Omgekeerde glas Petrischaaltje. ( E ) geautoclaveerd filterpapier. ( F ) Bier met 70% ethanol. ( G ) Plastic pipet. ( H ) Iris schaar. ( I ) Fijne tang. ( J ) Dun dubbele spatel. ( K ) Papierhanddoek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 : Optimale versus niet-optimale culturen. ( A ) toont een gezond tapijt van cellen die de arrays behandelen, in tegenstelling tot ( B )Waarin er sprake is van een slechte celproliferatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 : Representatieve resultaten van spontane activiteit. ( A ) Representatieve raster plot van spontane activiteit. De tiktekens geven aan dat er in een 20 s-venster een activeringspotentieel is opgenomen van 9 actieve elektroden bij een verwervingssnelheid van 25 kHz en een bandpasfilterbereik tussen 3 kHz en 300 Hz. ( B ) Representatief gefilterd extracellulaire actiepotentieel uit een actieve plaats. Figuur gewijzigd van referentie 15 . Klik hier om een groter versio te bekijkenN van deze figuur.
Figuur 5 : Opname-instellingen. ( A ) Stimuleringsgenerator. ( B ) Temperatuurregelaar. ( C ) Voeding. ( D ) versterker. ( E ) Hoofdletter / voorversterker. ( F ) Capped MEA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6 : Schematische representatie van het elektrische training protocol. Noteer een initiële basislijn gedurende 5 minuten en een sonde stimulatie gedurende 3 minuten. Dien tetanische stimulatie toe Aan voor 90 s, die niet is opgenomen. Toepassing en opnemen van een tweede sonde stimulatie gedurende 3 minuten en een laatste basislijn gedurende 5 minuten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7 : Probing Stimulatie en Training Signal Parameters. ( A ) Probing stimulatie bestaat uit ± 900 mV bi-fasische pulsen die worden toegediend met een frequentie van 0,5 Hz. ( B ) Pulstreinen bestaan uit 100, ± 900 mV bi-fasische pulsen bij een frequentie van 250 Hz. ( C ) Het trainingssignaal bestaat uit 40 pulstreinen die elke 2 s worden toegediend. Figuur gewijzigd van referentie 15 ."_blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 8 : Vertegenwoordiging van de configuratie 'L' -vorm. Vierkanten vertegenwoordigen individuele elektroden uit een MEA. Blauwe pleinen wijzen op elektroden die worden gebruikt voor stimulatie, terwijl alle anderen worden gebruikt voor opname. Figuur gewijzigd van referentie 15 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9 : Onderscheidende eenheden van geluids- en stimuleringsartifacten. De verschillende bovenpanelen ( A -
Figuur 10 : Post-stimulus Tijd Histogram (PSTH). Een grafische gebruikersinterface (zie Materialetabel ) plot de PSTH's volgens de invoer van de gebruiker ( dwz populatie PSTH, bevooroordeeld gemiddelde PSTH of individueelKanaal PSTH), waardoor een overzicht van het stimulatie-experiment en de directe vergelijking tussen de post- en pre-stimulusbestanden mogelijk is. Het plot ook de initiële versus definitieve PSTH's; Dit vergelijkt het netwerkrespons met de eerste 6 en de laatste 6 stimuli. De GUI voert een aantal andere functies uit, zoals spikesnelheid, interspikesinterval, spikes per burst, inter-burst interval en burst duration, voor zowel stimulatiebestanden als bestanden met spontane activiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11 : Overzicht van celbereiding en plating. ( A ) Een E17 zwangere muis wordt geëuthaniseerd met CO 2 . ( B ) De muis is decapitatEd en de baarmoeder is verwijderd. ( C ) De embryo's worden vrijgegeven en onthoofd. ( D ) De hersenen worden uit elk embryo geëxtraheerd en de frontale lobben worden verwijderd. ( E ) De cellen zijn gedissocieerd. ( F ) De gedissocieerde cellen worden in medium gesuspendeerd. ( G ) De gesuspendeerde cellen zijn geplateerd op 60-kanaals multi-elektrode arrays (MEAs). