Summary
다중 전극 어레이에서 배양 된 마우스 신경 세포는 전기적 자극 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 뉴런을 배양하는 방법, 활동을 기록하는 방법, 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
마이크로 전극 배열 (MEAs)은 약물 독성, 차세대 맞춤 의학을위한 디자인 패러다임을 연구하고, 연결 문화에서 네트워크 역학을 연구하는데 사용될 수 있습니다. 단일 세포에서 활동 만 기록 할 수있는 패치 클램핑과 같은 기존의 방법과 달리 MEA는 각 전극을 개별적으로 배치하는 힘든 작업을 수행하지 않고도 네트워크의 여러 사이트에서 동시에 기록 할 수 있습니다. 더욱이, 수많은 제어 및 자극 구성을 동일한 실험 설정 내에서 쉽게 적용 할 수 있으므로 광범위한 역학을 탐구 할 수 있습니다. 이러한 시험 관내 연구에 대한 주요 역학 중 하나는 배양 된 네트워크가 학습을 나타내는 특성을 나타내는 범위였습니다. MEA에서 배양 된 마우스의 신경 세포는 전기적 자극에 의해 유도 된 훈련 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 MEA에서 신경 세포를 배양하는 방법을 보여줍니다. 성공적으로 다시도금 된 접시의 95 % 이상에서 코드; 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립한다. 그러한 실험의 결과를 정렬, 플롯 및 해석합니다. 신경 세포 배양을 자극하고 기록하기위한 독점 시스템의 사용이 입증되었습니다. 소프트웨어 패키지는 또한 연결 단위를 정렬하는 데 사용됩니다. 맞춤형 그래픽 사용자 인터페이스는 자극 후 시간 히스토그램, 인터 버스트 간격 및 버스트 지속 시간을 시각화하고 훈련 프로토콜 전후의 자극에 대한 세포 반응을 비교하는 데 사용됩니다. 마지막으로,이 연구 노력의 대표 결과 및 향후 방향에 대해 논의한다.
Introduction
Micro-electrode arrays (MEAs)는 약물 독성, 차세대 맞춤 의학을위한 디자인 패러다임을 연구하고, 연결 문화에서 네트워크 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다 1 . 단일 세포에서의 활동 만 기록 할 수있는 패치 클램핑 (patch-clamping)과 단일 장소에서 전극을 둘러싸고있는 뉴런의 세포 외 반응을 기록 할 수있는 유리 피펫으로 필드 기록 (record recording)과 같은 전통적인 방법과 대조적으로 MEA는 동시에 각 전극을 개별적으로 배치하는 힘든 작업을하지 않고도 세포 배양의 여러 사이트에서 기록 할 수 있습니다. 이를 통해 해당 문화권 내에서 네트워크를 형성하는 세포 그룹 간의 동적 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 또한, 네트워크 소성 패턴 2 , 3 , 4 , 5 및 네트워크 제어 6 에 대한 전기 자극의 효과 </ sup>는 잘 설명되어 있으며, 동일한 실험 설정 내에서 다양한 전기 자극 및 제어 구성을 쉽게 적용 할 수 있으므로 광범위한 시공간 역학을 탐구 할 수 있습니다.
이러한 시험 관내 연구에 대한 주요 역학 중 하나는 배양 된 네트워크가 학습 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13을 나타내는 속성을 나타내는 정도였습니다. Peixoto Lab은 이전에 Ruaro et al. 에 설명 된대로 고주파 훈련 신호의 영향을 조사했습니다 . 14 , microelectrode 배열에 도금 마우스 뉴런의 네트워크에. 이 실험에서 네트워크는 응답의 증가g 전기 자극에 의해 유발 된 훈련. 증가 된 반응은 자극 인식을 통한 학습의 한 형태로 간주되어 네트워크가 특정 자극 ( 예 : 훈련) 프로토콜을 적용한 후 자극의 변화에 일관된 방식으로 응답했습니다.
이 프로토콜은 MEA에서 연결 세포를 배양하고 도금 된 접시의 95 % 이상에서 성공적으로 기록하고, 자극 패턴, 단일 단위 활동 정렬, 플롯 히스토그램에 응답하도록 네트워크를 훈련하는 프로토콜을 확립하고 결과를 해석하는 방법을 보여줍니다. 그러한 실험. 신경 세포 배양의 자극과 기록을위한 독점 시스템 ( Table of Materials 참조)의 사용뿐만 아니라 소프트웨어 패키지 ( Table of Materials 참조)를 사용하여 신경 단위를 분류 할 수 있습니다. 맞춤형 그래픽 사용자 인터페이스 (재료 표 참조)를 사용하여 포스트 S를 시각화합니다.시간 간격 히스토그램, 인터 - 버스트 간격 및 버스트 지속 시간뿐만 아니라 훈련 프로토콜 전후에 자극에 대한 세포 반응을 비교할 수 있습니다.
Protocol
모든 동물 절차는 NIH 지침 및 / 또는 실험실 동물의 인간애 보살핌 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책을 따르며 George Mason University에서 제도적으로 승인 된 동물 관리 및 사용 (IACUC) 프로토콜하에 있습니다.
1. 재료 준비
- 다음 물질을 오토 클레이브하십시오 : (2) 500 mL 비이커에 세로로 배열 된 5.75 인치 길이의 유리 피펫, 약 150 매의 여과지 (직경 150 mm, 각 쐐기는 8 개 쐐기로 자르고 기공 크기는 중요하지 않음), 1,000 μL 여과 된 피펫 팁, 여과 된 피펫 팁 200 μL, 여과 된 피펫 팁 10 μL 및 세척 용 탈 이온수 (최소 200 mL).
- 시약과 매체를 준비하십시오.
- 무균 기술을 사용하여 생체 내 모든 시약과 매체를 준비하십시오.
- 표 1에 따라 Poly-D-lysine (PDL)을 준비합니다.
- 멸균 DI 물과 PDL을 최종 c50μg / mL의 농도로 처리 하였다. 멸균 된 serological 피펫을 사용하여 autoclaved 유리 시약병에 멸균 DI 물 96 ML을 전송합니다.
- 멸균 serological 피펫을 사용하여 PDL을 포함하는 제조 유리 병에 멸균 DI 물 4 ML을 추가합니다. pipetting하여 PDL을 해산. 동일한 피펫을 사용하여 96 ML의 멸균 DI 물이 들어있는 유리 시약 병에 PDL 솔루션을 전송하십시오.
- biohood에서 그것을 제거하고 솔루션을 vortex하기 전에 병을 단단히 막으십시오. 생체 내에서 용액을 5 mL 분액으로 나눕니다. 사용하지 않은 용액은 -20 ° C에서 동결하십시오. 해동 된 PDL은 한 번 다시 동결 될 수 있습니다. 이전에 다시 동결 된 경우 해동 된 용액을 폐기합니다.
- 표 2 에 따라 라미닌 용액을 준비합니다.
- 다음과 같이 laminin을 PBS로 20 μg / mL의 최종 농도로 섞는다. 50 ML 원심 튜브에 PBS 49 ML을 전송하는 무균 serological 피펫을 사용하십시오.
- 살균 혈청학을 사용하십시오.피펫은 laminin의 적절한 무게를 포함하는 제조 업체의 유리 병에 PBS 1 ML을 추가합니다. pipetting하여 laminin을 해산. 동일한 피펫을 사용하여 PBS 49 ML가 들어있는 50 ML 원심 분리기 튜브에 laminin 솔루션을 전송하십시오.
- biohood에서 그것을 제거하고 솔루션을 vortex하기 전에 튜브를 단단히 막으십시오. 생체 내에서 용액을 5 mL 분액으로 나눕니다. 사용하지 않은 용액은 -20 ° C에서 동결하십시오. 해동 된 라미닌은 재 동결 될 수 없습니다. 사용하지 않은 해동 된 솔루션은 폐기하십시오.
