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Neuroscience

माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ पर न्यूरोनल सेल संस्कृतियों की उत्तेजना के लिए नेटवर्क रिस्पांस में समय पर निर्भर वृद्धि

Published: May 29, 2017 doi: 10.3791/55726
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Krasnow Institute for Advanced Study, George Mason University, 2Neural Engineering, Bioengineering, George Mason University, 3Neural Engineering, Computer Science, George Mason University, 4Electrical and Computer Engineering, George Mason University

Summary

मल्टी-इलेक्ट्रोड एरे पर सुसंस्कृत माउस न्यूरॉनल कोशिकाओं विद्युत उत्तेजना के बाद प्रतिक्रिया में वृद्धि दर्शाती हैं। यह प्रोटोकॉल कैसे संस्कृति न्यूरॉन्स, कैसे गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए, और उत्तेजना के पैटर्न का जवाब करने के लिए नेटवर्क को प्रशिक्षित करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए कैसे दर्शाता है।

Abstract

माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ (एमईए) का इस्तेमाल दवा की विषाक्तता, अगली पीढ़ी के व्यक्तिगत मेडिसिन के लिए डिजाइन मानदंडों और न्यूरोनल संस्कृतियों में नेटवर्क गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। पैच-क्लैंपिंग जैसे पारंपरिक तरीकों के विपरीत, जो केवल एक सेल से गतिविधि को रिकॉर्ड कर सकता है, विदेश मंत्रालय प्रत्येक नेटवर्क पर एक से कई साइटों से एक साथ रिकॉर्ड कर सकते हैं, बिना प्रत्येक इलेक्ट्रोड को अलग-अलग रखने का कठिन काम किए बिना। इसके अलावा, कई नियंत्रण और उत्तेजना विन्यास को आसानी से एक ही प्रयोगात्मक सेटअप में लागू किया जा सकता है, जिससे पता लगाया जा सकता है कि गतिशीलता की एक व्यापक श्रेणी की अनुमति है। इन इन विट्रो अध्ययनों में दिलचस्पी की मुख्य गतिशीलता में से एक यह है कि किस सुसंस्कृत नेटवर्क में गुण प्रदर्शित होता है जो सीखने का संकेत मिलता है। विदेश मंत्रालय द्वारा सुसंस्कृत माउस न्यूरॉनल सेल, विद्युत उत्तेजना से प्रेरित प्रशिक्षण के बाद प्रतिक्रिया में वृद्धि दर्शाते हैं। यह प्रोटोकॉल इस बात को दर्शाता है कि विदेश मंत्रालय की संस्कृति न्यूरॉनल कोशिकाएं कैसे हैं; सफलतापूर्वक पुनःमढ़वाया व्यंजन का 95% से अधिक कॉर्ड; उत्तेजना के पैटर्न का जवाब देने के लिए नेटवर्क को प्रशिक्षित करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करें; और इस तरह के प्रयोगों के परिणामों को सॉर्ट, प्लॉट, और व्याख्या करते हैं। उत्तेजक और न्यूरोनल संस्कृतियों के रिकॉर्डिंग के लिए एक स्वामित्व प्रणाली का उपयोग किया जाता है। सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग न्यूरोनल इकाइयों को क्रमबद्ध करने के लिए भी किया जाता है एक कस्टम-डिज़ाइन ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस का प्रयोग पोस्ट-प्रेसिजन टाइम हिस्टोग्राम, इंटर फॉस्ट अंतराल, और फट अवधि के साथ-साथ प्रशिक्षण प्रोटोकॉल के पहले और बाद में उत्तेजना के सेलुलर प्रतिक्रिया की तुलना करने के लिए किया जाता है। अंत में, इस अनुसंधान प्रयास के प्रतिनिधि परिणाम और भविष्य के दिशा-निर्देशों पर चर्चा की जाती है।

Introduction

माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ (एमईए) का उपयोग दवा की विषाक्तता, अगली पीढ़ी के व्यक्तिगत मेडिसिन के लिए डिजाइन मानदंडों और न्यूरोनल संस्कृतियों में अध्ययन नेटवर्क गतिशीलता 1 के लिए किया जा सकता है । पैच-क्लैंपिंग जैसे अधिक पारंपरिक तरीकों के विपरीत, जो केवल एक सेल से गतिविधि को रिकॉर्ड कर सकता है, या एक गिलास विंदुक के साथ क्षेत्रीय रिकॉर्डिंग को रिकॉर्ड कर सकता है, जो कि एक ही साइट पर इलेक्ट्रोड के न्यूरॉन्स से बाहरी प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड कर सकता है-MEAs एक साथ प्रत्येक इलेक्ट्रोड को व्यक्तिगत रूप से रखने के कठिन काम की आवश्यकता के बिना सेल संस्कृति में कई साइटों से रिकॉर्ड। इससे उस संस्कृति के भीतर एक नेटवर्क बनाने वाली कोशिकाओं के समूह के बीच गतिशील परस्पर क्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुमति मिलती है। इसके अलावा, नेटवर्क फायरिंग पैटर्न 2 , 3 , 4 , 5 और नेटवर्क नियंत्रण 6 < पर इलेक्ट्रिकल उत्तेजना के प्रभाव/ Sup> neuronal संस्कृतियों में अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, और बिजली उत्तेजना और नियंत्रण के कई विन्यास आसानी से एक ही प्रयोगात्मक सेटअप के भीतर लागू किया जा सकता है, जिससे पता लगाया जा सके कि स्थूल-अस्थायी गतिशीलता की एक विस्तृत श्रृंखला की अनुमति दी जा सकती है।

इन इन विट्रो अध्ययनों में दिलचस्पी की प्रमुख गतिशीलता में से एक यह है कि किस सुव्यवस्थित नेटवर्क में प्रदर्शित गुण 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 का संकेत मिलता है। Peixoto लैब ने पहले उच्च आवृत्ति प्रशिक्षण संकेतों के प्रभाव की जांच की, जैसा कि रूरो एट अल में वर्णित है 14 , माउस न्यूरॉन्स के नेटवर्क पर, माइक्रोइलेक्ट्रोडेड एरे 15 पर चढ़ाया गया इन प्रयोगों में, नेटवर्क ने प्रतिक्रिया के बाद में वृद्धि को प्रदर्शित कियाविद्युत उत्तेजना द्वारा प्रेरित जी प्रशिक्षण वृद्धि की प्रतिक्रिया उत्तेजना मान्यता के माध्यम से सीखने का एक रूप माना जाता था, जिससे नेटवर्क विशिष्ट उत्तेजना ( यानी, प्रशिक्षण) प्रोटोकॉल के आवेदन के बाद उत्तेजना में बदलाव के लिए एक सुसंगत तरीके से जवाब दिया।

इस प्रोटोकॉल में यह दर्शाता है कि विदेश मंत्रालय के संस्कृति तंत्रिका कोशिकाएं 95% से अधिक मढ़वाया व्यंजनों से सफलतापूर्वक रिकॉर्ड करती हैं, नेटवर्क को उत्तेजना के पैटर्न पर प्रतिक्रिया देने के लिए एक एकल प्रोटोकॉल की स्थापना करती है, एकल एकल इकाई की गतिविधि, साजिश हिस्टोग्राम सॉर्ट करता है, और परिणामों से व्याख्या करता है ऐसे प्रयोग न्यूरोनल संस्कृतियों के उत्तेजना और रिकॉर्डिंग के लिए एक स्वामित्व प्रणाली का उपयोग (सामग्री की तालिका देखें), साथ ही साथ न्यूरॉनल इकाइयों को सॉर्ट करने के लिए सॉफ़्टवेयर संकुल के आवेदन (सामग्री की तालिका देखें) का प्रदर्शन किया जाता है कस्टम-डिज़ाइन ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस (देखें सामग्री की सारणी ) का उपयोग पोस्ट-एस को देखने के लिए किया जाता हैसमयबद्ध हिस्टोग्राम, अंतर-फट अंतराल, और फट अवधि, साथ ही एक प्रशिक्षण प्रोटोकॉल से पहले और बाद में उत्तेजना के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया की तुलना करना

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाएं एनआईएच दिशानिर्देशों और / या मानव स्वास्थ्य देखभाल नीति और मानव स्वास्थ्य देखभाल प्रयोगशाला प्रयोगशालाओं का पालन करती हैं और जॉर्ज मेसन विश्वविद्यालय में संस्थागत रूप से अनुमोदित पशु देखभाल और उपयोग (आईएसीयूसी) प्रोटोकॉल के तहत हैं।