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12 : Neuronale culturen die op microelektrode arrays zijn geplateerd. Embryonale muisneuronen zijn geplateerd op 60-kanaals MEA's, die de gelijktijdige opname van de neuronale activiteit over het netwerk van elke elektrode mogelijk maken. (Figuur aangepastUit referentie 15 ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 13 : Sorterenprogramma gebruikt om de golfvormen van elk kanaal te sorteren. Het sorteringsprogramma (zie Materialtabel ) laad een gegevensbestand en bevat alle initiële units die voor elk kanaal zijn verworven. Eén van de verschillende methoden is geselecteerd om signalen aan specifieke eenheden toe te wijzen. In dit voorbeeld werd het k-middelen clusteringsalgoritme geselecteerd en werd de gele eenheid (gemerkt "eenheid a" op het onderste venster) geïdentificeerd. Een ander programma (zie Materialetabel ) wordt dan gebruikt om het .nex-bestand naar een .mat-bestand te exporteren, dat is het invoerbestand voor de op maat gemaakte GUI (zie
Figuur 14 : Veranderde netwerkactiviteit in reactie op stimulatie na een trainingsperiode. Representatieve raster plot van activiteit uit acht elektroden. De verticale rode lijn geeft de tijd van de stimulus aan, en de zwarte tekens geven aan hoe de potentieel optreedt. Bij pre-training ( A ) is er een onmiddellijke reactie op de stimuluspuls over de kanalen. Na het trainen ( B ) vertoont het netwerk een langere activiteitrespons, evenals de onmiddellijke reactie op de stimulatie 15 ..jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 15 : Geoefende Netwerken hebben de Spike Frequenties aanzienlijk gewijzigd. De frequentie van het netwerk spiking voor de controle netwerken wordt berekend door het aantal spikes over 50 ms direct na elke stimulatie te integreren en te delen door die periode. Getoond is het gemiddelde van 12 getrainde en 10 controle netwerken (de foutbalken geven de standaard fout van het gemiddelde aan). Het asterisk (*) geeft een statistisch verschil ( p-waarde <0,05) tussen de twee datasets aan. Figuur gewijzigd van referentie 15 . Klik hier om een lar te bekijkenGer versie van deze figuur.
Figuur 16 : Synaptisch gemedieerde responsen worden aanzienlijk gewijzigd in getrainde netwerken. ( A ) De piekbetrouwbaarheid, gemeten in 10 ms bakken en genormaliseerd aan de besturingsnetten, laat geen verandering zien voor de directe activering van neuronen in de buurt van elektroden (0-20 ms). Er is dus geen statistisch verschil tussen controles en getrainde netwerken voor die bins. Aan de andere kant worden de langer-latency responses (30-50 ms) synaptisch gemedieerd, wat aangeeft dat deze methode een meer gedetailleerd onderzoek geeft naar betrouwbaarheid dan in figuur 15 hierboven. ( B ) De populatiepiekfrequentie herhaalt het gedrag van de betrouwbaarheid en laat geen wijziging zien voor de directe activering (0-20 ms), terwijl een statEr is een significant verschil gevonden voor de langetermijnreacties (30-50 ms). Dit gedrag is consistent met de gemiddelde resultaten in het vorige figuur 15 . De foutbalken zijn de standaardfout van het gemiddelde, berekend voor 10 controle netwerken en 12 getrainde netwerken. (*) P-waarde <0,05; (**) p-waarde <0.001. Figuur gewijzigd van referentie 15 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Aantal | Item |
| 1 | Geautoclaveerde glasreagensfles (minimaal 100 ml) |
| 20 | 15 ml steriele centrifugebuizen |
| 1 | 10 ml steriele serologische pipet |
| 4 | 25 ml sterielE serologische pipet |
| 2 | 50 ml steriele serologische pipet |
| 1 | Centrifuge buisrek |
| 150 ml | Steriel DI water |
| 5 mg | Poly-D-lysine flesje |
Tabel 1: Voorbereiding van PDL - Lijst van materialen en reagentia.
| Aantal | Item |
| 1 | 50 ml steriele centrifugebuizen |
| 10 | 15 ml steriele centrifugebuizen |
| 2 | 1 ml steriele serologische pipet |
| 2 | 50 ml steriele serologische pipet |
| 1 | Centrifuge buisrek |
| 1 ml | FosfaatBufferzout (PBS) |
| 1 mg | laminine |
Tabel 2: Bereiding van laminine - Lijst van materialen en reagentia.
| Aantal | Item |
| 1 | Geautoclaveerde glasreagensfles (minimaal 100 ml) |
| 20 | 15 ml steriele centrifugebuizen |
| 1 | 10 ml steriele serologische pipet |
| 4 | 25 ml steriele serologische pipet |
| 2 | 50 ml steriele serologische pipet |
| 1 | Centrifuge buisrek |
| 150 ml | Steriel DI water |
| 5 mg | Poly-D-lysine flesje |
Tabel 3: Opslagmediumbereiding - Lijst van materialen en reagentia.