- 표 3에 따라 저장 매체를 준비하십시오.
참고 : 저장 매체는 대기 CO2 수준에서 최대 1 개월 동안 조직을 저장하는 데 사용됩니다. 그것은 구입할 수 있습니다 (재료 표 참조) 또는 일반 조리법을 사용하여 준비 할 수 있습니다 : 주변 CO 2 세포 저장 매체 + 2 % 혈청이없는 보충용 신경 세포 배양 + 0.5 mM 세포 배양 배지 (안정화 된 것 포함) 형태의 L- 글루타민 (물질 표 참조).- 10 mL의 저장 매체를 만들려면 CaCl 2 가없는 배아 조직 용 저장 매체 10 mL를 15 mL 원심 분리 튜브에 옮긴다. 신경 세포 배양을위한 무 혈청 보충제 210 μL와 L-glutamine의 안정화 된 형태 55 μL를 첨가하십시오. 반전에 의해 부드럽게 섞는다.
- 저장 매체는 빛에 민감하므로 15 mL 원심 분리 관을 알루미늄 호일로 덮어 보호하십시오. 튜브 당 2 mL의 저장 매체를 분취하여 총 5 개 분취합니다. 최대 2 주 또는 사용 준비가 끝날 때까지 냉장고에 보관하되 얼리지 마십시오.
- 표 4에 따라 DMEM 5/5 배지를 준비한다.
- 신경 세포 배양액, 말 혈청 (HS), 태아 소 혈청 (FBS) 및 아스 코르 빈산에 대한 무 혈청 보충 물의 분량을 해동합니다. 필요하다면 세균 오염을 조절하기 위해 pen-strep의 분취 량을 해동하십시오. 각 성분을 50 mL 원심 튜브에 넣으십시오. 피펫 팁이 표면이나 objec을 만지지 않도록하십시오ts.
- 생체 내에서 진공을 유지하면서 필터를 진공관에 연결하십시오. 혼합물을 필터 상단에 붓고 닫으십시오. Biohood에서 진공을 켜고 매체가 용기 바닥에 걸러지게하십시오. 진공을 차단하기 전에 진공에서 필터의 플러그를 뽑으십시오.
- 멸균 매체 용기의 뚜껑을 조이고 라벨을 붙이고 4 개월 동안 사용하지 않은 매체를 최대 1 개월 동안 보관하십시오. 매체를 살균 유지하기 위해 생체 내에서 용기를 엽니 다.
- 표 5에 따라 DMEM + 배지를 준비하십시오.
- 신경 세포 배양과 아스 코르 빈산 (필요할 경우 펜 스트렙 트)에 대한 혈청 무첨가 보충 물의 분량을 해동합니다. 각 성분을 50 mL 원심 튜브에 넣으십시오. 나머지 프로세스는 1.2.5.2-1.2.5.3 단계를 반복하십시오.
2. 배열 / 요리 준비
참고 : 절차에 사용 된 MEA는 60 채널 배열입니다.8 x 8 정사각형으로 장식되어있다. 전극 간 거리는 200 μm이고 각 전극의 직경은 10 μm입니다. 트랙을위한 전도성 물질은 티타늄이며, 전극 자체는 TiN으로 만들어진다. 전극 주변의 유리 링은 높이가 6mm이고 외경이 24mm입니다. MEA를 덮기 위해 폴리 옥시 메틸렌 (POM)으로 만든 뚜껑을 사용하고 녹음 및 자극 세션 중 오염을 방지하기 위해 가스 투과성 / 액체 불 투과성 에틸렌 프로필렌 (FEP) 필름을 사용합니다.
- 도금 전날.
- 사용하지 않은 MEA를 플라즈마에 노출시켜 친수성으로 만듭니다. 이것은 처음 사용 후 일반적으로 필요하지 않습니다. 대조 배양에 사용되는 유리 커버 슬립에도 플라즈마 처리가 이루어 지도록하십시오.
참고 : 플라스틱 페트리 접시 (35mm)도 대조 접시로 사용할 수 있으며 사전 처리가 필요하지 않습니다.- 반 전력 (50W)에서 40-60 초 동안 플라즈마 에칭 장치를 사용하여 플라즈마 처리를 관리하고, wi챔버 압력은 100-150 mT로 설정된다.
- 즉시 DI 물로 MEA를 채 웁니다. DI 물로 채워진 페트리 접시에 coverslips을 잠수하십시오. 약 15 분 동안 DI water를 처리 된 표면과 접촉 시키십시오.
- 생체 내에서 DI 수분을 흡입하십시오. 70 % 에탄올로 MEA를 테두리에 채 웁니다. coverslips가 들어있는 페트리 접시에서 탈 이온수를 제거하고 coverslips가 완전히 잠길 때까지 에탄올과 페트리 접시를 채 웁니다. 이것을 10 ~ 15 분 동안 그대로 두십시오.
- MEA ID #, 수술 날짜, 세포 유형 및 머리 글자로 모든 페트리 접시와 컨트롤 접시에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 라벨이 지정된 페트리 접시에 각 MEA를 놓습니다.
- MEA를 개별 페트리 접시에 넣고 진공 흡입을 사용하여 에탄올을 제거합니다. 잔류 에탄올을 제거하기 위해 멸균 DI 물로 MEA를 채 웁니다. 진공 흡입을 사용하여 DI 수를 제거하십시오. MEA가 생체 내에서 공기 건조하게하십시오.
- 50 μg / mL poly-D-lysin 40-70 μL 첨가e (PDL, 고 분자량, 적어도 50 kDa)를 각 MEA의 중심에, 0.2 mL를 무균 피펫 팁을 사용하는 대조군에 투여 하였다.
참고 : 전극이 손상 될 수 있으므로 피펫, 팁으로 MEA의 중앙을 만지지 마십시오. 분배되는 PDL의 정확한 양은 표면의 친수성에 달려있다. - 각 접시에 실험실 휴지의 작은 조각을 놓고 밤새 PDL 증발을 피하기 위해 멸균 물로 적시십시오. 생체에서 제거하기 전에 모든 요리를 다룹니다. 37 ° C 밤새 배양기에 접시를 놓습니다.
- 사용하지 않은 MEA를 플라즈마에 노출시켜 친수성으로 만듭니다. 이것은 처음 사용 후 일반적으로 필요하지 않습니다. 대조 배양에 사용되는 유리 커버 슬립에도 플라즈마 처리가 이루어 지도록하십시오.
- 도금 날.
- 도금 날에, laminin (20 μg / mL)의 1 분액을 녹입니다; 각각의 MEA는 40-50 μL의 라미닌이 필요하며 각 컨트롤 접시에는 0.2 mL의 라미닌이 필요합니다. 사용할 MEA 및 컨트롤의 수에 따라 필요한 라미닌의 양을 계산합니다.
- 인큐베이터에서 모든 요리를 생물학적으로 옮깁니다.
- 모든 MEA를 무균 상태로 채우십시오.탈 이온수는 멸균 된 혈청 피펫을 사용하여 10 ~ 15 분 동안 앉을 수 있습니다. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 DI 물을 흡입하고 두 번 반복합니다.
- 멸균 피펫 팁을 사용하여 제어 플레이트에 각 MEA와 laminin 0.2 ML의 중심에 해동 laminin의 40 - 50 μL를 추가합니다. 생체 내 모든 MEA와 제어 접시를 덮고 37 ° C에서 1 시간 동안 배양기로 옮깁니다.
- 조심스럽게 멸균 파스퇴르 피펫으로 흡입을 사용하여 MEA의 중심에서 과량의 라미닌을 제거하고 도금 전에 표면을 공기 건조시킵니다.
- 생체에 접시를 남기거나 배양기에 놓아 세포를 판에 담을 준비를하십시오.