1. सामग्री तैयार करना

  1. निम्नलिखित सामग्री आटोक्लेव करें: 5.75 इंच लंबे गिलास पिपेट्स (2) 500 मिलीलीटर बीकर में खड़ी व्यवस्था की जाती है, फिल्टर पेपर के लगभग 24 टुकड़े (150 मिमी व्यास, प्रत्येक को 8 पट्टियों में काटा जाता है; ताकना आकार कोई फर्क नहीं पड़ता), 1,000 μL फ़िल्टर्ड विंदुक युक्तियाँ, 200 μL फ़िल्टर्ड विंदुक युक्तियाँ, 10 μL फ़िल्टर्ड विंदुक युक्तियाँ, और डी-आयनित (डीआई) वाश के लिए पानी (कम से कम 200 एमएल)।
  2. अभिकर्मकों और मीडिया को तैयार करें
    1. सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग कर जैव-हेथ में सभी अभिकर्मकों और मीडिया तैयार करें।
    2. तालिका 1 के अनुसार पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल) तैयार करें
      1. एक अंतिम सी के लिए बाँझ डि पानी के साथ पीडीएल मिलाएं50 माइक्रोग्राम / एमएल का एकाग्रता निम्नानुसार है। एक आटोक्लेव ग्लास अभिकर्मक की बोतल में 96 एमएल बाँझ डि पानी को स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ सीरमिक विंदुक का प्रयोग करें।
      2. पीडीएल युक्त निर्माता शीशी को 4 एमएल बाँझ डि पानी जोड़ने के लिए एक बाँझ सीरमिक विंदुक का प्रयोग करें। Pipetting द्वारा पीडीएल भंग। पीडीएल समाधान को कांच अभिकर्मक की बोतल में बाँझ डीआई पानी के 96 एमएल युक्त स्थानांतरण करने के लिए उसी पिपेट का प्रयोग करें।
      3. बोतल कसकर इसे जैववस्था और भंवर समाधान से हटाने से पहले कसकर कैप करें। जैववस्था में, समाधान को 5-एमएल अलोकॉट्स में विभाजित करें; -20 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी अप्रयुक्त समाधान को फ्रीज करें थक्के हुए पीडीएल को एक बार फिर से जमे हुए किया जा सकता है। अगर पहले पुन: जमी हुई हो तो thawed समाधान त्यागें।
    3. तालिका 2 के अनुसार लमिनिन समाधान तैयार करें
      1. पीबीएस के साथ 20 माइक्रोग्राम / एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के साथ लमिनिन मिलाएं, इस प्रकार निम्नानुसार है। 49 एमएल की पीबीएस को 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ सीरमिक विंदुक का प्रयोग करें।
      2. एक बाँझ serologica का उपयोग करेंएल पिपेट को निर्माता की शीशी में पीबीएस के 1 एमएल को जोड़ने के लिए लेमिनिन का उचित वजन होता है। Pipetting द्वारा laminin भंग। 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब को पीबीएस के 49 एमएल युक्त laminin समाधान के हस्तांतरण के लिए एक ही विंदुक का प्रयोग करें।
      3. ट्यूब को कसकर जैववस्था और भंवर से निकालने से पहले इसे कैप करें। जैववस्था में, 5 एमएल अलोकॉट्स में समाधान विभाजित करें; -20 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी अप्रयुक्त समाधान को फ्रीज करें थक्केदार लमिनिन को फिर से जमी नहीं किया जा सकता है; किसी अप्रयुक्त थका हुआ समाधान को त्याग दें
    4. तालिका 3 के अनुसार भंडारण माध्यम तैयार करना
      नोट: भंडारण माध्यम का उपयोग परिवेश सीओ 2 स्तरों पर एक महीने तक के ऊतकों को संग्रहीत करने के लिए किया जाता है। इसे खरीदा जा सकता है (सामग्रियों की सारणी देखें), या इसे सामान्य नुस्खा का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है: परिवेशी सीओ 2 सेल स्टोरेज मध्यम + 2% तंत्रिका सेल संस्कृति के लिए सीरम मुक्त पूरक + 0.5 एमएम सेल संस्कृति माध्यम जिसमें एक स्थिर एल-ग्लुटामाइन का रूप (सामग्री की तालिका देखें)।
      1. 10 मिलीलीटर का भंडारण माध्यम बनाने के लिए, CaCl 2 के बिना भ्रूणीय ऊतक के लिए 10 एमएल का भंडारण माध्यम 15 से एमएल असंतुलन ट्यूब में स्थानांतरित करें। तंत्रिका सेल संस्कृति के लिए 210 μL सीरम मुक्त पूरक और एल ग्लूटामाइन का एक स्थिर रूप का 55 μL जोड़ें। व्युत्क्रम से धीरे-धीरे मिलाएं
      2. जैसा कि भंडारण माध्यम हल्का-संवेदनशील है, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ 15-एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों को कवर करके इसे सुरक्षित रखें। कुल 5 अल्लोकोट्स के लिए प्रत्येक ट्यूब के लिए भंडारण माध्यम के 2 एमएल का विभाज्य भाग। एक रेफ्रिजरेटर में 2 सप्ताह तक या उपयोग के लिए तैयार होने तक स्टोर करें, लेकिन फ्रीज न करें।
    5. तालिका 4 के अनुसार डीएमईएम 5/5 माध्यम तैयार करें
      1. तंत्रिका सेल संस्कृति, घोडा सीरम (एचएस), भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और एस्कॉर्बिक एसिड के लिए सीरम मुक्त पूरक के कुछ अंश। बैक्टीरिया के संदूषण को नियंत्रित करने के लिए यदि जरूरी हो, तो पेन-स्ट्रेप का एक विभाज्य पिघलना। प्रत्येक संघटक को 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पिपेट करें सुनिश्चित करें कि विंदुक युक्तियाँ किसी भी सतह या ओब्जेक को छू नहीं देती हैंts।
      2. बायोथिएड के अंदर, वैक्यूम ट्यूब में फ़िल्टर को अभी भी बंद कर दें। मिश्रण को फिल्टर के ऊपर डालें और इसे बंद करें। बायोथड में वैक्यूम चालू करें और मध्यम फिल्टर को कंटेनर के नीचे रखें। वैक्यूम को बंद करने से पहले वैक्यूम से फिल्टर को अनप्लग करें।
      3. बाँझ मध्यम कंटेनर पर ढक्कन को कस लें, इसे लेबल करें, और किसी भी अप्रयुक्त माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस तक एक महीने तक स्टोर करें। मध्यम बाँझ रखने के लिए बायोथिएड के अंदर कंटेनर खोलें।
    6. तालिका 5 के अनुसार डीएमईएम + मध्यम तैयार करें
      1. तंत्रिका सेल संस्कृति और एस्कॉर्बिक एसिड (और पेन-स्ट्रेप, यदि आवश्यक हो) के लिए सीरम मुक्त पूरक के कुछ अंश प्रत्येक संघटक को 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पिपेट करें शेष प्रक्रिया के लिए चरण 1.2.5.2-1.2.5.3 दोहराएं।

2. सरणी / डिश तैयारी

नोट: इस प्रक्रिया में इस्तेमाल किए जाने वाले विदेश मंत्रालय हैं 60-चैनल एरे हैं8 x 8 वर्ग में संगठित Interelectrode दूरी 200 माइक्रोन है, और प्रत्येक इलेक्ट्रोड व्यास 10 माइक्रोन है। पटरियों के लिए आयोजित सामग्री टाइटेनियम है, और इलेक्ट्रोड स्वयं टीएन के बने होते हैं इलेक्ट्रोड के चारों ओर ग्लास की अंगूठी 6 मिमी ऊंची है, जिसमें 24 मिमी बाहरी व्यास है। पॉलीओक्साइमिथीन (पीओएम) से बने टोपी का इस्तेमाल विदेश मंत्रालय द्वारा कवर करने के लिए किया जाता है, और रिकॉर्डिंग और उत्तेजना सत्रों के दौरान प्रदूषण को रोकने के लिए एक गैस-पारगम्य / तरल-अभेद्य फ्लोरैनेट युक्त एथिलीन प्रोपीलीन (एफईपी) फिल्म का उपयोग किया जाता है।

  1. चढ़ाना से पहले दिन
    1. प्लाज़मा को उजागर करके अप्रयुक्त विदेश मंत्रालय के हाइड्रोफिलिक बनाओ; यह आमतौर पर पहले उपयोग के बाद आवश्यक नहीं है सुनिश्चित करें कि नियंत्रण संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले कांच के कच्छा भी एक प्लाज्मा उपचार प्राप्त करते हैं।
      नोट: प्लास्टिक पेट्री डिश (35 मिमी) को भी नियंत्रण बर्तन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और किसी पूर्व-उपचार की आवश्यकता नहीं है।
      1. 40-60 से आधे बिजली (50 डब्ल्यू) के लिए प्लाज्मा एचर का उपयोग करके प्लाज्मा उपचार का प्रबंध करना, वाईच चैम्बर दबाव 100-150 एमटी के लिए सेट
    2. तुरंत डि पानी के साथ विदेश मंत्रालय को भरें। डि पानी से भरे पेट्री डिश में कवच की सब्ज़ी को दबाएं। लगभग 15 मिनट के लिए इलाज की सतह के साथ डि पानी को छोड़ दें
    3. बायोथहाउस के अंदर, डि पानी बाहर निकालना 70% इथेनॉल के साथ रिम के लिए विदेश मंत्रालय को भरें। डिस्पले के डिब्बे से डिस्पले के डिस्पैसे को कवर करें, और पेट्री डिश को इथेनॉल के साथ भर दें, जब तक कंडोल्प्स पूरी तरह डूबे हुए न हों। इसे 10-15 मिनट तक बैठने की अनुमति दें
    4. सभी पेट्री डिश और एमईए आईडी #, सर्जरी की तारीख, सेल प्रकार, और आद्याक्षर के साथ व्यंजनों को लेबल करें। उसके बाद, प्रत्येक लेबल को पेट्री डिश में रखें।
    5. विदेशियों को व्यक्तिगत पेट्री डिश में रखें और वैक्यूम सक्शन का उपयोग करके इथेनॉल निकाल दें। किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए बाँझ डि पानी के साथ विदेश मंत्रालयों को भरें। डि पानी हटाने के लिए वैक्यूम सक्शन का उपयोग करें। विदेशों के वायु-वायु के भीतर वायु-शुष्क होने दें।
    6. 40-70 μL 50 μg / mL पॉली-डी-लाइसिन जोड़ेंई (पीडीएल; उच्च आणविक भार, कम से कम 50 केडीए) प्रत्येक विदेश मंत्रालय और 0.2 एमएल के केंद्र में बाँझ पिपेट युक्तियों का उपयोग कर नियंत्रण के लिए।
      नोट: पिपेट, टिप के साथ विदेश मंत्रालय के केंद्र को स्पर्श न करें, क्योंकि यह इलेक्ट्रोड को नुकसान पहुंचा सकता है। पीडीएल की सटीक मात्रा सतह की हाइड्रोफिलिसिटी पर निर्भर करती है।
    7. प्रत्येक डिश में प्रयोगशाला टिशू पेपर का एक छोटा सा टुकड़ा रखें और पीडीएल वाष्पीकरण से रातोंरात से बचने के लिए बाँझ पानी से गीला करें। बायोथड से उन्हें निकालने से पहले सभी व्यंजनों को कवर करें इनक्यूबेटर में व्यंजन 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें।
  2. चढ़ाना दिन
    1. चढ़ाना के दिन, लैमिनिन के 1 विभाज्य को पिघलना (20 माइक्रोग्राम / एमएल); प्रत्येक विदेश मंत्रालय को 40-50 μL लमिनिन की आवश्यकता होती है, और प्रत्येक नियंत्रण डिश के लिए 0.2 एमएल लमिनिन की आवश्यकता होती है। उपयोग की जाने वाली संख्याओं और नियंत्रणों के आधार पर लैमिनिन की मात्रा की गणना करना आवश्यक है।
    2. इनक्यूबेटर से बायोथड में सभी व्यंजनों को स्थानांतरित करें
    3. बाँझ के साथ सभी विदेश मंत्रालयों को भरेंडीई का पानी एक बाँझ सीरियल पिपेट का उपयोग करके उन्हें 10 से 15 मिनट तक बैठने की अनुमति देता है। बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करके डि पानी की सूजन और इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
    4. प्रत्येक विदेश मंत्रालय और 0.2 एमएल का लेमनिन के लिए बाँझ विंदुक युक्तियों का उपयोग कर नियंत्रण प्लेटों में 40-50 μL का थैला लेमीनिन जोड़ें। बायोहाइड में सभी विदेश मंत्रालय और नियंत्रण व्यंजनों को कवर करें और उन्हें 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
      1. बाँझ पाश्चर pipettes के साथ चूषण का उपयोग कर विदेश मंत्रालय के केंद्र से अतिरिक्त लैमिनिन को ध्यान से हटा दें और चढ़ाना से पहले सतह को हवा में सूखने दें।
    5. जैववस्तु में व्यंजन छोड़ दें, या कोशिकाओं को प्लेट बनाने के लिए तैयार होने तक इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: व्यंजन अगले दिन तक इनक्यूबेटर में रह सकते हैं। हालांकि, यदि अधिक समय की आवश्यकता है, तो व्यंजन को साफ करने और पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल) चरण (चरण 2.1.6) से शुरू करने के लिए सलाह दी जाती है।