| Aantal | Item |
| 44 ml | DMEM met gestablileerde vorm van L-glutamine (zie tabel van materialen) |
| 1 ml | Serumvrij supplement voor neurale celcultuur (zie tabel van materialen) |
| 2,5 ml | Paardserum |
| 100 μl | Ascorbinezuur [4 mg / ml] |
| 2,5 ml | Foetaal runder serum (FBS) |
| 0,5 ml | Pen strep (optioneel) |
| 1 | 50 ml steriele centrifugebuizen |
| 2 | 25 ml steriele serologische pipet |
| 2 | 10 ml steriele serologische pipet </ Td> |
| 2 | 1 ml steriele serologische pipet |
| 1 | 250 ml filter |
Tabel 4: DMEM 5/5 Medium Bereiding - Lijst van Materialen en Reagentia.
| Aantal | Item |
| 49 ml | DMEM met gestablileerde vorm van L-glutamine (zie tabel van materialen) |
| 1 ml | Serumvrij supplement voor neurale celcultuur (zie tabel van materialen) |
| 100 μl | Ascorbinezuur [4 mg / ml] |
| 0,5 ml | Pen strep (optioneel) |
| 1 | 50 ml steriele centrifugebuizen |
| 2 | 25 ml steriele serologische pipet |
| 2 | 1 ml steriele serologische pipet |
| 1 | 250 ml filter |
Tabel 5: DMEM + Medium Voorbereiding - Lijst van Materialen en Reagentia.
| Aantal | Item |
| 1 | Papain 140 U / injectieflacon |
| 1 | Dnase 1.260 U / injectieflacon |
| 7 ml | DMEM + (gekoeld) |
| 5 ml | DMEM 5/5 (warmte) |
| 10 μl | Trypan blauw |
| 2 | Scalpelbladen |
| 1 | 35 mm steriele Petri schotel |
| 4 | 15 ml steriele centrifugebuizen |
| 2 | 5 ml steriele cryogene buizen |
| 2 | 2 ml steriele cryogene buizen |
| 1 | 50 ml steriele centrifugebuizen |
| 1 | Microcentrifugebuis |
| 2 | Grote boring transfer pipette |
| 3 | Kleine boring transfer pipette |
| 5 | 2 ml steriele serologische pipet |
| 5 | 1 ml steriele serologische pipet |
| 2 | 10 μL steriele micropipet tips |
| 1 | 1000 μL steriele micropipet tips |
| 1 | Hemocytometer chip |
Tabel 6: Celldissociatie - Lijst van materialen en reagentia.
Discussion
De stappen die in dit protocol zijn beschreven, geven voldoende informatie voor de beginner om zijn / haar eigen neuronale culturen op MEA's te platen en om netwerkactiviteit op te nemen. Dit protocol zal helpen om ervoor te zorgen dat de culturen goed aansluiten, een tapijtlaag van cellen vormen over de elektrode-arrays, en gedurende enkele maanden gezond en verontreinigd blijven.
Hoewel het het beste is om aan alle delen van het protocol te voldoen, zijn er stappen in het proces die kritiek zijn op het succesvolle resultaat. Het gebruik van aseptische techniek door het gehele proces is essentieel om te voorkomen dat de culturen besmet raken. Nieuwe MEA's moeten hydrofiel worden gemaakt, zoals beschreven in het protocol, of anders zal een slechte celhechting ontstaan. Het vermijden van harde pipettering en de vorming van luchtbellen tijdens dissociatie zullen het aantal beschadigde cellen verminderen en zal leiden tot een hogere en gezondere opbrengst. Overschakelen van DMEM 5/5 naar DMEM + na de eersteVoeding is ook belangrijk. DMEM 5/5 bevat paardserum, waardoor glialcellen de cultuur zullen domineren als ze continu worden gebruikt en resulteren in slechte neuronale activiteit, hoewel de culturen gezond zullen blijken 17 . Voeding van de culturen zoals gepland en in goede incubatie omstandigheden te houden is ook van cruciaal belang.
Plating van celculturen op MEA's omvat veel variabelen die kunnen leiden tot minder dan optimale resultaten. Hoewel het doel een perfect "tapijt" van cellen is, zal het niet voldoen aan de bovengenoemde kritische stappen resulteren in slechte celmaturatie of in vervuiling. Slechte celhechting, die verschilt van arme celmaturatie, is ook een zorg. Dit kan worden veroorzaakt door een aantal factoren, waaronder een slechte MEA-voorbereiding voorafgaand aan plating of het gebruik van oud medium. Als oud medium dat een gestabiliseerde vorm van L-glutamine en serumvrij supplement voor neurale celcultuur bevat (zie Materialtabel) Wordt gebruikt, hechten de cellen aanvankelijk maar dan na ongeveer twee weken weg. Als bacteriële besmetting een aanhoudend probleem is, kan een antibioticum, zoals ampicilline of pen-streep, aan het medium worden toegevoegd. Er zijn ook fungiciden beschikbaar om schimmelinfectie te behandelen. Dit zijn enkele van de meest voorkomende variabelen die het resultaat van de culturen kunnen beïnvloeden. Er zijn veel anderen die alleen na tijd en ervaring worden geconfronteerd.