참고 : 요리는 다음 날까지 인큐베이터에 머물 수 있습니다. 그러나 더 많은 시간이 필요할 경우 접시를 닦고 폴리 -D- 라이신 (PDL) 단계 (단계 2.1.6)부터 다시 시작하는 것이 좋습니다.
3. 배아 제거 및 뇌추출
- L-15 (Leibovitz) 배지를 100 mm 배양 접시 4 개에 붓는다. 그 (것)들을 덮고 -20 ° C 냉장고에서 그 (것)들을 두십시오 매끄러운 견실함이 그러나 언 단단한 고체 (~ 40-60 분)가 없을 때까지.
- 해부하기 전에 약 40 분에서 1 시간을하십시오.
참고 : 이것은 배아와 뇌를 빠르게 냉각 시켜서 견고성을 유지하고 추출시 분해되지 않도록합니다. - 배아 제거를위한 해부 영역을 준비합니다.
- 싱크 근처에 얼음이 든 트레이를 놓고 배아 제거를 위해 수술 도구와 재료를 배치하십시오. 여기에는 차가운 L-15 "수세미"가있는 4 개의 페트리 접시, 70 % 에탄올을 포함한 스프레이 병, 무딘 코 엄지 겸자, 미세 핀셋, 작은 외과 용 가위 및 대형 가위가 포함됩니다 ( 그림 1 ).
- 뇌 추출을위한 해부 영역을 준비합니다.
- 유리 페트리 접시를 놓으십시오얼음으로 가득 찬 쟁반에 앉으세요.
- 종이 수건, 작은 외과 용 가위, 얇은 양단의 주걱, 70 % 에탄올로 채워진 스프레이 병, 시체 처리 용 비닐 봉지 ( 그림 2 ) 등 뇌 추출물을위한 수술 도구와 재료를 배치하십시오.
- 실험실 외투, 안면 마스크 및 장갑을 착용하십시오. 장갑을 포함하여 모든 작업 표면을 70 % 에탄올로 분무하십시오.
참고 :이 방법은 살균 절차가 아니지만 가능하면 오염 가능성을 줄이는 것이 가장 좋습니다. - NIH 지침 16 및 / 또는 실험실 동물의 인간애 보살핌 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책 및 CO 2 질식에 대한 제도적으로 승인 된 동물 관리 및 사용 프로토콜 (IACUC)에 따라 E17 임신 임신 마우스를 안락사하십시오. 공황 또는 디스코 유도를 피하기 위해 3 ~ 5 분 동안 챔버로 천천히 CO 2 가스를 천천히 방출하십시오마우스에 mfort.
- 마우스를 문지르고 종이 타월에 올려 놓으십시오. 하복부에 70 % 에탄올을 뿌리십시오. 작은 외과 용 가위를 사용하여 하복부의 피부와 피하 지방을 통해 V 자 모양으로 절단하고 흉강의 말단부까지 자른 부분을 자궁에 노출시킵니다.
- 겸자를 사용하여 신중하게 배아 사이에 자궁을 들어 올리십시오. 전체 자궁이 자유롭게 될 때까지 절개 가위로 결합 조직을 잘라냅니다. 간혹 혈액을 제거하기 위해 70 % 에탄올로 자궁을 씻어 내고 차가운 L-15로 채워진 4 개의 페트리 접시 중 하나에 넣으십시오.
- 한 쌍의 미세 팁 포셉을 사용하여 자궁과 내부 배아에서 각 배아를 놓습니다. 탯줄이 절단되고 태반이 제거되었는지 확인하십시오. 차가운 L - 15로 가득 찬 두 번째 접시에 해방 된 배아를 놓습니다. 집게와 가위로 배아를 처치하십시오. 집게를 사용하여 세 번째 페트리 접시와 시체로 머리를 전송둘째, 추운 L-15로 가득 차 있습니다.
4. 전두엽 피질 제거
- 생체 내에서 냉장 유리 페트리 접시 단계에 고압 멸균 여과지 쐐기를 둡니다. 여과지에 단일 배아 머리를 놓습니다. 비 지배적 인 손으로 안구 공동을 통해 한 쌍의 포셉을 배치하여 두개골을 잡습니다. 한 쌍의 홍채 가위로 피부와 밑 근육 조직을 제거하십시오.
- 홍채 가위의 하단 깎아 지른 부분을 칼날 바닥에 놓습니다. 뇌에서 멀리 떨어져있는 두개골의 내면에 대해 낮은 층을 유지하면서 후두 판을 잘라 낸 다음 정수리 판 사이의 중간 선을 따라 잘라냅니다. 연골 정면 두개골 판 사이에서 사교적으로 절단을 계속하십시오.
- 후각 판의 중심에서 시작하여 중앙 절단의 왼쪽과 오른쪽에 수직 절단을하십시오.
- 복부 표면 사이에 작은 주걱을 조심스럽게 밀어서 뇌를 제거하십시오.두뇌와 밑바닥 두개골 판이 완전히 뇌 밑에있을 때까지. 주걱을 들어 올리십시오; 전체 뇌가 그대로 나옵니다.
- 뇌가 종이에 달라 붙지 않도록 여과지에 L-15 배지 몇 방울을 놓고 머리를 주걱에서 여과지, 복부 쪽을 가볍게 밀어 넣습니다. 조심스럽게 주걱 끝으로 후각 구를 잘라냅니다.
- 깨끗한 주걱을 사용하여 정면 엽을 사다리꼴 패턴으로 해부합니다. 저장 매체가 들어있는 15 ML 원심 분리기 튜브로 조직을 전송합니다. 나머지 배아와 함께 위의 단계를 반복하십시오. 매번 새로운 쐐기 모양의 여과지를 사용해야합니다 ( 즉, 머리 당 여과지 1 개씩).
5. 세포 해리
- 생체 내에서 표 6 에 열거 된 항목들을 모으십시오.
- 멸균 혈청 피펫을 사용하여 5ml의 DMEM +를 papain의 약병에 첨가하십시오. 데워진 DMEM +를 사용하여 파파인을보다 잘 용해시킬 수 있습니다. 부드럽게피펫으로 용액을 섞는다.
- DNase의 유리 병에 0.5 ML의 DMEM +를 추가하려면 살균 micropipette를 사용합니다. DNase가 전단 변성에 민감하기 때문에 DNase 용액을 만드는 동안 강력한 피펫 팅을 피하십시오.
- 멸균 원심 분리기 튜브에 2.5 ML의 papain 솔루션을 전송하고 같은 튜브에 DNase 125 μL를 추가합니다. 뚜껑이 달린 원심 분리 관을 약 8 번 천천히 뒤집어서 용액을 섞는다.
- 멸균, 넓은 보어 피펫을 사용하여 저장 매체를 포함하는 튜브에서 조직을 제거하고 멸균 35 mm 페트리 접시에 넣으십시오. 가능한 한 작은 매질로 수집하십시오. 조직을 제거하지 않고 가능한 한 많은 여분의 저장 매체를 제거하기 위해 멸균 피펫을 사용하십시오. 조직은 매체에 뜨지 않아야하지만 촉촉해야합니다.
- 조직을 다듬기 위해 두 개의 살균 된 메스 블레이드를 사용하십시오. 페트리 접시에 다진 조직에 DNase / papain 혼합물 2.5 ML을 추가하려면 살균 serological 피펫을 사용합니다. 부드럽게 페트리 접시 소용돌이가 t를 보장하기 위해모자 모든 조직은 용액에서 자유롭고 접시의 바닥에 붙지 않습니다. 15 분 동안 배양기 37 °에 접시를 놓으십시오.