3. भ्रूण निकालना और मस्तिष्कनिष्कर्षण

  1. एल -15 (लीबोविट्ज़) माध्यम को 100 मिमी पेट्री डिश में से 4 में डालें। उन्हें कवर करें और उन्हें एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में रखें जब तक कि मध्यम में मूसलधार बारिश नहीं होती है, लेकिन ठोस (~ 40-60 मिनट) जमे हुए नहीं है।
  2. यह विच्छेदन से लगभग 40 मिनट से 1 घंटे पहले करें।
    नोट: यह भ्रूण और दिमाग को जल्दी से शांत कर देगा, ताकि उनकी फर्म सुसंगतता हो और निकासी पर विघटित न हो।
  3. भ्रूण हटाने के लिए विच्छेदन क्षेत्र तैयार करें
    1. एक सिंक के पास बर्फ के साथ एक ट्रे रखें और भ्रूण हटाने के लिए सर्जिकल उपकरणों और सामग्रियों को रखना। इन में 4 पेट्री डिश शामिल हैं जिनमें एलटी 15 "स्लेश," पेपर टॉवेल, 70% इथेनॉल, कुंद-नाक अंगूठे संदंश, ठीक संदंश, छोटे शल्य कैंची और बड़ी कैंची ( चित्रा 1 ) के साथ एक स्प्रे बोतल है ।
  4. मस्तिष्क निकासी के लिए विच्छेदन क्षेत्र तैयार करें।
    1. एक गिलास पेट्री डिश एफए रखेंबर्फ से भरा ट्रे में नीचे रहें
    2. मस्तिष्क निष्कासन के लिए सर्जिकल उपकरणों और सामग्रियों को बाहर निकालना, जिसमें कागज़ के तौलिये, छोटे शल्य कैंची, एक पतली डबल-स्प्रेडला, 70% इथेनॉल से भरा स्प्रे बोतल और शव के निपटान के लिए एक प्लास्टिक बैग ( चित्रा 2 ) शामिल है।
  5. एक प्रयोगशाला कोट, एक फेसमास्क, और दस्ताने रखो। 70% इथेनॉल के साथ दस्ताने सहित सभी कामकाजी सतहों को स्प्रे करें।
    नोट: यद्यपि यह एक बाँझ प्रक्रिया नहीं है, यद्यपि संभव है जितना संभव हो उतना प्रदूषण की संभावना को कम करना।
  6. एनआईएच दिशानिर्देश 16 और / या सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति को मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के इस्तेमाल पर और संस्थागत रूप से अनुमोदित पशु देखभाल और सीओ 2 के लिए प्रोटोकॉल (आईएसीयूसी) के तहत E17 समय-गर्भवती माउस का उपयोग करें। सीओ 2 गैस को धीरे-धीरे चैम्बर में 3 से 5 मिनट की अवधि के दौरान छोड़ने के लिए सुनिश्चित करें कि आतंक या डिस्को से बचेंमाउस में मफट
  7. माउस को ठुकरा दें और इसे एक कागज तौलिया, उदर की ओर ऊपर रखें। 70% इथेनॉल के साथ इसका निचला पेट स्प्रे करें छोटे सर्जिकल कैंची का उपयोग करना, ऊपरी पेट की त्वचा और चमड़े के नीचे की चर्बी के माध्यम से एक वी-आकार की कटौती करना, छाती के गुहा के बाहर के छोर तक काट देने और गर्भाशय को उजागर करना।
  8. संदंश का उपयोग करना, भ्रूण के बीच गर्भाशय को सावधानीपूर्वक उठाएं। विच्छेदन कैंची के साथ संयोजी ऊतक को काट लें, जब तक संपूर्ण गर्भाशय मुक्त न हो। संक्षेप में 70% इथेनॉल वाले गर्भाशय को किसी भी खून को निकालने के लिए कुल्ला और इसे ठंडा एल -15 से भरने वाले 4 पेट्री डिश में रखें।
  9. ठीक-छेड़ा संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके प्रत्येक भ्रूण को गर्भाशय और आंतरिक भ्रूणिक थैली से रिलीज करें। सुनिश्चित करें कि नालिका को काट दिया गया है और प्लेकेन्ट सैक को हटा दिया गया है। ठंड एल -15 से भरा दूसरा पकवान में मुक्त भ्रूण रखें। संदंश और कैंची के साथ भ्रूण Decapitate संदंश का उपयोग करना, सिर को एक तीसरा पेट्री डिश और निकायों में स्थानांतरित करनाएक चौथाई, दोनों ठंड एल -15 से भरा हुआ

4. अग्रवर्ती प्रांतस्था हटाने

  1. बायोथड में, शीत ग्लास पेट्री डिश मंच पर ऑटोकल्वड फिल्टर पेपर की एक पच्चर रखें। फ़िल्टर पेपर पर एक भ्रूण सिर रखें। गैर-प्रबल हाथ के साथ नेक्लर गुहा के माध्यम से संदंश की एक जोड़ी रखकर खोपड़ी को पकड़ो। आईरिस कैंची की एक जोड़ी के साथ त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशी ऊतक निकालें।
  2. खोपड़ी के आधार में आईरिस कैंची के निचले निचले हिस्से के काटने के किनारे रखें। खोपड़ी की आंतरिक सतह, मस्तिष्क से दूर, ओसीस्पिटल प्लेट के माध्यम से काटकर और पार्श्वल प्लेटों के बीच मध्य रेखा के साथ कम निचले स्तर को ध्यान में रखते हुए। कृत्रिम रूप से सामने वाले खोपड़ी प्लेटों के बीच, रोस्ट्रेली को काटने के लिए जारी रखें।
  3. ओसीसीपटल प्लेट के केंद्र से शुरू होने से, बायीं तरफ और केंद्र कट के दाईं ओर एक लंबवत कटौती करें।
  4. उदर सतह के बीच एक छोटे से स्पेटुला को ध्यान में रखते हुए मस्तिष्क को निकालेंमस्तिष्क का और नीचे की खोपड़ी प्लेटें जब तक कि यह पूरी तरह से मस्तिष्क के नीचे नहीं है। ऊपर की तरफ लिफ्ट; पूरे मस्तिष्क को बरकरार से बाहर आ जाएगा
  5. फिल्टर पेपर पर L-15 माध्यम के कुछ बूंदों को रखें ताकि मस्तिष्क कागज पर चिपक न सकें और मस्तिष्क को स्पटरुला से धीरे-धीरे फिल्टर पेपर, उदर की तरफ नीचे खींच दें। त्वचा की नोक के साथ घ्राण बल्ब को सावधानी से काट दिया।
  6. एक साफ रंग का प्रयोग करके, ललाट पालि को एक ट्रेपोज़ाइडल पैटर्न में काट लीजिये। भंडारण माध्यम युक्त एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में ऊतक को स्थानांतरित करें। शेष भ्रूण के साथ उपरोक्त दोहराएं। हर बार फिल्टर पेपर की एक ताजी पच्चर का उपयोग करना सुनिश्चित करें ( यानी, प्रत्येक प्रति फिल्टर पेपर का तार)।

5. सेल डिसोसिएशन

  1. बायोहुड में, तालिका 6 में सूचीबद्ध वस्तुओं को इकट्ठा करें
  2. 5 एमएल डीएमईएम + को पपैन के शीश में जोड़ने के लिए एक बाँझ सीरियल पिपेट का प्रयोग करें; गरम डीएमईएम + का उपयोग पैप्पन को भंग करने के लिए किया जा सकता है धीरेविंदुक समाधान मिश्रण करने के लिए
  3. डीएमईएम के 0.5 एमएल + DNase के एक शीशी को जोड़ने के लिए एक बाँझ माइक्रोप्रिपेट का उपयोग करें। DNase समाधान बनाते समय सशक्त pipetting से बचें, क्योंकि DNase कतरनी विकृति के प्रति संवेदनशील है।
  4. एक बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब के 2.5 एमएल पपैन समाधान का स्थानांतरण करें और एक ही ट्यूब में डीएनसी के 125 μL जोड़ें। धीरे से आवरणित अपकेंद्रित्र ट्यूब को लगभग 8 गुना में बदलकर समाधान मिलाएं।
  5. एक बाँझ, चौड़े बोर विंदुक का प्रयोग करके ट्यूब से भंडारण माध्यम युक्त टिशू को हटा दें और इसे एक बाँझ, 35 मिमी पेट्री डिश में रखें। संभव के रूप में छोटे माध्यम ले लीजिए ऊतक को हटाने के बिना जितना संभव हो उतना अधिक भंडारण माध्यम को हटाने के लिए एक बाँझ पिपेट का प्रयोग करें। ऊतक मध्यम में अस्थायी नहीं होना चाहिए, लेकिन यह नम होना चाहिए।
  6. ऊतक को कम करने के लिए दो बाँझ स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग करें। पेट्री डिश में कीमा बनाया हुआ ऊतक को डीएनसी / पपैन मिश्रण के 2.5 एमएल जोड़ने के लिए एक बाँझ सीरियल विंदुक का प्रयोग करें। धीरे से पेट्री डिश को झुकाव सुनिश्चित करने के लिएटोपी सभी ऊतक समाधान में नि: शुल्क है और पकवान के निचले भाग का पालन नहीं करते। एक इनक्यूबेटर में डिश रखें 37 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के लिए
  7. बायोहुड में, सभी मीडिया और ऊतक को एक बाँझ, 5 एमएल क्रायोजेनिक ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ, चौड़ा बोर हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करें। ट्यूब के निचले हिस्से के पास एक ही व्यापक बोर हस्तांतरण विंदुक की नोक रखें। धीरे-धीरे धीरे-धीरे pipetting और नीचे 10-15 बार नीचे triturate।
  8. Pipetting के दौरान बुलबुले बनाने से बचें एक समरूप मिश्रण हासिल होने तक एक छोटे-बोर स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके प्रक्रिया को दोहराएं। यदि ऊतक अलग नहीं होता है, तो 1,000 μL विंदुक का उपयोग करके ट्रिटूरेट करें।
  9. पृथक सेल मिश्रण के लिए 2 एमएल की गरम डीएमईएम 5/5 जोड़ें। सेंटीफ्यूज ट्यूब कैप, जबकि यह अभी भी जैववस्था में है व्युत्क्रम द्वारा धीरे मिश्रण करें कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर लगभग 5 मिनट के लिए लगभग 573 x जी पर अपकेंद्रित्र।
  10. बायोथड में, बिना सतह को छोड़कर सभी सतह पर तैरने वालों को हटाने और हटाने के लिए एक बाँझ सीरमिक विंदुक का उपयोग करेंगोली। कोशिकाओं को पुनः निलंबित करने के लिए ट्यूब में गोली को 1 एमएल गर्म डीएमईएम 5/5 जोड़ने के लिए एक बाँझ पिपेट का प्रयोग करें। जब तक मिश्रण समरूप नहीं हो जाता है, तब तक धीरे-धीरे pipetting द्वारा गोली तोड़ने के लिए एक बाँझ, छोटे-बोर हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें।
    नोट: pipetting के दौरान बुलबुले बनाने से बचें यदि बहुत कम ऊतक एकत्र किया गया था, तो केवल 0.5 एमएल डीएमईएम 5/5 जोड़ें।
  11. बायोथिएड के अंदर, एक माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब में सेल निलंबन के 10 μL स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ पिपेट का उपयोग करें। बायोथियूड के बाहर, माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 10 μL सेल निलंबन के लिए 10 μ एल ट्रिपन ब्लू जोड़ें।
    नोट: इस कदम के लिए बाध्यता की आवश्यकता नहीं है
  12. कोशिकाओं की गणना करने के लिए डिस्पोजेबल हेमोसाइटोमीटर चिप में ट्रिपैन ब्लू सेल निलंबन के 10 μL लोड करें।

