Summary
Çok elektrotlu diziler üzerinde kültürlenen fare nöronal hücreleri, elektrik stimülasyonunu takiben yanıtta bir artış sergilemektedir. Bu protokol, nöronların nasıl kültürlendiğini, aktivitenin nasıl kaydedildiğini ve uyarılma modellerine cevap vermek için ağları eğitmek için nasıl protokol oluşturacağını gösterir.
Abstract
Mikro elektrod dizileri (MEA'lar) ilaç toksisitesini araştırmak, yeni nesil kişiselleştirilmiş tıp için tasarım paradigmalarını ve nöronal kültürlerde ağ dinamikleri incelemek için kullanılabilir. Tek bir hücreden yalnızca aktivite kaydedebilen yama sıkıştırma gibi geleneksel yöntemlerin aksine, ÇÇ'lar, her bir elektrodun ayrı ayrı yerleştirilmesi zorlu bir görev gerektirmeden, bir ağdaki birden çok alandan aynı anda kayıt yapabilir. Dahası, çok sayıda kontrol ve uyarılma konfigürasyonu, aynı deneysel kurulumda kolayca uygulanabilir ve geniş bir dinamik aralığı keşfedilebilir. Bu in vitro araştırmalarda ilgi çekici anahtar dinamiklerden biri, kültürlü şebekelerin öğrenme göstergesinin özelliklerini ne ölçüde sergilediğidir. MEA'lar üzerinde kültüre edilen fare nöronal hücreleri, elektrik uyarımı ile indüklenen eğitimi takiben yanıtta bir artış sergilemektedir. Bu protokol, ÇKA'lardaki nöronal hücrelerin nasıl kültive edileceğini gösterir; Başarıyla tekrarKaplamalı tabakların% 95'inden fazla kablo; Teşvik modellerine cevap vermek için ağları eğitmek için bir protokol oluşturun; Ve bu tür deneylerden elde edilen sonuçları sıralayabilir, arsa ve yorumlayabilir. Nöronal kültürlerin uyarılması ve kaydedilmesi için tescilli bir sistem kullanılması gösterilmiştir. Yazılım paketleri ayrıca nöronal üniteleri sıralamak için kullanılır. Özel uyarlanmış bir grafik kullanıcı arabirimi, uyarı sonrası zaman histogramlarını, kesintisiz aralıklarla ve patlamanın süresini görselleştirmenin yanı sıra, bir eğitim protokolü öncesi ve sonrasında uyarıya hücresel yanıtı karşılaştırmak için kullanılır. Son olarak, bu araştırma çabasının temsili sonuçları ve gelecekteki yönleri tartışılmaktadır.
Introduction
Mikro elektrot dizileri (MEA'lar) ilaç toksisitesini araştırmak, yeni nesil kişiselleştirilmiş tıp için tasarım paradigmalarını ve nöronal kültürlerde ağ dinamikleri incelemek için kullanılabilir 1 . Yalnızca tek bir hücreden aktiviteyi kaydedebilen ya da elektrodu tek bir alanda çevreleyen nöronlardan hücre dışı tepkileri kaydedebilen cam pipetle alan kaydı gibi daha geleneksel yöntemlerin aksine, MEA'lar aynı anda Her elektrotu tek tek yerleştirmenin zorlu görevini gerektirmeden hücre kültüründe birden fazla bölgeden kayıt yapabilirsiniz. Bu, o kültür içinde bir ağ oluşturan hücreler grubu arasındaki dinamik etkileşimlerin çalışılmasına olanak tanır. Ayrıca, 2 , 3 , 4 , 5 şebeke ateşleme modelleri ve şebeke kontrolü için elektriksel uyarıların etkisi 6 </ Sup> nöronal kültürlerde iyi belgelenmiştir ve sayısız konfigürasyon elektrik stimülasyonu ve kontrolleri, aynı deney düzeneğinde kolayca uygulanabilir ve geniş bir aralıktaki uzaysal-zamansal dinamiklerin araştırılmasına izin verilir.
Bu in vitro araştırmalarda ilgi çekici anahtar dinamiklerden biri, kültürlü şebekelerin öğrenmeyi gösteren özellikleri gösteren 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 olmuştur. Peixoto Laboratuarı daha önce, yüksek frekanslı eğitim sinyallerinin etkilerini Ruaro ve ark. 14 , mikroelektrod dizilerine kaplanmış fare nöronlarının ağlarında 15 . Bu deneylerde, şebekeler yanıt izlemede artış gösterdiElektriksel uyarım ile indüklenen g eğitimi. Artan tepki, uyarıcı tanıma yoluyla öğrenme biçimi olarak kabul edildi; ağlar belirli bir uyarı ( örn., Eğitim) protokolünün uygulanmasından sonra uyarandaki bir değişime tutarlı bir şekilde yanıt verdi.