- 생체 내에서 무균의 넓은 구멍 전송 피펫을 사용하여 모든 배지 및 조직을 멸균 된 5 mL 극저온 튜브로 옮깁니다. 동일한 와이드 보어 이송 피펫의 팁을 튜브의 바닥에 가깝게 놓습니다. 부드럽게 천천히 pipetting 위아래로 10-15 번 씹다.
- pipetting 동안 거품을 형성하지 마십시오. 균질 한 혼합물이 얻어 질 때까지 소 구경 이동 피펫을 사용하여이 과정을 반복하십시오. 조직이 해리되지 않은 경우, 1,000 μL 피펫을 사용하여 씹다.
- 해리 된 세포 혼합물에 가온 DMEM 5/5 2 mL를 첨가한다. 원심 분리기 튜브를 생물학적 인 상태로 유지하면서 모자를 씌웁니다. 온화하게 뒤집어 섞는다. 실온 (20 ~ 25 ° C)에서 5 분 동안 약 573 xg로 원심 분리하십시오.
- 생체 내에서 멸균 된 혈청 피펫을 사용하여 모든 상등액을 제거하고 폐기하십시오.작은 공. 멸균 피펫을 사용하여 튜브에 펠렛에 따뜻하게 DMEM 5/5 1 ML을 추가 세포를 다시 일시 중지합니다. 혼합물이 균질해질 때까지 위아래로 부드럽게 pipetting하여 펠렛을 분해하기 위해 멸균 작은 구멍 전송 피펫을 사용합니다.
참고 : 피펫 팅하는 동안 거품을 피하십시오. 아주 적은 조직이 수집되면 DMEM 5/5 0.5 mL 만 넣으십시오. - 생체 내에서 멸균 피펫을 사용하여 세포 현탁액 10 μL를 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다. Biohood의 바깥쪽에 microcentrifuge 튜브에 세포 현탁액 10 μL에 Trypan 블루 10 μL를 추가합니다.
참고 :이 단계에서는 불임이 필요하지 않습니다. - Trypan 파란색 세포 현탁액 10 μL를 일회용 hemocytometer 칩에로드하여 세포를 계산합니다.
6. 도금 세포
- 생체 내에서 무균 micropipette를 사용하여 각 배열과 각 컨트롤 페트리 접시의 중심에 세포 현탁액 50 μL를 전송하십시오. 1 파이 사용접시 당 팁. 배열의 중앙에 정확하게 셀을 놓습니다. 멸균 물로 접시에 있던 실험실 휴지를 다시 젖히거나 각 접시에 새 휴지를 두십시오. 접시를 덮어.
- 3 ~ 4 시간 동안 37 ° C 및 10 % CO 2 로 설정된 배양기에 덮인 페트리 접시를 놓습니다.
- 생체 내에서 온화한 DMEM 5/5 1 mL를 각 MEA에 부드럽게 넣으십시오.
참고 : 매체를 추가 할 때 중앙 배열에서 셀을 씻지 마십시오 (중요!). 아주 조심스럽게, 멸균 micropipette을 사용하여 한 번에 한 방울을 안쪽 가장자리에 추가하십시오. - 각 MEA에 기체 투과성 FEP 막이 들어있는 뚜껑을 놓습니다. 그들을 2 일 동안 창업 보육 센터로 돌려 보내십시오.
참고 : 캡은 오염과 증발을 방지합니다. 무균 기술에 따라 MEA에 넣기 전에 100 % 에탄올로 생체 내 마개를 건조시킵니다. 문화는 생체 내에서 봉쇄되어야하며 항상 덮여 있어야합니다.
7. 메인문화 유산
- 2 일 후 가온 DMEM +를 사용하여 완전 배지 교환을 수행하십시오.
- 너무 오랫동안 문화를 강조하지 않도록 한 번에 인큐베이터에서 생체 기능까지 몇 가지 요리 만 옮겨야합니다.
- 조심스럽게 접시의 내부 벽에 피펫의 끝을 배치하여 접시에서 모든 매체를 꺼내, 중앙에있는 세포를 만지지 않도록 멸균 1-mL micropipette를 사용합니다. 하나의 접시에 하나의 피펫 팁 만 사용하여 오염을 방지하십시오.
- 멸균 된 마이크로 피펫을 사용하여 따뜻한 DMEM + 1 mL를 조심스럽게 분배하고 접시의 안쪽 벽에 피펫 팁을 넣으십시오.
- 위에서 설명한 바와 같이 가온 DMEM +를 사용하여 매주 2-3 회, 사료 공급 사이에는 4 일 이상 동안 50 % 중간 배양을 수행하십시오.
- 멸균 1 ML micropipette를 사용하여 접시에서 매체의 500 μL를 꺼내십시오. 따뜻한 DMEM + 500 μL를 분배하기 위해 멸균 된 마이크로 피펫을 사용하십시오. <</ li>
8. 육안 검사 및 기록
- 현미경으로 접시 샘플을 매일 검사하여 어레이 (4X 및 10X 배율 사용) 및 오염 (배율 20X 사용) (세균 또는 곰팡이 사용)에서 셀 적용 범위를 찾습니다.
참고 : 그림 3a 는 최적의 셀 적용 범위의 예를 보여 주지만 그림 3b 는 낮은 셀 밀도의 culture를 보여줍니다. - 도금 2 주 후, 자발적 활동을위한 MEA 접시의 샘플을 테스트하십시오. 아래에 설명 된대로 3 ~ 5 분 동안 MEA에서 기록하십시오. 활동이 존재하면 스파이크가 탐지됩니다 ( 그림 4 ).
참고 : 조사 할 실험 유형과 가설에 따라 언제 시험을 시작할 것인지 결정하는 것은 실험자의 몫입니다.- MEA에서 활동을 기록하려면 다음 장비를 사용하십시오 : 전원 공급 장치, 증폭기, headstage / preamplifier, 온도 컨트롤러 및 자극 생성기 (재료 표 및 그림 5 참조).
- 배양기에서 배양액을 꺼내기 전에 온도 조절기를 꽂고 전원 공급 장치를 켜서 (제조자의 지침에 따라) 전처리 장치의 가열 된 바닥 판이 35 ° C에 도달하도록 시스템을 켜십시오.
- MEA의 검정색 선이 기준 접지와 잘 정렬되도록 전처리기에 덮개가 열린 배양 물을 놓습니다. 전치 증폭기 핀이 정렬되어 있고, 전치 증폭기의 상단이 고정되어 있고, 배양 캡이 켜져 있는지 확인하십시오.
- 문화가 플레이트에 놓이면 데이터 수집 소프트웨어의 "Change MEA"옵션을 선택 취소하십시오 (소프트웨어 이름 및 사용자 안내서는 자료 표 참조). 또한 녹음을 수행하기 전에 "블랭킹"상자의 선택을 취소하십시오.
- t 후에 "MEA_Select"에서 "다운로드"를 선택하십시오.그는 문화가 시스템에 배치됩니다. 계속하기 전에 프로그램이 "다운로드 확인"을 표시하는지 확인하십시오.
- 소프트웨어 환경에서 "시작"을 눌러 신호를 시각화하십시오. 메인 창에서 "Spikes"→ "Detection"→ "Automatic"을 선택하고 "Std Dev"값을 "5"로 변경하고 "새로 고침"을 클릭하여 임계 값을 재설정합니다.
참고 : "스파이크"창은 임계 값을 초과 한 스파이크를 표시합니다. - 메인 윈도우에서 "Recorder"→ "Recorder"→ "Browse"를 선택하십시오. 경로, 파일 이름을 변경하여 날짜, 시간, 요리 및 실험을 식별하십시오. 시간 제한을 설정하십시오 ( 예 : 5 분). '중지', '기록'및 '재생'을 클릭하십시오. 녹음은 자동으로 멈 춥니 다.