6. प्लेटिंग कोशिकाओं

  1. बायोथड में, प्रत्येक सरणी के केंद्र में सेल निलंबन के 50 μL और प्रत्येक नियंत्रण पेट्री डिश को स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ माइक्रोप्रिपेट का उपयोग करें। एक पाई का उपयोग करेंप्रति डिब्बे पेटे टिप सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को सरणी के केंद्र में ठीक से रखें। प्रयोगशाला के टिशू पेपर को फिर से गीला करें जो बाँझ पानी के साथ पकवान में था, या प्रत्येक डिश में नए टिशू पेपर रखें। व्यंजन को कवर करें
  2. 37 डिग्री सेल्सियस और 3-4 घंटे के लिए 10% सीओ 2 में सेट किए गए इनक्यूबेटर में कवर पेट्री डिश रखें।
  3. बायोथड में, प्रत्येक एमईए के लिए धीरे-धीरे 1 एमएल की गरम डीएमईएम 5/5 जोड़ें।
    नोट: माध्यम जोड़ते समय केंद्र सरणी से कोशिकाओं को धोने से बचें (महत्वपूर्ण!)। बहुत सावधानी से, किनारों के चारों ओर एक समय में एक बूंद जोड़ने के लिए एक बाँझ माइक्रोप्रिटेस का उपयोग करें।
  4. प्रत्येक विदेश मंत्रालय पर गैस-पारगम्य एफईपी झिल्ली युक्त कैप रखें। उन्हें इनक्यूबेटर पर दो दिन के लिए लौटें।
    नोट: टोपी प्रदूषण और बाष्पीकरण रोकता है सड़न रोकनेवाला तकनीक का पालन करें, 100% इथेनॉल के साथ बायोथिड में कैप्स को सुखाने से पहले उन्हें विदेश मंत्रालय में डालें। संस्कृतियों को बायोथिएड में कैप्चर किया जाना चाहिए और सभी समय में कैप्टन होना चाहिए।

7. मुख्यसंस्कृतियों को मिलाकर रखना

  1. दो दिनों के बाद, गर्म डीएमईएम + के साथ एक पूर्ण माध्यम प्रतिस्थापन करें
    1. बहुत समय तक संस्कृतियों पर जोर देने से बचने के लिए एक समय में इनूब्यूबेटर से बायोथिएड में कुछ व्यंजनों को स्थानांतरित करें
    2. केंद्र में कोशिकाओं को छूने से बचने, डिश के अंदर की दीवार पर पिपेट की टिप को ध्यान से रखकर डिश से सभी माध्यम को बाहर निकालने के लिए बाँझ 1-एमएल माइक्रोप्रिपेट का उपयोग करें। प्रदूषण फैलाने से बचने के लिए प्रति डिश में केवल एक विंदुक टिप का प्रयोग करें।
    3. 1 एमएल गर्म डीएमईएम + बांटने के लिए एक बाँझ माइक्रोप्रिपेट का प्रयोग करें, डिश के अंदर की दीवार पर पिपेट की टिप को ध्यान से रखकर।
  2. गर्म डीएमईएम + के साथ 50% मध्यम परिवर्तन करें, जैसा ऊपर वर्णित है, 2-3 बार प्रति सप्ताह और फीडिंग के बीच 4 से ज्यादा दिनों तक नहीं।
    1. पकवान से 500 μL मध्यम निकालने के लिए बाँझ 1 मिलीलीटर माइक्रोप्रोपेट का प्रयोग करें। 500 डीएलएम गर्म डीएमईएम +। <वितरित करने के लिए एक बाँझ माइक्रोप्रिटेप का प्रयोग करें/ Li>

8. दृश्य निरीक्षण और रिकॉर्डिंग

  1. प्रत्येक दूसरे दिन डिश के नमूनों का निरीक्षण सूक्ष्मदर्शी के नीचे करें (4x और 10X बढ़ाईकरण) और संदूषण (20x बढ़ाई का उपयोग करके), या तो जीवाणु या फंगल पर सेल कवरेज देखने के लिए।
    नोट: चित्रा 3 ए इष्टतम सेल कवरेज का एक उदाहरण दिखाता है, जबकि चित्रा 3 बी खराब सेल घनत्व के साथ एक संस्कृति को दर्शाता है।
  2. चढ़ाना के दो सप्ताह बाद, सहज गतिविधि के लिए विदेश मंत्रालय के व्यंजनों का नमूना लें। 3-5 मिनट के लिए नीचे बताए गए विदेश मंत्रालय से रिकॉर्ड स्पाइक्स का पता लगाया जाएगा कि गतिविधि मौजूद है ( चित्रा 4 )।
    नोट: प्रयोगकर्ता की जांच करने के लिए प्रयोग के प्रकार और परिकल्पना के प्रकार के आधार पर जांच शुरू करने के लिए यह प्रयोगकर्ता पर निर्भर है।
    1. विदेश मंत्रालय में गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए, निम्नलिखित उपकरण का उपयोग करें: बिजली की आपूर्ति, एम्पलीफायर, हेडस्टेज / प्रीमाप्लिफायर, तापमान नियंत्रक, और उत्तेजना जनरेटर (सामग्री की मेज और चित्रा 5 देखें )।
    2. इनक्यूबेटर के बाहर संस्कृतियों को लेने से पहले, तापमान नियंत्रक में प्लग करें और बिजली की आपूर्ति (निर्माता के निर्देशों के हिसाब से) पर स्विच करके सिस्टम को चालू करें, जिससे पूर्व-प्रूफिफायर की गरम बेस प्लेट 35 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच सके।
    3. प्रीमाप्लिफायर में छाया हुआ संस्कृति रखें ताकि विदेश मंत्रालय में काले रंग की पंक्ति संदर्भ जमीन के साथ संरेखित हो सके। सुनिश्चित करें कि प्रीमैम्पिफायर पिंस लाइन अप, प्रीमप्लिफायर के ऊपर सुरक्षित है, और यह कि संस्कृति कैप अभी भी चालू है।
    4. एक बार जब संस्कृति को प्लेट में रखा जाता है, तो डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर "बदलें MEA" विकल्प को अनचेक करें (सॉफ़्टवेयर नामों और उपयोगकर्ता मार्गदर्शकों के लिए सामग्री की तालिका देखें)। इसके अतिरिक्त, कोई रिकॉर्ड्स करने से पहले "ब्लैंकिंग" नामक बॉक्स को अनचेक करें
    5. टी के बाद "MEA_Select" में "डाउनलोड करें" चुनेंवह संस्कृति को प्रणाली में रखा जाता है। जारी रखें से पहले प्रोग्राम "ओके" डाउनलोड करें।
    6. संकेतों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए सॉफ्टवेयर वातावरण में "प्रारंभ" दबाएं मुख्य विंडो में, चुनें: "स्पाइक" → "डिटेक्शन" → "ऑटोमैटिक," "एसटीडी देव" वेल्यू को "5" में बदलकर और थ्रेशोल्ड रीसेट करने के लिए "रिफ्रेश" पर क्लिक करें।
      नोट: "स्पाइक्स" विंडो से पता चलता है कि सीमाएं पास हो चुकी हैं।
    7. मुख्य विंडो में, "रिकॉर्डर" → "रिकॉर्डर" → "ब्राउज़ करें" चुनें। तिथि, समय, डिश और प्रयोग को पहचानने के लिए पथ और फ़ाइल नाम बदलें। समय सीमा निर्धारित करें ( जैसे, 5 मिनट तक) "रोकें," "रिकॉर्ड," और "चलाएं" पर क्लिक करें। ध्यान दें कि रिकॉर्डिंग स्वचालित रूप से बंद हो जाती है
    8. उत्तेजना सॉफ्टवेयर खोलें "रिकॉर्डर" → "रिकॉर्डर" → "ब्राउज़ करें" को एक फ़ाइल बनाने और टिम सेट करने के लिए चुनेंई सीमा फिर से रिकॉर्ड करने के लिए "रोकें," "रिकॉर्ड," और "प्ले" पर क्लिक करें डिश पर पहुंचने के लिए उत्तेजना के लिए "डाउनलोड और प्रारंभ" (उत्तेजना सॉफ्टवेयर पर) पर क्लिक करें।
    9. व्यंजन बदलने के लिए सॉफ़्टवेयर नियंत्रण में "बदलें MEA" बटन का चयन करें।
      नोट: संस्कृति के आसपास सीओ 2 के वातावरण को बनाए रखने के लिए सिस्टम के बिना एक समय में 30 से अधिक मिनट के लिए इनक्यूबेटर की संस्कृति को न रखें। अगर लंबे समय तक रिकॉर्डिंग सत्रों की आवश्यकता हो, तो सीओ 2 की आपूर्ति के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एडाप्टर का उपयोग करें