Bu protokol, ÇÇ'larda nöronal hücrelerin nasıl kültürlendiğini, kaplanan yemeklerin% 95'inden başarıyla kaydedildiğini, uyarı modellerine cevap vermek için ağları eğitmenin, tek üniteli aktiviteleri sıralamanın, histogramların çizilmesini ve sonuçların nasıl yorumlanacağını gösteren bir protokol oluşturmayı göstermektedir. Böyle deneyler. Nöronal kültürlerin uyarılması ve kaydedilmesi için tescilli bir sistemin kullanılması ( Malzeme Tablosuna bakınız ) yanı sıra, nöronal üniteleri sıralamak için yazılım paketlerinin uygulanması (Malzemelerin Tablosuna bakınız ) gösterilmiştir . Özel tasarlanmış bir grafik kullanıcı arabirimi (Malzeme Tablosuna bakınız) post-s'leri görselleştirmek için kullanılırTimulus zamanı histogramları, inter-burst aralıkları ve patlamanın süresini belirlemek ve ayrıca bir antrenman protokolü öncesi ve sonrasında uyarıya hücresel cevabı karşılaştırmak için kullanılmıştır.
Protocol
Bütün hayvansal prosedürler NIH kurallarına ve / veya Laboratuar Hayvanlara Hayvan Bakımı ve Kullanımı Üzerine Halk Sağlığı Hizmetleri Politikasına uymaktadır ve George Mason Üniversitesi'nde kurumsal olarak onaylanmış bir hayvan bakımı ve kullanımı protokolü (IACUC) altındadır.
1. Malzeme Hazırlama
- Aşağıdaki malzemeleri otoklavda tutun: (2) 500 mL'lik beherlerde dikey olarak yerleştirilmiş 5.75 inç uzunluğunda cam pipetler, yaklaşık 24 parça filtre kağıdı (150 mm çaplı, her biri 8 kama şeklinde kesilmiş, gözenek boyutu önemli değil), 1000 μL filtrelenmiş pipet Ipuçları, 200 μL filtrelenmiş pipet uçları, 10 μL filtrelenmiş pipet uçları ve yıkamalar için deiyonize (DI) su (en az 200 mL).
- Reaktifleri ve ortam hazırlayın.
- Tüm reaktifleri ve ortamları aseptik teknikler kullanarak biyolojide hazırlayın.
- Tablo 1'e göre Poly-D-lisin (PDL) hazırlayın.
- PDL'yi steril DI su ile karıştırarak nihai bir c'ye karıştırın.50 μg / mL konsantrasyonu, aşağıdaki gibi. 96 mL steril DI suyu bir otoklavlanmış cam reaktif şişesine aktarmak için steril serolojik bir pipet kullanın.
- PDL içeren üretici flakona 4 mL steril DI su eklemek için steril bir serolojik pipet kullanın. PDL'yi pipet ile çözün. PDL çözeltisini, 96 mL steril DI suyu içeren cam reaktif şişesine aktarmak için aynı pipeti kullanın.
- Biyolojiden çıkarmadan önce şişeyi sıkıca kapatın ve çözeltiyi vorteksleyin. Biyolojide, çözeltiyi 5 mL'lik alikotlara bölün; Kullanılmayan çözeltiyi -20 ° C'de dondurun. Çözülmüş PDL bir kez yeniden dondurulabilir. Çözülmüş solüsyonu daha önce dondurulduysa atın.
- Tablo 2'ye göre laminin solüsyonu hazırlayın.
- Laminin'i, aşağıdaki gibi, 20 ug / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar PBS ile karıştırın. 49 mL PBS'yi 50 mL santrifüj tüpüne aktarmak için steril bir serolojik pipet kullanın.
- Steril serolojik bir madde kullanınL lıminin uygun ağırlığını içeren üretici flakona 1 mL PBS eklemek için pipetle pipetleyin. Laminin pipet ile eritilir. Laminin çözeltisini 49 mL PBS içeren 50 mL santrifüj tüpüne aktarmak için aynı pipeti kullanın.
- Biyolojiden çıkarmadan önce boruyu sıkıca kapatın ve çözeltiyi vorteksleyin. Biyolojide, çözeltiyi 5 mL alikotlara bölün; Kullanılmayan çözeltiyi -20 ° C'de dondurun. Çözülmüş laminin yeniden dondurulamaz; Kullanılmayan çözülmüş çözeltiyi atın.
- Tablo 3'e göre depolama ortamını hazırlayın.
NOT: Depolama ortamı, dokuyu ortam CO 2 seviyelerinde bir aya kadar saklamak için kullanılır. Satın alınabilir (materyal tablosuna bakınız) veya aşağıdaki genel tarifi kullanarak hazırlanabilir: Ortamdaki CO 2 hücre depolama ortamı + Sinir hücresi kültürü için% 2 serumsuz takviye + 0.5 mM hücre kültürü ortamı, stabilize edilmiş L-glutamin formunu (materyal tablosuna bakınız).- 10 mL saklama ortamı yapmak için CaCl2 içermeyen embriyonik doku için 10 mL'lik bir depolama ortamı 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Sinir hücresi kültürü için 210 uL serumsuz takviye ve L-glutamin'den stabilize edilmiş 55 μL'lik bir bileşik ekleyin. Ters çevirerek hafifçe karıştırın.