- 자극 소프트웨어를 엽니 다. "레코더"→ "레코더"→ "찾아보기"를 선택하여 파일을 만들고 시간을 설정하십시오전자 한도. 다시 녹음하려면 "중지", "녹음"및 "재생"을 클릭하십시오. 자극에 대한 "다운로드 및 시작"(자극 소프트웨어에서)을 클릭하여 접시에 전달하십시오.
- 요리를 바꾸려면 소프트웨어 컨트롤에서 "MEA 변경"버튼을 선택하십시오.
참고 : 문화 주위에 CO2 대기를 유지하는 시스템이 없으면 한 번에 30 분 이상 인큐베이터에서 배양 물을 꺼내지 마십시오. 녹음 세션이 더 오래 필요하면 시중에서 판매하는 어댑터를 사용하여 CO 2 를 공급하십시오.
9. 교육 네트워크
참고 : 그림 6 은 아래에 설명 된 9.1-9.3 단계의 개요를 보여줍니다.
- 세포 배양에서 자발적인 활동의 5 분 기준선을 기록 (8 단계에서 설명). 일단 기준선이 확립되면, 0.5 Hz의 2 상으로 구성된 5 분 사전 훈련 프로빙 자극을 투여하십시오자극 전극을 선택하는 방법에 대한 자세한 내용은 표 8 의 소프트웨어 설명서를 참조하십시오. 그림 8 과 같이 선택된 자극 전극을 통해 200 μs 펄스 지속 시간 및 900 mV 펄스 진폭 ( 그림 7a )으로 펄스를 생성합니다.
- 사전 트레이닝 자극을 완료하면 프로빙 자극과 동일한 전극을 사용하여 네트워크에 "트레이닝"프로토콜을 적용합니다. 해밀턴 외 ( Hamilton et al. )에 설명 된대로 2 초마다 한 번 고주파 열차를 전달하십시오 . 15 ( 도 7b 및 도 7c ).
참고 : 트레이닝 신호는 40 개의 펄스열로 구성됩니다. 각 펄스 트레인은 펄스 간 4ms, 펄스 지속 시간 200μs 및 펄스 진폭 900mV와 같은 100 개의 2 상 펄스로 구성됩니다. - 훈련 기간을 마친 후, 5 분간의 훈련 후 자극을 세포에 투여하고,사전 훈련 자극과 동일합니다. 사후 훈련 자극이 끝나면 (8 단계에서 설명한대로) 네트워크에서 자극 후 자발적 활동의 5 분을 기록합니다.
- 자연적 변동이나 시스템 비 안정으로 인한 네트워크 반응의 가능한 변화를 설명하기 위해 MEA의 별도 제어 그룹을 사용하십시오. 제어 그룹이 실제 훈련 신호가 관리되지 않는 가짜 훈련 기간을 받는다는 것을 제외하고는, 상기 대조 그룹에 대해 전술 한 것과 동일한 실험 프로토콜을 투여한다.
10. 데이터 분석
참고 : 데이터 파일은 저장되고 나중에 독점적 인 정렬 소프트웨어 (자료 표 참조)를 사용하여 연결 단위로 정렬됩니다. 사용자 정의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)는 장치를로드하고 문화, 인터 버스트 간격, 버스트 지속 시간 및 PSTH (post-stimulus time histogram)에서 활동 패턴을 분석하는 데 사용됩니다 (재료 표 참조). PSTH는 다음과 같습니다.(가변 길이의) bin 크기로 네트워크의 활동을 표시하므로 분석 할 가장 중요한 그래프로, 제시된 자극에 대한 네트워크 응답의 시각적 표현을 제공합니다.
- 독점적 인 분류 소프트웨어 (소프트웨어 이름 및 사용자 안내서는 자료 표 참조)를 사용하여 .mcd 데이터 파일을 .plx 형식으로 변환하십시오. 동일한 프로그램 내에서 .plx 파일을 새로운 .plx 파일로 내 보냅니다. 채널을 연결 단위로 정렬합니다 ( 그림 9 ). 정렬이 완료되면 데이터를 .nex 파일로 내 보냅니다.
- 해당 소프트웨어 ( 재료 표 참조)에서 .nex 파일을 열고 자유롭게 사용할 수있는 맞춤형 GUI로 분석 할 .mat 파일로 저장합니다 ( 재료 표 참조).
참고 : 그래픽 사용자 인터페이스 (재료 표 참조)는 사용자 입력 ( 즉, 모집단 PSTH, 편향 평균 PSTH 또는 개별 채널 P)에 따라 PSTH를 그립니다STH), 자극 실험의 개요와 자극 후 파일과 자극 전 파일의 즉각적인 비교가 가능합니다. 또한 네트워크 응답을 처음 6 개 및 마지막 6 개 자극과 비교하는 초기 PSTH 대 최종 PSTH를 나타냅니다. GUI는 자극 파일 및 자발적인 활동을 가진 파일 모두에 대해 스파이크 속도, 인터 스파이크 간격, 버스트 당 스파이크, 인터 버스트 간격 및 버스트 지속 시간과 같은 몇 가지 다른 기능을 수행합니다. - 먼저, 스파이크 열을 포함하는 변수 및 자극 인공물이 포함 된 변수가있는 .mat 파일을 선택합니다. 스크립트는 데이터를 분석 할 것이고 메인 GUI는 오른쪽에 PSTH 평균 그래프로 나타날 것입니다 ( 그림 10 ).
- 활성 전극 버튼을 클릭하여 평균 PSTH (빨간색)와 비교하여 개별 PSTH (파란색)를 확인합니다.
참고 : 활성 전극은 히트 맵을 표시하기 위해 색상이 지정됩니다. 높은 값 (더 많은 빨간색)은 더 큰 값피크 PSTH 값으로 자극에 대한 강한 반응을 나타냅니다. - 팝업 메뉴를 사용하여 분석 옵션을 선택하십시오. "Biased Average"버튼을 선택하여 전극의 하위 세트를 선택하고 그 하위 세트의 평균을 그립니다. 이 기능은 문화권 내의 하위 네트워크 동작을 비교하는 데 유용합니다.
참고 : 팝업 메뉴를 통해 여러 가지 분석 옵션이 선택되며 소프트웨어의 "도움말"버튼에 설명되어 있습니다. - "그래프 저장"버튼을 선택하면 현재 표시된 그래프를 고해상도의 jpeg 파일로 저장할 수 있습니다. "데이터 표"버튼을 선택하여 데이터를 스프레드 시트로 내 보냅니다.
- 활성 전극 버튼을 클릭하여 평균 PSTH (빨간색)와 비교하여 개별 PSTH (파란색)를 확인합니다.
Representative Results
여기에 제시된 절차를 사용하여 ( 그림 11 ) , E17 마우스 연결 세포로 도금 된 60 채널 MEA를 문화가 세포의 건강한 카페트 ( 그림 12 및 그림 3a ) 에서 배열을 덮을 때까지 배양했습니다. 10 % CO2 및 37 ℃에서 3 주간 배양 한 후, 배양 물을 상업적 기록 시스템 ( 물질 표 참조)을 사용하여 자발적 활성을 확인 하였다. 온도는 연결 관 활동 및 발화 속도에 영향을 미치기 때문에 온도 제어기를 사용하여 기록하는 동안 온도는 37 ° C에서 유지되었습니다.
활동 테스트
자발적으로 활동적인 네트워크는 일반적으로 다양한 신호 패턴을 나타냅니다. 평균적인 활동 문화는약 40 %의 전극. 이러한 활성 전극 사이트 중 거의 절반이 자발적 신호를 등록하며 발화 속도는 5 - 10 Hz입니다. 자발적 활동의 대표적인 래스터 플롯이 그림 4a 에 나와 있습니다. 눈금은 획득 속도 25 kHz 및 300 Hz ~ 3 kHz 사이의 대역 통과 필터 범위에서 20 s 창에서 9 개의 활성 전극으로부터 기록 된 활동 전위의 시간 소인을 나타냅니다. 그림 4b 는 정렬 절차 이전의 8 회의 버스트 활동 동안베이스 라인 노이즈와 필터링 된 원시 세포 외 신호를 보여줍니다. 활동 전위를 노이즈와 분리하기 위해 각 채널의 임계 값은 기준 노이즈의 표준 편차의 5 배로 설정되고 500ms 창에서 계산됩니다 15 .