9. प्रशिक्षण नेटवर्क

नोट: चित्रा 6 नीचे दिए गए 9। 9 .3 के चरणों का अवलोकन दिखाता है।

  1. सेल संस्कृति (5 चरण में वर्णित) से सहज गतिविधि की 5 मिनट की आधारभूत रेखा रिकॉर्ड करें। एक बार बेसलाइन स्थापित हो जाने के बाद, एक 5-मिनट पूर्व-प्रशिक्षण की जांच की जा रही है जिसमें एक 0.5 हर्ट्ज बीफ़सिसचयनित उत्तेजना इलेक्ट्रोड के माध्यम से 200 μs की पल्स अवधि और 900 एमवी पल्स आयाम ( चित्रा 7 ए ) के साथ पल्स, जैसा कि चित्रा 8 में दिखाया गया है (उत्तेजना इलेक्ट्रोड का चयन करने के तरीके के बारे में जानकारी के लिए सामग्री की तालिका में सॉफ्टवेयर मैनुअल देखें)।
  2. प्री-ट्रेनिंग उत्तेजना को पूरा करने पर, प्रोबिंग उत्तेजना के रूप में एक ही इलेक्ट्रोड का उपयोग करके नेटवर्क पर एक "प्रशिक्षण" प्रोटोकॉल का प्रबंध करता है। हैमिल्टन एट अल में वर्णित के अनुसार हर 2 सेकंड में एक बार उच्च आवृत्ति गाड़ियों को वितरित करें 15 ( चित्रा 7 बी और चित्रा 7 सी )
    नोट: प्रशिक्षण सिग्नल में 40 पल्स ट्रेन हैं। प्रत्येक पल्स ट्रेन में 100 बिप्सिक दालों का समावेश होता है, जिसमें दालों के बीच 4 एमएस, 200 μ की पल्स अवधि और 900 एमवी पल्स आयाम शामिल होता है।
  3. प्रशिक्षण अवधि के समापन के बाद, कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के बाद प्रशिक्षण उत्तेजना का प्रबंध करें,प्री-ट्रेनिंग उत्तेजना के समान पोस्ट-प्रशिक्षण उत्तेजना समाप्त हो जाने के बाद, नेटवर्क से पोस्ट-उत्तेजना सहज गतिविधि के 5 मिनट का रिकॉर्ड करें (जैसा चरण 8 में बताया गया है)।
  4. प्राकृतिक उतार-चढ़ाव या प्रणाली के कारण गैर-निष्कपटता के कारण नेटवर्क प्रतिक्रिया में संभावित बदलावों के लिए एमईए के एक अलग नियंत्रण समूह का उपयोग करें। उन नियंत्रण समूहों के ऊपर वर्णित एक ही प्रायोगिक प्रोटोकॉल का प्रबंधन, अपवाद के साथ कि नियंत्रण समूहों को एक शाम प्रशिक्षण अवधि प्राप्त होती है जिसमें कोई वास्तविक प्रशिक्षण संकेत नहीं दिया जाता है।

10. डेटा विश्लेषण

नोट: डेटा फ़ाइलों को सहेजा जाता है और बाद में एक स्वामित्व सॉर्टिंग सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके न्यूरॉनल इकाइयों में क्रमबद्ध किया जाता है। एक कस्टमाइज़्ड ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) का उपयोग इकाइयों को लोड करने और संस्कृतियों, अंतर-फट अंतराल, फट अवधि और पोस्ट-प्रेसिजन टाइम हिस्टोग्राम (पीएसटीएच) (सामग्री की तालिका देखें) में गतिविधि के पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। पीएसटीएच हैसबसे महत्वपूर्ण ग्राफ का विश्लेषण किया जाता है, क्योंकि यह बिन आकार (चर लंबाई) में नेटवर्क की गतिविधि को प्रदर्शित करता है, इस प्रकार प्रस्तुत की गई उत्तेजना के लिए नेटवर्क की प्रतिक्रिया का एक दृश्य प्रतिनिधित्व प्रदान करता है।

  1. .mcd डेटा फ़ाइलों को .plx प्रारूप में एक स्वामित्व सॉर्टिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कनवर्ट करें (सॉफ़्टवेयर नामों और उपयोगकर्ता मार्गदर्शकों के लिए सामग्री की तालिका देखें)। एक ही .plx फ़ाइल को एक ही प्रोग्राम में .plx फ़ाइल निर्यात करें। चैनलों को न्यूरॉनल यूनिटों में क्रमबद्ध करें ( चित्रा 9 )। एक बार सॉर्टिंग पूर्ण हो जाने पर, डेटा को। एनएक्स फ़ाइल के रूप में निर्यात करें।
  2. उपयुक्त सॉफ़्टवेयर (देखें सामग्री तालिका ) में। एनएक्स फ़ाइल को खोलें और कस्टम मैनेजमेंट GUI के साथ विश्लेषण करने के लिए इसे .mat फ़ाइल के रूप में सहेजें, जो कि स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है ( सामग्री तालिका देखें)।
    नोट: ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (सामग्री की तालिका देखें) उपयोगकर्ता इनपुट के अनुसार पीएसटीएच ( यानी, जनसंख्या पीएसटीएच, पक्षपाती-औसत पीएसटीएच, या व्यक्तिगत चैनल पी)एसटीएच), उत्तेजना प्रयोग का अवलोकन और पोस्ट- और प्री-उत्तेजना फ़ाइलों के बीच तत्काल तुलना करने की इजाजत देता है। यह प्रारंभिक बनाम अंतिम पीएसटीएच भी बनाता है, जो पहले 6 और पिछले 6 उत्तेजनाओं के नेटवर्क प्रतिक्रिया की तुलना करता है। जीयूआई उत्तेजना फ़ाइलों और सहज गतिविधि वाली फाइल दोनों के लिए कई अन्य कार्यों को करता है, जैसे स्पाइक रेट, अंतर-स्पाइक अंतराल, प्रति स्पाइक स्पाइक, अंतर-फट अंतराल और फट अवधि।
  3. सबसे पहले, स्पाट गाड़ियों वाले वेरिएबल्स और एक वैरिएबल जिसमें। उत्तेजना विरूपणिकता युक्त एक .mat फ़ाइल चुनें; स्क्रिप्ट डेटा का विश्लेषण करेगा, और मुख्य GUI दाईं ओर एक पीएसटीएच औसत ग्राफ के साथ पॉप अप करेगा ( चित्रा 10 )।
    1. औसत पीएसटीएच (लाल) में तुलना में व्यक्तिगत पीएसटीएच (नीला में) देखने के लिए सक्रिय इलेक्ट्रोड बटन पर क्लिक करें।
      नोट: सक्रिय इलेक्ट्रोड एक गर्मी का नक्शा दिखाने के लिए रंगीन हो जाएगा, जहां उच्च मूल्य (अधिक लाल) अधिक से अधिक प्रतिनिधित्व करते हैंचोटी पीएसटीएच मूल्य, उत्तेजना के लिए एक मजबूत प्रतिक्रिया का संकेत।
    2. पॉप-अप मेनू का उपयोग करके एक विश्लेषण विकल्प चुनें इलेक्ट्रोड के एक सबसेट का चयन करने के लिए "पक्षपाती औसत" बटन का चयन करें और उस सबसेट का औसत साजिश करें; यह एक संस्कृति के भीतर उप-नेटवर्क व्यवहार की तुलना करने के लिए उपयोगी है।
      नोट: पॉप-अप मेनू के माध्यम से कई अलग-अलग विश्लेषण विकल्प चुने गए हैं, और ये सभी सॉफ़्टवेयर में "सहायता" बटन में समझाए गए हैं।
    3. उच्च रिजोल्यूशन वाली जेपीजी फाइल के रूप में वर्तमान में प्रदर्शित ग्राफ को सहेजने के लिए "ग्राफ़ सहेजें" बटन चुनें। किसी स्प्रेडशीट में डेटा निर्यात करने के लिए "डेटा तालिका" बटन चुनें

Representative Results

यहां दी गई प्रक्रिया का उपयोग ( चित्रा 11 ) , ई-17 माउस न्यूरॉनल कोशिकाओं के साथ चढ़ाया जाने वाले 60-चैनल एमईए, जब तक कि संस्कृतियों ने कोशिकाओं के स्वस्थ कालीनों ( चित्रा 12 और चित्रा 3 ए ) में सरणियों को कवर नहीं किया था, तब तक बढ़े थे। 10% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 3 सप्ताह के बाद, एक वाणिज्यिक रिकॉर्डिंग सिस्टम (देखें सामग्री तालिका ) का उपयोग करके सहज गतिविधि के लिए संस्कृतियों की जांच की गई। एक तापमान नियंत्रक का उपयोग करते हुए रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था, क्योंकि तापमान न्यूरोनल गतिविधि और फायरिंग दर को प्रभावित करता है।

गतिविधि के लिए परीक्षण
स्वचालित रूप से सक्रिय नेटवर्क सामान्य रूप से संकेत पैटर्न बदलते हैं। एक औसत सक्रिय संस्कृति एक में गतिविधि को पंजीकृत कर सकती हैइलेक्ट्रोड का लगभग 40% हिस्सा इन सक्रिय इलेक्ट्रोड साइटों में, लगभग आधे से पांच -10 हर्ट्ज से लेकर फायरिंग दर के साथ सहज संकेतों का पंजीकरण करें। सहज गतिविधि के एक प्रतिनिधि रास्टर प्लॉट चित्रा 4 ए में दिखाया गया है। टिक के निशान 25 किलोहर्ट्ज़ के अधिग्रहण दर और 300 हर्ट्ज और 3 kHz के बीच एक बैंडपास फिल्टर रेंज में, 20 की खिड़की के दौरान 9 सक्रिय इलेक्ट्रोडों से दर्ज एक्शन क्षमता के टाइमस्टैम्प को इंगित करते हैं। चित्रा 4 बी सॉर्टिंग प्रक्रिया से पहले गतिविधि के 8 बस्ट के दौरान बेसलाइन शोर और फ़िल्टर किए गए कच्चे बाह्य संकेत को दर्शाता है। शोर से एक्शन की क्षमता को अलग करने के लिए, प्रत्येक चैनल के लिए थ्रेशोल्ड बेसलाइन शोर के मानक विचलन के 5 गुणा पर सेट किए जाते हैं और इसकी गणना 500 ms विंडो 15 पर की जाती है ।

विश्लेषण से पहले, प्रत्येक इलेक्ट्रोड के लिए रिकॉर्टेड स्पाइक्स ऑफ़लाइन सॉर्ट किए गए थे ताकि फिजियो के बीच अंतर हो सकेतार्किक गतिविधि और उत्पत्ति एल्गोरिथम और सिद्धांत घटक विश्लेषण का उपयोग कर उत्तेजना कलाकृतियों। प्रत्येक इलेक्ट्रोड पर आबादी प्रतिक्रिया ( चित्रा 13 और चित्रा 9 ) 15 को बनाने के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं के रूप में पहचान की गई सिग्नल को एक साथ समूहीकृत किया गया था ।