In vergelijking met het gebruik van glasmicro-elektroden is deze techniek uitstekend voor het bestuderen van netwerkdynamiek en farmacologische reacties. Het maakt het mogelijk om veel verschillende spatio-temporale stimulatiepatronen te gebruiken en zorgt tegelijk voor het opnemen van neuronale responsen uit meerdere gebieden. Vorige groepen hebben interessante resultaten laten zien met behulp van protocollen die vergelijkbaar zijn met die welke hier worden beschreven 18 . Aangezien de culturen voor weken of maanden duren en dezelfde culturen kunnen worden hergebruikt, deze techniek ook eenLijkt op meerdere experimenten in de loop der tijd op hetzelfde netwerk.
Er zijn echter beperkingen voor deze techniek. MEA's zijn niet-invasieve. Daarom kunnen ze alleen extracellulaire activiteit opnemen, in tegenstelling tot patch-klemmen of intracellulaire opname met pipetten. Bovendien, aangezien elke elektrode in een matrix door meerdere cellen is bedekt, is het niet mogelijk om de activiteit van een enkele neuron op te lossen. Omgekeerd, omdat deze in vitro culturen zijn, kunnen ze de structurele eigenschappen van netwerken in de hersenen niet volledig reproduceren. Ook kan de activiteit slechts minder dan 30 minuten per keer worden opgenomen, zonder dat er een mechanisme is dat een CO 2 -atmosfeer biedt voor de cellen om hun pH-balans te handhaven.
Zodra deze techniek wordt beheerd, kunnen farmacologische manipulaties met of zonder elektrische stimulatie worden onderzocht. Nieuwe protocollen om leer- en geheugenvorming in neuronale netwerken te onderzoeken kunnen ook worden ontworpen en getest, samen met pRotocolken voor hippocampale of ruggengraat netwerken. Protocollen voor het stimuleren en trainen van netwerken zijn eerder gepubliceerd, en sommige daarvan werden verder ontwikkeld tot in vivo protocollen, zoals de "selectieve aanpassing" die door Eytan et al werd voorgesteld . 19 . Verscheidene protocollen werden getest. Echter, alleen resultaten van een wijziging van de tetanusprocedure die Ruaro in 2005 voorstelde, worden hier 14 , 20 weergegeven.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation subsidie CMMI-1300007. We willen graag eerdere lableden, die hebben geholpen bij het ontwerpen van deze protocollen, en met de instandhouding van de culturen al meer dan vijf jaar bij de George Mason University hebben geholpen: Dr. J. J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera, en Robert Graham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4 mg/mL aliquots |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
| Beakers - glass - 100 mL | VWR | 13912-160 | |
| Beakers - glass - 500 mL | VWR | 10754-956 | |
| Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
| Cryogenic vial - sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Cryogenic vial - sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
| DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
| DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
| Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
| Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
| GlutaMAX -- I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
| Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
| Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
| Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
| MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
| MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
| MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
| MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
| MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
| MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
| Media storage bottle - glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
| Micropipette tips - 10 μL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
| Micropipette tips - 1,000 μL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
| Micropipette tips - 200 μL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
| Micropipetter - 10 μL | Thermo Fisher | 4641170N | |
| Micropipetter - 1,000 μL | Thermo Fisher | 4641210N | |
| Micropipetter - 200 μL | Thermo Fisher | 4641230N | |
| Papain - 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
| Petri dishes -100 mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes -100 mm glass | VWR | 10754-788 | |
| Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| Phosphate buffer saline (PBS) (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
| Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
| Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
| Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
| Scissors - iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
| Scissors - large | World Precision Instruments | 14214 | |
| Scissors - small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
| Serological pipette - sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
| Serological pipette - sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Serological pipette - sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
| Serological pipette - sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
| Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
| Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
| Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
| Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
| Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
| Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
| Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
| Spatula - small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
| Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
| Transfer pipette - large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
| Transfer pipette - small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
| Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |
References
- Charkhkar, H., Frewin, C., et al. Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing. Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).
- Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development. Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).
- Fröhlich, F., McCormick, D. A. Endogenous electric fields may guide neocortical network activity. Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C.
- Ozen, S., Sirota, A., et al. Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats. J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).
- Shahaf, G., Marom, S.
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Marom, S., Eytan, D. Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons. Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors. Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays. Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S.
- le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons. PloS one. 5 (1), 8871 (2010).
- Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures. IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).
- Hamilton, F., Graham, R., et al. Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation. PloS one. 10 (11), 0142399 (2015).
- Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf (2016).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells: Business Source. , MIT Press. Cambridge. (1998).
- Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array. J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).
- Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons. J. Neurosci. 23 (28), (2003).
- Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. Statistical properties of information processing in neuronal networks. Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).