분석에 앞서, 각 전극에 대해 기록 된 스파이크를 오프라인으로 정렬하여 physiok-means 알고리즘 및 주성분 분석을 사용하여 논리적 활동 및 자극 인공물을 분석합니다. 생리 반응으로 확인 된 신호를 그룹화하여 각 전극에서 집단 반응을 생성했습니다 ( 그림 13 및 그림 9 ) .
전기 자극으로 신경 네트워크 훈련
네트워크는 자극 생성기를 사용하여 MEA 전극을 통해 직접 문화에 적용된 전기 자극을 사용하여 훈련되었습니다 (재료 표 참조). 이 대표 결과 세트에서 13 개의 전극으로 구성된 "L"모양의 구성이 사용되었지만 ( 그림 8 ), 많은 다른 구성을 적용 할 수 있습니다. 프로빙 및 트레이닝 자극은 Ruaro et al. 14 .
기저선은 자극 전에 자발적 활동을 5 분간 기록함으로써 초기에 설정되었다. 일단 기준선이 확립되면, 200 μs의 펄스 지속 시간 및 900 mV의 펄스 진폭을 갖는 0.5 Hz의 2 상 펄스로 구성된 5 분 사전 훈련 프로빙 자극 ( 도 7a )이 선택된 자극 부위 ( 즉, "L" 모양). 트레이닝 프로토콜은 동일한 전극 세트를 사용하여 매 2 초마다 네트워크에 관리되었습니다. 트레이닝 신호는 펄스 폭이 4 ms, 펄스 지속 시간이 200 μs, 펄스 진폭이 900 mV 인 40 개의 펄스 트레인으로 구성되어있다 ( 그림 7b 및 그림 7c ). 이 훈련 기간은 훈련 전 자극과 유사하게 5 분간의 훈련 후 단계로 이어졌다. 프로토콜은 그 때이었다자극 후 자발적 활동의 5 분 기록으로 결론 지었다.
동일한 실험 프로토콜을 대조군 그룹에 적용하여 네트워크 반응의 자연적인 변동을 설명했습니다. 그러나 제어 프로토콜의 유일한 차이는 실제 훈련 신호가 관리되지 않은 가짜 훈련 기간의 적용이었습니다.
데이터 세트의 통계 분석 ( 즉, 훈련 대 제어)은 one-way ANOVA로 변수 "training"을 대상 요소로 사용하여 수행되었습니다. 대기 시간은 주제 내 요소로 사용되었습니다. 중요한 상호 작용이 발견되면 Tukey의 사후 절차가 수행됩니다. 결과는 자극 후 20 ms 이내에 사전 훈련 반응을 보여 주었지만 활동 범위는 첫 번째 반응 이후에 일관성이 없었습니다. 그러나, 훈련 후 활동은 ar (pre-training) 동안 보여지는 것처럼, 자극 후 30-50 ms에 상당한 활성을 보였다 ( 그림 14 및 그림 15 ) 15 . 또한 "스파이크 빈도"대 "자극 후 시간"과 "스파이크 신뢰성"대 "자극 후 시간"의 통계적으로 유의미한 상관 관계가있었습니다. "스파이크 신뢰성"은 각 자극에 대한 응답에 최대 값 1이 할당 된 자극에 대한 네트워크 응답을 볼 확률로 정의 할 수 있습니다. 그림 16 은 스파이크 빈도가 거의 50 % 증가한 것을 보여줍니다. 자극 후 20-50 ms의 범위에서 훈련 대비 훈련 된 네트워크의 스파이크 신뢰성이 -50 % 증가합니다. 이러한 결과는 교육이 네트워크 역학을 근본적으로 변화 시켰음을 나타냅니다.
1 "class ="xfigimg "src ="/ files / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/>
그림 1 : 태아 제거에 사용되는 도구 및 재료. ( A ) 얼음이 담긴 트레이. ( B ) 차가운 L-15 "진창으로 가득 찬 페트리 접시." ( C ) 종이 타월. ( D ) 70 % 에탄올을 포함하는 스프레이 병. ( E ) 미세 포셉 (X2). ( F ) 작은 외과 용 가위. ( G ) 무딘 엄지 포 셉. ( H ) 큰 가위. ( I ) 몸 가방. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 두뇌 추출에 사용되는 도구와 재료. ( A B ) 배아 머리가 들어간 배양 접시. ( C ) 저장 매체가있는 호일로 덮인 원심 분리 관. ( D ) 거꾸로 된 유리 페트리 접시. ( E ) 오토 클레이브 된 여과지. ( F ) 70 % 에탄올을 넣은 비이커. ( G ) 플라스틱 피펫. ( H ) 아이리스 가위. ( I ) 미세 포셉. ( J ) 얇은 양단의 주걱. ( K ) 종이 타월. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 최적 대 최적 배양액 대 최적 배양액. ( A )는 ( B )와는 대조적으로 어레이를 덮고있는 건강한 카펫을 보여줍니다.빈약 한 세포 증식이있는 곳. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 자발적인 활동의 대표 결과. ( A ) 자발적 활동의 대표적인 래스터 그림. 눈금은 25 kHz의 획득 속도와 3 kHz와 300 Hz 사이의 대역 통과 필터 범위에서 20 초 동안 9 개의 활성 전극에서 기록 된 활동 전위를 나타냅니다. ( B ) 활성 사이트에서 대표적인 필터링 된 세포 외 활동 잠재력. 참고 문헌 15 에서 수정 된 그림. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의 n.