इलेक्ट्रिकल उत्तेजना के साथ तंत्रिका नेटवर्क को प्रशिक्षण
नेटवर्क को उत्तेजना जनरेटर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके सीधे विदेश मंत्रालय के इलेक्ट्रोड के माध्यम से संस्कृति पर लागू होने वाली विद्युत उत्तेजना का उपयोग करके प्रशिक्षित किया गया था। प्रतिनिधि परिणामों के इस सेट में, 13 इलेक्ट्रोडों वाला एक "एल" -छे गए कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग किया गया था ( चित्रा 8 ), हालांकि कई अन्य विन्यास लागू किए जा सकते हैं। जांच और प्रशिक्षण उत्तेजना Ruaro एट अल में परिभाषित पैरामीटर पर आधारित थे 14

एक बेसलाइन शुरू में उत्तेजना से पहले 5 मिनट की सहज गतिविधि का रिकॉर्डिंग करके सेट किया गया था। एक आधारभूत स्थापित होने के बाद, एक 5 मिनट पूर्व-प्रशिक्षण की जांच की जा रही है जिसमें 200 μs की पल्स अवधि और एक 900 एमवी पल्स आयाम ( चित्रा 7 ए ) के साथ 0.5 हर्ट्ज बिफेसिक नाड़ी का चयन किया गया था ( अर्थात, "एल" के आकार का)। इलेक्ट्रोड के एक ही सेट का उपयोग करते हुए प्रत्येक 2 एस नेटवर्क पर एक प्रशिक्षण प्रोटोकॉल का संचालन किया गया था। प्रशिक्षण सिग्नल में 40 पल्स ट्रेन शामिल थीं, जिनमें से प्रत्येक में 100 बीफ़सिसिक दालों शामिल हैं, जिनमें 4 एमएस अंतर-पल्स अवधि, 200 μ की पल्स अवधि और 900 एमवी पल्स आयाम ( चित्रा 7 बी और चित्रा 7 सी ) शामिल हैं। इस प्रशिक्षण अवधि के बाद एक 5 मिनट के बाद के प्रशिक्षण चरण के बाद, पूर्व प्रशिक्षण उत्तेजना के समान था। तब प्रोटोकॉल थापोस्ट उत्तेजना सहज गतिविधि की 5 मिनट की रिकॉर्डिंग के साथ संपन्न हुआ।

एक ही प्रायोगिक प्रोटोकॉल नेटवर्क प्रतिक्रिया में प्राकृतिक उतार चढ़ाव के लिए खाते के लिए संस्कृतियों के एक नियंत्रण समूह के लिए लागू किया गया था। नियंत्रण प्रोटोकॉल में एकमात्र अंतर, हालांकि, एक शाम प्रशिक्षण अवधि का आवेदन था, जिसके दौरान कोई वास्तविक प्रशिक्षण संकेत नहीं दिया गया था।

डाटासेट्स के सांख्यिकीय विश्लेषण ( यानी, प्रशिक्षण बनाम नियंत्रण) को एक-तरफा एनोवा के साथ किया गया, जिसमें "प्रशिक्षण" के बीच अंतर-विषयक कारक के रूप में किया गया था। विलंबता एक आंतरिक विषय कारक के रूप में उपयोग किया गया था यदि महत्वपूर्ण बातचीत मिल गई, तो टुक की पोस्ट-हॉक प्रक्रिया की गई। परिणामों के परिणामस्वरूप 20 एमएस के बाद के प्रोत्साहन के भीतर पूर्व-प्रशिक्षण प्रतिसाद दिखाया गया था, हालांकि पहली प्रतिक्रिया के बाद गतिविधि की सीमा असंगत थी। हालांकि, पोस्ट-ट्रेनिंग गतिविधि केवल न केवल एआर दिखायी गयी प्री-ट्रेनिंग के दौरान पहले 20 एमएस पोस्ट-उत्तेजना के भीतर esponse, जैसा कि पूर्व-प्रशिक्षण के दौरान देखा गया था, लेकिन यह 30-50 एमएस के बाद उत्तेजना ( चित्रा 14 और 15 चित्रा ) 15 में महत्वपूर्ण गतिविधि का भी प्रदर्शन किया। "उत्तेजना के बाद के समय" और "स्पाइक विश्वसनीयता" बनाम "स्पाइक आवृत्ति" का एक सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण सहसंबंध था। "स्पाइक विश्वसनीयता" को एक उत्तेजना के लिए एक नेटवर्क प्रतिक्रिया देखने की संभावना के रूप में परिभाषित किया जा सकता है, जहां प्रत्येक उत्तेजना के प्रति उत्तर 1 के अधिकतम मूल्य को सौंपा जाता है। चित्रा 16 स्पाइक आवृत्ति में लगभग 50% वृद्धि, साथ ही साथ 30 20-50 एमएस के बाद उत्तेजना की सीमा में नियंत्रण बनाम प्रशिक्षित नेटवर्क के लिए स्पाइक विश्वसनीयता में 50% की वृद्धि। ये परिणाम बताते हैं कि प्रशिक्षण ने मौलिक रूप से नेटवर्क गतिशीलता को बदल दिया है।

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चित्रा 1 : भ्रूण निकालना के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण और सामग्री। ( ए ) बर्फ से भरे ट्रे ( बी ) शीत एल -15 से भरा पेट्री डिश "slush।" ( सी ) पेपर तौलिया ( डी ) 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे बोतल ( ई ) ठीक संदंश (x2) ( एफ ) छोटे शल्य कैंची ( जी ) ब्लंट-नाक अंगूठे संदंश ( एच ) बड़े कैंची ( आई ) बॉडी बैग इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : मस्तिष्क एक्सट्रैक्शन के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले उपकरण और सामग्री। ( ए बी ) पेट्री डिश युक्त भ्रूण के सिर ( सी ) भंडारण माध्यम के साथ पन्नी-कवर अपकेंद्रित्र ट्यूब। ( डी ) उलटे गिलास पेट्री डिश ( ई ) ऑटोकल्वड फिल्टर पेपर ( एफ ) 70% इथेनॉल के साथ बीकर ( जी ) प्लास्टिक विंदुक ( एच ) आईरिस कैंची ( I ) ठीक संदंश ( जे ) पतला डबल-अंतराल (के) पेपर तौलिया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3 : इष्टतम बनाम गैर इष्टतम संस्कृतियों ( ए ) सरणियों को कवर करने वाले कोशिकाओं का एक स्वस्थ कालीन दिखाता है, ( बी ) के विपरीत,जिसमें गरीब सेल प्रसार होता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : स्वायत्त गतिविधि के प्रतिनिधि परिणाम ( ए ) स्वाधीन गतिविधि के प्रतिनिधि रास्टर प्लॉट टिक के निशान 25 किलोहर्ट्ज़ के अधिग्रहण दर और 3 kHz और 300 Hz के बीच एक bandpass फिल्टर रेंज में 20 की खिड़की के दौरान 9 सक्रिय इलेक्ट्रोड से दर्ज की जाने वाली क्रिया क्षमता दर्शाते हैं। ( बी ) प्रतिनिधि ने एक सक्रिय साइट से बाह्य क्रिया क्षमता को फ़िल्टर किया। संदर्भ से संशोधित चित्रा 15 कृपया यहाँ क्लिक करें एक बड़ा versio देखने के लिएइस आंकड़े के n

चित्रा 5
चित्रा 5 : रिकॉर्डिंग सेटअप ( ए ) उत्तेजना जनरेटर ( बी ) तापमान नियंत्रक ( सी ) बिजली की आपूर्ति ( डी ) एम्पलीफायर ( ई ) हेडस्टैज / प्रीमैप्लिफायर ( एफ ) बंद विदेश मंत्रालय। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6 : विद्युत प्रशिक्षण प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। 5 मिनट के लिए एक प्रारंभिक बेसलाइन रिकॉर्ड करें और 3 मिनट के लिए एक जांच उत्तेजना दर्ज करें टेटॅनिक उत्तेजना लागू करें 90 एस के लिए, जो रिकॉर्ड नहीं है। 3 मिनट के लिए एक दूसरी जांच उत्तेजना को लागू करें और 5 मिनट के लिए एक अंतिम बेसलाइन रिकॉर्ड करें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 7
चित्रा 7 : जांच उत्तेजना और प्रशिक्षण सिग्नल पैरामीटर ( ए ) जांच उत्तेजना में 0.5 हर्ट्ज की आवृत्ति पर नियंत्रित किए गए ± 900 एमवी द्वि-फसिक दालों के होते हैं। ( बी ) पल्स ट्रेन में 100 हर्ट्ज की आवृत्ति पर 100 ± 900 एमवी बाय-फासिक दालों शामिल हैं ( सी ) प्रशिक्षण सिग्नल में प्रत्येक 2 एस को संचालित 40 पल्स ट्रेन शामिल होते हैं। संदर्भ से संशोधित चित्रा 15"_blank"> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
चित्रा 8 : "एल" - आकार विन्यास का प्रतिनिधित्व स्क्वायर विदेश मंत्रालय से व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड का प्रतिनिधित्व करते हैं। ब्लू स्क्वायर उत्तेजना के लिए इस्तेमाल इलेक्ट्रोड का संकेत देते हैं, जबकि अन्य सभी रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए जाते हैं। संदर्भ से संशोधित चित्रा 15 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