그림 5 : 녹음 설정. ( A ) 자극 생성기. ( B ) 온도 조절기. ( C ) 전원 공급 장치. ( D ) 증폭기. ( E ) 무대 / 전치 증폭기. ( F ) 모자이크 된 MEA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 전기 교육 프로토콜의 도식적 표현. 5 분 동안 초기 기준선을 기록하고 3 분 동안 프로브 자극을 기록하십시오. 유독 한 자극을 적용하십시오 90 초 동안 켜져 있고 녹음되지 않았다. 3 분 동안 두 번째 프로브 자극과 5 분 동안 최종 기준선을 적용하고 기록하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 자극 및 훈련 신호 매개 변수 탐색. ( A ) 프로빙 자극은 0.5 Hz의 주파수에서 투여 된 ± 900 mV 2 위상 펄스로 구성됩니다. ( B ) 펄스 열은 250 Hz의 주파수에서 100, ± 900 mV 2 위상 펄스로 구성됩니다. ( C ) 훈련 신호는 2 초마다 40 펄스 열차로 구성됩니다. 참고 문헌 15 에서 수정 된 그림."_blank">이 그림의 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : "L"자 모양 구성의 표현. 사각형은 MEA의 개별 전극을 나타냅니다. 파란색 사각형은 자극에 사용되는 전극을 나타내지 만 다른 모든 것은 녹음에 사용됩니다. 참고 문헌 15 에서 수정 된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 : 소음 및 자극 인공물에서 단위 구분. 여러 개의 상부 패널 ( A -
그림 10 : 자극 후 시간 히스토그램 (PSTH). 그래픽 사용자 인터페이스 ( Materials Table 참조)는 사용자 입력 ( 즉, 모집단 PSTH, 편향된 평균 PSTH 또는 개인에 따라 PSTH를 나타냅니다.채널 PSTH)를 사용하여 자극 실험의 개요와 사후 자극 파일을 즉시 비교할 수 있습니다. 또한 초기 PSTH 대 초기 PSTH를 나타냅니다. 이것은 네트워크 반응을 처음 6과 마지막 6 자극과 비교합니다. GUI는 자극 파일 및 자발적인 활동을 가진 파일 모두에 대해 스파이크 속도, 인터 스파이크 간격, 버스트 당 스파이크, 인터 버스트 간격 및 버스트 지속 시간과 같은 몇 가지 다른 기능을 수행합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11 : 셀 준비 및 도금 개요. ( A ) 임신 한 E17 마우스를 CO2로 안락사시켰다. ( B ) 마우스가 decapitat이다.자궁이 제거됩니다. ( C ) 배아가 풀려나고 목이 베였습니다. ( D ) 각 배아에서 뇌를 추출하고 전두엽을 제거한다. ( E ) 세포가 해리된다. ( F ) 해리 된 세포를 배지에 현탁시킨다. ( G ) 부유 세포는 60 채널 다중 전극 배열 (MEAs)에 도금됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 12 : Microelectrode 배열에 도금되는의 연결 문화. 배아 마우스 뉴런은 각 채널에서 네트워크를 통해 신경 세포 활동을 동시에 기록 할 수있는 60 채널 MEA에 도금되어 있습니다. (수정 된 그림참고 문헌 15 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 13 : 각 채널의 파형을 정렬하는 데 사용되는 프로그램 정렬. 정렬 프로그램 ( Materials Table 참조)은 데이터 파일을로드하고 각 채널에 대해 처음 획득 한 모든 유닛을 표시합니다. 특정 유닛에 신호를 할당하기 위해 여러 가지 방법 중 하나가 선택됩니다. 이 예에서 k-means 클러스터링 알고리즘이 선택되고 노란색 창 (하단 창의 "단위 a"라고 표시됨)이 식별되었습니다. 그런 다음 다른 프로그램 ( Materials Table 참조)을 사용하여 .nex 파일을 .mat 파일로 내 보냅니다.이 파일은 사용자 정의 GUI의 입력 파일입니다 (
그림 14 : 교육 기간 후 자극에 대응하여 변경된 네트워크 활동 8 전극의 활성 래스터 플롯. 수직선은 자극의 시간을 나타내고, 검은 눈금은 활동 전위를 나타냅니다. 사전 훈련 ( A )에서는 채널을 통한 자극 펄스에 즉각적인 반응이 있습니다. 사후 훈련 ( B )에서, 네트워크는 자극에 대한 즉각적인 반응뿐만 아니라 더 긴 활동 반응을 나타낸다..jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 15 : 훈련 된 네트워크는 스파이크 주파수를 대폭 변경했습니다. 제어 네트워크에 대한 네트워크 스파이크의 빈도는 각 자극 직후 50ms 이상의 스파이크 수를 통합하고 해당 기간으로 나누어 계산합니다. 훈련 된 12 개의 제어 네트워크와 평균 10 개의 제어 네트워크의 평균을 보여줍니다 (오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냄). 별표 (*)는 두 데이터 집합 간의 통계적 차이 ( p 값 <0.05)를 나타냅니다. 참고 문헌 15 에서 수정 된 그림. lar를 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의 게르 버전.
도표 16 : 훈련되는 네트워크에서 Synaptically 중재 응답은 두드러지게 수정됩니다. ( A ) 10 ms 빈에서 측정되고 제어 네트워크로 정상화 된 스파이크 신뢰성은 전극 근처의 뉴런의 직접 활성화 (0-20 ms)에 대한 변화를 나타내지 않습니다. 그러므로 제어 장치와 훈련 된 네트워크 사이에는 통계적으로 차이가 없습니다. 반면에, 긴 대기 시간 응답 (30-50 ms)은 시냅스에 의해 매개되며,이 방법은 위의 그림 15 에서보다 더 자세한 신뢰성 조사를 제공함을 나타냅니다. ( B ) 모집단 스파이크 빈도는 신뢰성의 거동을 반복하고 직접 활성화 (0-20 ms)에 대한 수정을 나타내지 않는 반면, 통계이론적으로 유의 한 차이가 장기 반응 (30-50 ms)에서 발견됩니다. 이 동작은 이전 그림 15 의 평균 결과와 일치합니다. 오류 막대는 10 개의 제어 네트워크와 12 개의 훈련 된 네트워크에 대해 계산 된 평균의 표준 오차입니다. (*) p- 값 <0.05; (**) p- 값 <0.001. 참고 문헌 15 에서 수정 된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 수량 | 목 |
| 1 | 오토 클레이브 유리 시약 병 (최소 100 mL 크기) |
| 20 | 15 mL 멸균 원심 분리 튜브 |
| 1 | 10 ML 멸균 serological 피펫 |
| 4 | 25 mL 멸균전자 혈청 피펫 |
| 2 | 50 ML 멸균 serological 피펫 |
| 1 | 튜브 랙 원심 분리기 |
| 150 mL | 멸균 DI 수 |
| 5 mg | 폴리 -D- 라이신 바이알 |
표 1 : PDL 준비 - 재료 및 시약 목록.
| 수량 | 목 |
| 1 | 50 mL 멸균 원심 분리 튜브 |
| 10 | 15 mL 멸균 원심 분리 튜브 |
| 2 | 1 ML 멸균 혈청 피펫 |
| 2 | 50 ML 멸균 serological 피펫 |
| 1 | 튜브 랙 원심 분리기 |
| 1 mL | 인산염완충 생리 식염수 (PBS) |
| 1 mg | 라미닌 |
표 2 : 라미닌 준비 - 재료 및 시약 목록.
| 수량 | 목 |
| 1 | 오토 클레이브 유리 시약 병 (최소 100 mL 크기) |
| 20 | 15 mL 멸균 원심 분리 튜브 |
| 1 | 10 ML 멸균 serological 피펫 |
| 4 | 25 mL 멸균 혈청 피펫 |
| 2 | 50 ML 멸균 serological 피펫 |
| 1 | 튜브 랙 원심 분리기 |
| 150 mL | 멸균 DI 수 |
| 5 mg | 폴리 -D- 라이신 바이알 |
표 3 : 저장 매체 준비 - 재료 및 시약 목록 표 3 : 저장 매체 준비 - 재료 및 시약 목록.
| 수량 | 목 |
| 44 mL | 안정화 된 L- 글루타민 형태의 DMEM (물질 표 참조) |
| 1 mL | 신경 세포 배양을위한 무 혈청 보충제 (물질 표 참조) |
| 2.5 mL | 말 혈청 |
| 100 μL | 아스 코르 빈산 [4 mg / mL] |
| 2.5 mL | 태아 소 혈청 (FBS) |
| 0.5 mL | 펜 strep (선택 사항) |
| 1 | 50 mL 멸균 원심 분리 튜브 |
| 2 | 25 mL 멸균 혈청 피펫 |
| 2 | 10 ML 멸균 혈청 피펫 </ td> |
| 2 | 1 ML 멸균 혈청 피펫 |
| 1 | 250 mL 필터 |
표 4 : DMEM 5/5 배지 준비 - 재료 및 시약 목록.
| 수량 | 목 |
| 49 mL | 안정화 된 L- 글루타민 형태의 DMEM (물질 표 참조) |
| 1 mL | 신경 세포 배양을위한 무 혈청 보충제 (물질 표 참조) |
| 100 μL | 아스 코르 빈산 [4 mg / mL] |
| 0.5 mL | 펜 strep (선택 사항) |
| 1 | 50 mL 멸균 원심 분리 튜브 |
| 2 | 25 mL 멸균 혈청 피펫 |
| 2 | 1 ML 멸균 혈청 피펫 |
| 1 | 250 mL 필터 |
표 5 : DMEM + 배지 준비 - 재료 및 시약 목록.
| 수량 | 목 |
| 1 | 파파인 140 U / 바이알 |
| 1 | 1,260 U / 바이알 |
| 7 mL | DMEM + (냉각 된) |
| 5 mL | DMEM 5/5 (예열 됨) |
| 10 μL | 트리 판 블루 |
| 2 | 메스 블레이드 |
| 1 | 35mm 무균 배양 접시 |
| 4 | 15 mL 멸균 원심 분리 튜브 |
| 2 | 5 mL 멸균 극저온 튜브 |
| 2 | 2 mL 멸균 극저온 튜브 |
| 1 | 50 mL 멸균 원심 분리 튜브 |
| 1 | 미세 원심 분리 관 |
| 2 | 대형 보어 이송 피펫 |
| 삼 | 소형 보어 이송 피펫 |
| 5 | 2 ML 멸균 serological 피펫 |
| 5 | 1 ML 멸균 혈청 피펫 |
| 2 | 10 μL 멸균 micropipette 도움말 |
| 1 | 무균 마이크로 피펫 팁 1000 μL |
| 1 | 혈구계 칩 |
표 6 : 세포의 해리 - 재료 및 시약 목록.
Discussion
이 프로토콜에 설명 된 단계는 초보자가 MEA에서 자신의 연결 문화를 판명하고 네트워크 활동을 기록 할 수 있도록 충분한 세부 정보를 제공합니다. 이 프로토콜은 문화가 전극 배열 위에 세포의 양탄자 층을 형성하고, 건강을 유지하고 몇 달 동안 오염 물질이 없도록 적절하게 부착하는 것을 보장합니다.
프로토콜의 모든 부분을 준수하는 것이 가장 좋지만 성공적인 결과에 중요한 단계가 프로세스 전반에 걸쳐 있습니다. 배양 물이 오염되는 것을 막기 위해서는 전체 공정에 걸쳐 무균 기술을 사용해야합니다. 프로토콜에 설명 된대로 새로운 MEA를 친수성으로 만들어야합니다. 그렇지 않으면 세포 접착력이 떨어집니다. 가혹한 피펫 팅을 피하고 해리 중에 공기 방울이 형성되면 손상된 세포의 수가 줄어들어 더 높고 더 건강한 수율로 이어질 것입니다. 첫 번째 이후 DMEM 5/5에서 DMEM +로 전환먹이는 것도 중요합니다. DMEM 5/5에는 말 혈청이 포함되어있어 지속적으로 사용하면 신경 교세포가 배양을 지배하게되어 문화가 건강 해 보일지라도 열악한 신경 세포 활동을 초래합니다. 예정대로 배양액을 공급하고 적절한 배양 조건에서 배양하는 것도 중요합니다.
MEA에서 세포 배양 판을 만드는 것은 최적의 결과가 아닌 결과를 가져올 수있는 많은 변수를 포함합니다. 목표가 세포의 완벽한 "양탄자"이지만, 위에 언급 된 중요한 단계를 해결하지 못하면 세포 성숙이 불량 해지거나 오염 될 수 있습니다. 가난한 세포 성숙과는 다른 세포 접착력이 나쁘다는 것도 관심사입니다. 이것은 도금 이전의 불량한 MEA 준비 또는 오래된 매체의 사용을 포함하는 여러 요인들로 인해 발생할 수 있습니다. 안정화 된 형태의 L- 글루타민과 혈청이없는 신경 세포 배양액을 함유 한 오래된 배지 ( 물질 표)가 사용되면, 세포는 처음에 붙지 만 약 2 주 후에 떠 다니게됩니다. 세균 오염이 지속적으로 문제가된다면 암피실린이나 펜 렙틴과 같은 항생제를 배지에 첨가 할 수 있습니다. 곰팡이 오염을 치료할 수있는 살균제도 있습니다. 이것들은 문화적 결과에 영향을 줄 수있는보다 일반적인 변수입니다. 시간과 경험 후에 만 만날 수있는 많은 다른 것들이 있습니다.
유리 미세 전극의 사용과 비교하여,이 기법은 네트워크 역학 및 약리학 적 반응을 연구하는데 탁월합니다. 그것은 많은 다른 시공간 자극 패턴의 사용을 가능하게하고 동시에 여러 영역에서의 신경 반응을 기록 할 수있게합니다. 이전 그룹은 여기에 설명 된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 흥미로운 결과를 보여주었습니다 18 . 문화가 몇 주 또는 몇 달 동안 지속되고 동일한 문화가 재사용 될 수 있기 때문에이 기술은 또한동일한 네트워크에서 여러 실험을 반복합니다.
그러나이 기술에는 한계가 있습니다. MEA는 비 침습적입니다. 따라서 패치 클램핑이나 피펫을 사용한 세포 내 기록과는 달리 세포 외 활동 만 기록 할 수 있습니다. 또한, 배열의 각 전극은 여러 개의 세포로 덮여 있기 때문에 단일 뉴런의 활동을 해결할 수 없습니다. 반대로 이것들은 시험 관내 배양 물이기 때문에 뇌에서의 네트워크의 구조적 특성을 완전히 재현 할 수는 없습니다. 또한, 세포가 pH 균형을 유지할 수 있도록 CO 2 대기를 제공하는 메커니즘없이 한 번에 30 분 이내에 만 활동을 기록 할 수 있습니다.
일단이 기술이 숙달되면, 전기 자극이 있거나없는 약리학 적 조작이 탐구 될 수 있습니다. 뉴런 네트워크에서 학습과 기억 형성을 탐색하기위한 새로운 프로토콜을 설계하고 테스트 할 수 있습니다.hippocampal 또는 척수 네트워크에 대한 rotoci. 네트워크의 자극과 훈련을위한 프로토콜은 이미 발표되었으며, 그 중 일부는 Eytan et al.이 제안한 "선택적 적응"과 같은 생체 내 프로토콜로 추가 개발 되었다. 19 . 여러 프로토콜이 테스트되었습니다. 그러나 2005 년 루아로 (Ruaro)가 제안한 파상풍 치료법을 수정 한 결과 만이 여기에 제시되어있다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 보조금 CMMI - 1300007에 의해 재정 지원되었다. 우리는 조지 메이슨 대학교 (George Mason University)에서 이러한 프로토콜의 설계 및 문화 유지에 도움을 주신 이전 연구원들에게 감사드립니다. Joseph J. Pancrazio 박사, Hamid Charkhkar 박사, Gretchen Knaack 박사 , Franz Hamilton 박사, Michael Maquera 박사, Robert Graham 박사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4 mg/mL aliquots |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
| Beakers - glass - 100 mL | VWR | 13912-160 | |
| Beakers - glass - 500 mL | VWR | 10754-956 | |
| Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
| Cryogenic vial - sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Cryogenic vial - sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
| DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
| DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
| Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
| Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
| GlutaMAX -- I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
| Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
| Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
| Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
| MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
| MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
| MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
| MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
| MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
| MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
| Media storage bottle - glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
| Micropipette tips - 10 μL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
| Micropipette tips - 1,000 μL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
| Micropipette tips - 200 μL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
| Micropipetter - 10 μL | Thermo Fisher | 4641170N | |
| Micropipetter - 1,000 μL | Thermo Fisher | 4641210N | |
| Micropipetter - 200 μL | Thermo Fisher | 4641230N | |
| Papain - 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
| Petri dishes -100 mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes -100 mm glass | VWR | 10754-788 | |
| Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| Phosphate buffer saline (PBS) (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
| Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
| Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
| Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
| Scissors - iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
| Scissors - large | World Precision Instruments | 14214 | |
| Scissors - small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
| Serological pipette - sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
| Serological pipette - sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Serological pipette - sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
| Serological pipette - sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
| Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
| Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
| Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
| Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
| Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
| Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
| Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
| Spatula - small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
| Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
| Transfer pipette - large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
| Transfer pipette - small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
| Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |
References
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