9 चित्र
9 चित्रा : शोर और उत्तेजना कलाकृतियों से विशिष्ट इकाइयों। कई ऊपरी पैनल ( ए - डी ) पीला तरंग एकमात्र इकाई है जिसे यहां मिला है। ( ई ) हरे रंग की तरंग एकमात्र इकाई है ( एफ ) एक ऐसे चैनल का उदाहरण जो एक इलेक्ट्रोड से दर्ज किया गया था जिसका उपयोग उत्तेजना के लिए भी किया गया था, जहां प्रवर्धक संतृप्ति के कारण कोई भी यूनिट उचित रूप से नहीं देखा जा सकता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 10
चित्रा 10 : पोस्ट-उत्तेजना समय हिस्टोग्राम (पीएसटीएच)। एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस ( सामग्री तालिका देखें) उपयोगकर्ता इनपुट के अनुसार पीएसटीएच को भूखंड बनाती है ( यानी, जनसंख्या पीएसटीएच, पक्षपाती-औसत पीएसटीएच या व्यक्ति)चैनल पीएसटीएच), उत्तेजना प्रयोग का अवलोकन और पोस्ट- और प्री-उत्तेजना फाइलों के बीच तत्काल तुलना के लिए अनुमति देता है। यह शुरुआती बनाम अंतिम पीएसटीएचएस भी तैयार करता है; यह पहले 6 और पिछले 6 उत्तेजनाओं के नेटवर्क प्रतिक्रिया की तुलना करता है जीयूआई उत्तेजना फ़ाइलों और सहज गतिविधि वाली फाइल दोनों के लिए कई अन्य कार्यों को करता है, जैसे स्पाइक रेट, अंतर-स्पाइक अंतराल, प्रति स्पाइक स्पाइक, अंतर-फट अंतराल और फट अवधि। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 11
11 चित्रा : सेल तैयारी और चढ़ाना का अवलोकन ( ए ) एक ई 17 गर्भवती माउस सीओ 2 के साथ euthanized है ( बी ) माउस decapitat हैएड और गर्भाशय हटा दिया जाता है। ( सी ) भ्रूण जारी किए जाते हैं और decapitated हैं ( डी ) मस्तिष्क को प्रत्येक भ्रूण से निकाला जाता है और ललाट को हटा दिया जाता है। ( ई ) कोशिकाओं अलग कर रहे हैं। ( एफ ) अलग-अलग कोशिकाओं को मध्यम में निलंबित कर दिया जाता है। ( जी ) निलंबित सेल 60-चैनल मल्टी-इलेक्ट्रोड एरे (एमईए) पर चढ़ाए जाते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 12
चित्रा 12 : न्यूरॉनल कल्चर प्लस माइक्रोइलेक्ट्रोड एरेज़ पर चढ़ाए गए। भ्रूणिक माउस न्यूरॉन्स 60-चैनल एमईए पर चढ़ाए जाते हैं, जो प्रत्येक इलेक्ट्रोड से नेटवर्क पर न्यूरोनल गतिविधि की एक साथ रिकॉर्डिंग की अनुमति देते हैं। (चित्रा संशोधितसंदर्भ से 15 )। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 13
चित्रा 13 : प्रत्येक चैनल से तरंगों को सॉर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला सॉर्टिंग प्रोग्राम। छँटाई कार्यक्रम ( सामग्री तालिका देखें) एक डेटा फ़ाइल को लोड करता है और प्रत्येक चैनल के लिए शुरू में सभी इकाइयों को प्रदर्शित करता है विशिष्ट इकाइयों को सिग्नल प्रदान करने के लिए कई तरीकों में से एक का चयन किया गया है। इस उदाहरण में, K- क्लस्टरिंग एल्गोरिथ्म का चयन किया गया था, और पीले यूनिट (निचले खिड़की पर लेबल "इकाई ए") की पहचान की गई थी। एक अन्य प्रोग्राम ( सामग्री तालिका देखें) तब। .एमएक्स फ़ाइल को .mat फ़ाइल में निर्यात करने के लिए उपयोग किया जाता है, जो कि कस्टम-बनाया जीयूआई के लिए इनपुट फ़ाइल है (देखें ओजी> सामग्री तालिका और चित्रा 10 )। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 14
चित्रा 14 : प्रशिक्षण अवधि के बाद उत्तेजना के प्रति प्रतिक्रिया में बदल दिया गया नेटवर्क गतिविधि। प्रतिनिधि आठ इलेक्ट्रोड से गतिविधि की रास्टर प्लॉट। ऊर्ध्वाधर लाल रेखा उत्तेजना के समय को इंगित करता है, और काले निशान के निशान क्रिया क्षमता दर्शाते हैं। पूर्व-प्रशिक्षण ( ए ) में, चैनलों में उत्तेजना पल्स के लिए तत्काल प्रतिक्रिया होती है। पोस्ट-ट्रेनिंग ( बी ) में, नेटवर्क एक अधिक लम्बे समय तक गतिविधि प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है, साथ ही उत्तेजना 15 के तत्काल प्रतिक्रिया।.jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 15
चित्रा 15 : प्रशिक्षित नेटवर्कों ने महत्वपूर्ण रूप से स्पाइक आवृत्तियों को बदल दिया है। नियंत्रण नेटवर्क के लिए नेटवर्क स्पाइकिंग की आवृत्ति की गणना प्रत्येक उत्तेजना के तुरंत बाद और उस अवधि से विभाजित होने के तुरंत बाद 50 एमएस से अधिक स्पाइक्स की संख्या को एकीकृत करके की जाती है। दिखाया गया है कि 12 प्रशिक्षित और 10 नियंत्रण नेटवर्क का औसत (त्रुटि सलाखों के मानक त्रुटि को इंगित करते हैं)। तारांकन (*) दो डेटासेट के बीच एक सांख्यिकीय अंतर ( पी-मान <0.05) इंगित करता है संदर्भ से संशोधित चित्रा 15 कृपया एक लार् को देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के जीर संस्करण

चित्र 16
चित्रा 16 : सिनैप्टिक-मध्यस्थता वाले उत्तरों को प्रशिक्षित नेटवर्क में महत्वपूर्ण रूप से संशोधित किया गया है। ( ए ) स्पाइक विश्वसनीयता, 10 एमएस डिब्बे में मापा जाता है और नियंत्रण नेटवर्क के लिए सामान्यीकृत होता है, इलेक्ट्रोड (0-20 एमएस) के निकट न्यूरॉन्स के प्रत्यक्ष सक्रियण के लिए कोई परिवर्तन नहीं दिखाता है। इसलिए उन डिब्बे के लिए नियंत्रण और प्रशिक्षित नेटवर्क के बीच कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं है। दूसरी ओर, लंबे समय तक प्रतीक्षा अवधि (30-50 एमएस), synaptically मध्यस्थता कर रहे हैं, यह दर्शाता है कि इस पद्धति से ऊपर की चित्रा 15 की तुलना में विश्वसनीयता की अधिक विस्तृत जांच प्रदान की जाती है। ( बी ) जनसंख्या कील आवृत्ति विश्वसनीयता के व्यवहार को दोहराती है और प्रत्यक्ष सक्रियण (0-20 एमएस) के लिए कोई संशोधन नहीं दिखाती है, जबकि एक स्टेटलंबे समय तक की प्रतिक्रियाओं (30-50 एमएस) के लिए महत्वपूर्ण रूप से महत्वपूर्ण अंतर पाया जाता है यह व्यवहार पिछले आंकड़े 15 में औसत परिणामों के अनुरूप है त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि, 10 नियंत्रण नेटवर्क और 12 प्रशिक्षित नेटवर्क के लिए गणना की जाती है। (*) पी-मान <0.05; (**) पी-वेल्यू <0.001 संदर्भ से संशोधित चित्रा 15 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

मात्रा मद
1 आटोक्लेव ग्लास अभिकर्मक की बोतल (कम से कम 100 एमएल आकार)
20 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब
1 10 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
4 25 एमएल स्टीरिलई सेरोलॉजिकल पिपेट
2 50 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
1 अपकेंद्रित्र ट्यूब रैक
150 एमएल बाँझ डि पानी
5 मिलीग्राम पॉली-डी-लाइसिन वियल

तालिका 1: पीडीएल तैयारी - सामग्री और अभिकर्मकों की सूची।

मात्रा मद
1 50 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब
10 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब
2 1 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
2 50 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
1 अपकेंद्रित्र ट्यूब रैक
1 एमएल फास्फेटबफर खारा (पीबीएस)
1 मिलीग्राम laminin

तालिका 2: लैमिनिन तैयारी - सामग्री और अभिकर्मकों की सूची

मात्रा मद
1 आटोक्लेव ग्लास अभिकर्मक की बोतल (कम से कम 100 एमएल आकार)
20 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब
1 10 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
4 25 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
2 50 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
1 अपकेंद्रित्र ट्यूब रैक
150 एमएल बाँझ डि पानी
5 मिलीग्राम पॉली-डी-लाइसिन वियल

तालिका 3: भंडारण मध्यम तैयारी - सामग्री और अभिकर्मकों की सूची।

मात्रा मद
44 एमएल एल-ग्लुटामाइन के एक स्थिर प्रकार के साथ डीएमईएम (सामग्रियों की तालिका देखें)
1 एमएल तंत्रिका सेल संस्कृति के लिए सीरम मुक्त पूरक (सामग्रियों की तालिका देखें)
2.5 एमएल हार्स सीरम
100 μL एस्कॉर्बिक एसिड [4 मिलीग्राम / एमएल]
2.5 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस)
0.5 एमएल पेन स्ट्रेप (वैकल्पिक)
1 50 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब
2 25 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
2 10 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक </ Td>
2 1 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
1 250 एमएल फिल्टर

तालिका 4: डीएमईएम 5/5 माध्यमिक तैयारी - सामग्री और अभिकर्मकों की सूची।

मात्रा मद
49 एमएल एल-ग्लुटामाइन के एक स्थिर प्रकार के साथ डीएमईएम (सामग्रियों की तालिका देखें)
1 एमएल तंत्रिका सेल संस्कृति के लिए सीरम मुक्त पूरक (सामग्रियों की तालिका देखें)
100 μL एस्कॉर्बिक एसिड [4 मिलीग्राम / एमएल]
0.5 एमएल पेन स्ट्रेप (वैकल्पिक)
1 50 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब
2 25 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
2 1 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
1 250 एमएल फिल्टर

तालिका 5: डीएमईएम + मध्यम तैयारी - सामग्री और अभिकर्मकों की सूची।

मात्रा मद
1 पोपेन 140 यू / शीशी
1 Dnase 1,260 यू / शीशी
7 एमएल डीएमईएम + (ठंडा)
5 एमएल डीएमईएम 5/5 (गर्म)
10 μL ट्राइपैन नीला
2 स्केलपेल ब्लेड
1 35 मिमी बाँझ पेट्री डिश
4 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब
2 5 एमएल बाँझ क्रायोजेनिक ट्यूब
2 2 एमएल बाँझ क्रायोजेनिक ट्यूब
1 50 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब
1 सूक्ष्मदर्शी ट्यूब
2 बड़े बोर हस्तांतरण विंदुक
3 लघु बोर हस्तांतरण विंदुक
5 2 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
5 1 एमएल बाँझ सीरमिक विंदुक
2 10 μL बाँझ micropipette युक्तियाँ
1 1000 μL बाँझ micropipette युक्तियाँ
1 हेमोसाइटोमीटर चिप

तालिका 6: सेल डिसोसिएशन - सामग्री और अभिकर्मकों की सूची।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित कदम विदेशों के लिए प्लेटफॉर्म पर अपनी न्यूरोनल संस्कृतियों की शुरुआत करने के लिए और नेटवर्क गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त विवरण प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल यह सुनिश्चित करने में मदद करेगा कि संस्कृतियां ठीक से पालन करती हैं, इलेक्ट्रोड सरणियों पर कोशिकाओं के कालीन परत का निर्माण करती है, और महीनों के लिए स्वस्थ और दूषित-मुक्त रहती हैं।

यद्यपि प्रोटोकॉल के सभी हिस्सों का पालन करना सबसे अच्छा है, लेकिन सफल परिणाम के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में कदम हैं। पूरी प्रक्रिया में सड़न रोकनेवाला तकनीक का इस्तेमाल संस्कृतियों को दूषित होने से रोकने के लिए आवश्यक है। नए MEAs को हाइड्रोफिलिक बनाया जाना चाहिए, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है, या फिर खराब सेल आसंजन का परिणाम होगा। कठोर pipetting और हदबंदी के दौरान हवा के बुलबुले के गठन से बचने क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की संख्या कम हो जाएगा और एक उच्च और स्वस्थ उपज के लिए नेतृत्व करेंगे। पहले डीएमईएम 5/5 से डीएमईएम + पर स्विच करनाभोजन भी महत्वपूर्ण है डीएमईएम 5/5 में घोड़ा सीरम होता है, जिससे ग्लियाय कोशिकाएं संस्कृति पर हावी हो सकती हैं अगर लगातार इस्तेमाल की जाती हैं और न्यूरोनल गतिविधि खराब हो जाएगी, हालांकि संस्कृतियां स्वस्थ 17 दिखाई देगी। संस्कृतियों को शेड्यूल किए जाने और उचित इनक्यूबेटिंग स्थितियों में रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है।

विदेश मंत्रालय में चढ़ाना सेल संस्कृतियों में कई चर शामिल हैं जो कम-से-इष्टतम परिणामों तक पहुंच सकते हैं। यद्यपि लक्ष्य कोशिकाओं का एक परिपूर्ण "कालीन" है, हालांकि ऊपर उल्लिखित महत्वपूर्ण चरणों का समाधान करने में विफलता का परिणाम खराब सेल परिपक्वता या दूषित हो जाएगा। खराब सेल आसंजन, जो खराब सेल परिपक्वता से अलग है, यह भी एक चिंता का विषय है। यह कई कारकों के कारण हो सकता है, जिसमें पुरानी माध्यम के प्लेटिंग या उपयोग के पूर्व गरीब विदेश मंत्रालय की तैयारी भी शामिल है। यदि पुराने माध्यम में मस्तिष्क कोशिका संस्कृति के लिए एल-ग्लुटामाइन और सीरम मुक्त पूरक का एक स्थिर रूप है (देखें सामग्री तालिका) का उपयोग किया जाता है, कोशिकाएं शुरू में पालन करती हैं लेकिन फिर लगभग दो हफ्तों के बाद फ्लोट करती हैं। यदि जीवाणु दूषित एक लगातार समस्या है, तो एंटीबायोटिक, जैसे एम्पीसिलीन या पेन-स्ट्रेप, को मध्यम में जोड़ा जा सकता है। फंगल संबंधी प्रदूषण के इलाज के लिए उपलब्ध कवक भी उपलब्ध हैं। ये कुछ अधिक सामान्य चर हैं जो संस्कृतियों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। ऐसे कई अन्य लोग हैं जो केवल समय और अनुभव के बाद ही सामने आएंगे।

ग्लास माइक्रोइलेक्ट्रोड के उपयोग की तुलना में, यह तकनीक नेटवर्क गतिशीलता और औषधीय प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट है। यह कई अलग-अलग स्थैतिक-अस्थायी उत्तेजना के पैटर्न के उपयोग को सक्षम करता है और एक ही बार में कई क्षेत्रों से न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। पिछला समूहों ने यहां वर्णित लोगों के समान प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए दिलचस्प परिणाम प्रदर्शित किए हैं। चूंकि संस्कृतियों को सप्ताह या महीनों के लिए पिछले और उसी संस्कृति का पुन: उपयोग किया जा सकता है, इसलिए यह तकनीक भी एक हैएक ही नेटवर्क पर समय के साथ कई प्रयोगों के लिए llows

हालांकि, इस तकनीक की सीमाएँ हैं विदेश मंत्रालय गैर-आक्रामक हैं। इसलिए, वे केवल बाह्य गतिविधियों को रिकॉर्ड कर सकते हैं, जैसा कि पैकेट-क्लैम्पिंग या पिपेटों के साथ इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग के विपरीत है। इसके अलावा, क्योंकि एक सरणी में प्रत्येक इलेक्ट्रोड को कई कोशिकाओं द्वारा कवर किया जाता है, एक एकल न्यूरॉन की गतिविधि को हल करना संभव नहीं है। इसके विपरीत, क्योंकि ये इन विट्रो संस्कृतियों में हैं, वे मस्तिष्क में नेटवर्क के संरचनात्मक गुणों को पूरी तरह पुन: पेश नहीं कर सकते। इसके अलावा, गतिविधि को केवल एक समय में 30 मिनट से कम समय तक रिकॉर्ड किया जा सकता है, जो किसी तंत्र को पीएच संतुलन बनाए रखने के लिए कोशिकाओं के लिए सीओ 2 वायुमंडल प्रदान करते हैं।

एक बार इस तकनीक की महारत हासिल हो जाने के बाद, विद्युत उत्तेजना के साथ या बिना औषधीय जोड़तोड़ का पता लगाया जा सकता है। न्यूरॉनल नेटवर्क में सीखने और स्मृति निर्माण की जांच के लिए नए प्रोटोकॉल भी पी के साथ डिज़ाइन और परीक्षण किए जा सकते हैंहिप्पोकैम्पल या रीढ़ की हड्डी के नेटवर्क के लिए रोटोकॉल उत्तेजना और नेटवर्क के प्रशिक्षण के लिए प्रोटोकॉल पहले ही प्रकाशित किए गए हैं, और इनमें से कुछ को विवो प्रोटोकॉल में विकसित किया गया था, जैसे "ऐटान एट अल द्वारा प्रस्तावित" चयनात्मक अनुकूलन " 19 कई प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया था। हालांकि, 2005 में रूरो द्वारा प्रस्तावित टेटनस प्रक्रिया में संशोधन के परिणाम केवल 14 , 20 में प्रस्तुत किए गए हैं ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान CMMI-1300007 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम पिछले प्रयोगशाला सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं, जिन्होंने इन प्रोटोकॉल के डिजाइन और जॉर्ज मेसन यूनिवर्सिटी में पाँच वर्षों से संस्कृतियों के रखरखाव में मदद की है: डॉ। जोसेफ जे पंक्राजियो, डॉ। हामिद चरखकर, डॉ। ग्रेचेन कनाक , डॉ। फ्रांज हैमिल्टन, माइकल मकेरा, और रॉबर्ट ग्राहम

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4403 Make 4 mg/mL aliquots
B-27 Invitrogen 17504-044 Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze
Beakers - glass - 100 mL VWR 13912-160
Beakers - glass - 500 mL VWR 10754-956
Blunt-tipped thumb forceps World Precision Instruments 500365-G
Cryogenic vial - sterile, 2 mL Fisher Scientific 10-500-26
Cryogenic vial - sterile, 5 mL Fisher Scientific 10-500-27
DMEM with Glutamax Gibco Life Technology 10569-010 Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine
DNase Worthington Biochemical LK003172
Ethanol Fisher Scientific 04-355-451
Fetal bovine serum (FBS) ATCC 30-2030
Fine-tipped thumb forceps World Precision Instruments 501324-G
Glass Pipets VWR 14673-010
GlutaMAX -- I (100X) Gibco Life Technology 35050-061 A stabilized form of L-glutamine used as a suplement
Hemocytometer chip Fisher Scientific 22-600-101
Hibernate EB complete BrainBits D00118 Ambient CO2 cell storage media
Horse Serum Atlanta Biologicals S12195H
Laminin Sigma Aldrich L2020-1MG
MCS filter amplifier MultiChannel System FA60SBC
MCS headstage/pre-amplifier MultiChannel System MEA1060-INV
MCS microelectrode array MultiChannel System 60MEA200/10iR-ITO
MCS power supply MultiChannel System PS20W
MCS signal divider MultiChannel System SDMEA
MCS stimulus generator MultiChannel System STG4002
MCS temperature controller MultiChannel System TC02
Media storage bottle - glass 500 mL VWR 10754-818 Autoclave
Microcentrifuge tubes - 0.4 mL Thermo Fisher 3485 Autoclave
Microcentrifuge tubes - 2 mL Thermo Fisher 3434ECONO Autoclave
Micropipette tips - 10 μL VWR 37001-166 Autoclave
Micropipette tips - 1,000 μL  VWR 13503-464 Autoclave
Micropipette tips - 200 μL  VWR 37001-596 Autoclave
Micropipetter - 10 μL  Thermo Fisher 4641170N
Micropipetter - 1,000 μL  Thermo Fisher 4641210N
Micropipetter - 200 μL  Thermo Fisher 4641230N
Papain - 0.22 Filtered Worthington Biochemical LK003178
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) Thermo Fisher 15070063
Petri dishes -100 mm disposable Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes -100 mm glass VWR 10754-788
Petri dishes -35 mm  Fisher Scientific 08-757-100A
Phosphate buffer saline (PBS) (1x) Corning 21-040-CV
Plasma Cleaning System Plasma Etch, Inc. PE-50
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma Aldrich P6407-5MG
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL Fisher Scientific 05-527-90
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL Falcon 352070
Procedure masks Imco 1530-imc
Pyruvate Sigma Aldrich P4562-5G
Scalpel blades World Precision Instruments  500237-G
Scissors - iris World Precision Instruments 14111-G
Scissors - large World Precision Instruments 14214
Scissors - small surgical World Precision Instruments  501733-G
Serological pipette - sterile, 1 mL  VWR 89130-892
Serological pipette - sterile, 2 mL  VWR 89130-894
Serological pipette - sterile, 25 mL  VWR 89130-900
Serological pipette - sterile, 50 mL  VWR 89130-902
Software: Matlab GUI Peixoto Lab npeixoto@gmu.edu Used to analyze .mat files.  Available for free upon request.  Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy.
Software: MCS MC_Rack MultiChannel System N/A Used for data acquisition
Software: NeuroExplorer Plexon  http://www.plexon.com/products/neuroexplorer Used to convert .nex files to .mat
Software: Offline Sorter Plexon  http://www.plexon.com/products/offline-sorter Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex
Software Manual: MCS MC_Rack MultiChannel System https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf
Software Manual: NeuroExplorer Plexon  https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf
Software Manual: Offline Sorter Plexon  www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf
Spatula - small double-ended World Precision Instruments  503440
Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL Millipore SCGVU02RE
Transfer pipette - large bore  Thermo Fisher 335-1S
Transfer pipette - small bore  Thermo Fisher 242-1S
Trypan blue Sigma Aldrich T8154-20ML
Whatman filter paper Whatman 1442 150 Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish

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References

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माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ पर न्यूरोनल सेल संस्कृतियों की उत्तेजना के लिए नेटवर्क रिस्पांस में समय पर निर्भर वृद्धि
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Gertz, M. L., Baker, Z., Jose, S., Peixoto, N. Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (123), e55726, doi:10.3791/55726 (2017).

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