- Depolama ortamı ışığa duyarlı olduğundan, 15 mL'lik santrifüj tüplerini alüminyum folyo ile kaplayarak koruyun. Tüp başına 2 mL depolama ortamı toplam 5 alikot için. 2 hafta kadar ya da kullanıma hazır oluncaya kadar buzdolabında saklayın, ancak donmazlar.
- Tablo 4'e göre DMEM 5/5 ortamı hazırlayın.
- Sinir hücresi kültürü, at serumu (HS), sığır fetüsü serumu (FBS) ve askorbik asit için serum-serbest takviyelerin alikotları çözülür. Bakteri kirliliğini kontrol altına almak için gerekirse kalem ızgarasını bir miktar çözdürün. Her bir maddeyi 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne pipetleyin. Pipet uçlarının herhangi bir yüzeye veya nesneye dokunmadığından emin olunts.
- Biyolojinin içinde vakum kapalıyken filtreyi vakum tüpüne bağlayın. Karışımı filtre tepsisine dökün ve kapatın. Biyolojide vakum açın ve orta filtrenin kabın altına gelmesine izin verin. Vakumun kapatılmasından önce filtreyi vakumdan çıkarın.
- Steril orta kap üzerindeki kapağı sıkıştırın, etiketleyin ve kullanılmayan ortamı 4 ° C'de bir aya kadar saklayın. Ortamı steril tutmak için biyolojik ortamdaki kabı açın.
- Tablo 5'e göre DMEM + ortamı hazırlayın.
- Sinir hücresi kültürü ve askorbik asit (ve gerekiyorsa kalem strep) için serum içermeyen örneklerin alikotlarını çözdürün. Her bir maddeyi 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne pipetleyin. Kalan işlem için 1.2.5.2-1.2.5.3 adımlarını tekrarlayın.
2. Dizgi / Kap Hazırlama
NOT: Yordamda kullanılan ÇÇA'lar 60 kanallı dizilerdir o8 x 8 karede rganizedir. Elektrod arası mesafe 200 μm'dir ve her elektrod 10 μm çapındadır. Parçalar için iletken malzeme titanyum ve elektrotların kendileri TiN'den yapılmıştır. Elektrodların çevresindeki cam halka 6 mm yüksekliğindedir, dış çapı 24 mm'dir. MEA'yı örtmek için polioksimetilen (POM) bir kapak kullanılır ve kayıt ve uyarılma oturumlarında kontaminasyonu önlemek için gaz geçirgen / sıvı geçirimsiz bir florinatlanmış etilen propilen (FEP) film kullanılır.
- Kaplamadan önceki gün.
- Kullanılmayan ÇÇ'ları plazmaya maruz bırakarak hidrofilik hale getirin; Bu genellikle ilk kullanımdan sonra gerekli değildir. Kontrol kültürleri için kullanılan cam lamellerin plazma tedavisi aldığından emin olun.
NOT: Plastik tabaklar (35 mm) kontrol çanakları olarak da kullanılabilir ve herhangi bir ön işleme tabi tutulması gerekmez.- Plazma işlemini 40-60 saniye süreyle yarım güçle (50 W) bir plazma etöre uygulayarak uygulayın,Oda basıncı 100-150 mT'ye ayarlanır.
- ÇÇ'ları derhal su ile doldurun. Lambızları, DI su ile dolu bir Petri kabına batırın. DI suyu yaklaşık 15 dakika boyunca muamele edilmiş yüzeylerle temas halinde bırakın.
- Biyolojik ortamda, DI suyunu boşaltın. ÇÇA'ları ağzına% 70 etanol ile doldurun. Lamelleri içeren Petri kabından DI suyu çıkarın ve lamelleri tamamen suya batıncaya kadar Petri kabına etanol doldurun. Bunun 10-15 dakika oturmasına izin verin.
- Tüm Petri yemeklerini ve kontrol yemeklerini MEA ID #, ameliyat tarihi, hücre tipi ve baş harfleri ile etiketleyin. Ardından, her MEA'yı etiketli Petri kabına yerleştirin.
- ÇÇ'ları tek tek Petri kaplarına yerleştirin ve vakum emiş kullanarak etanolü alın. Artık etanolü uzaklaştırmak için ÇÇA'ları steril DI su ile doldurun. DI suyunu çıkarmak için vakum emiş kullanın. ÇÇA'ları biyolojik ortamda kurumaya bırakın.
- 40-70 uL 50 ug / mL poli-D-lisinE (PDL; yüksek molekül ağırlığı, en az 50 kDa) her bir MEA'nın merkezine ve steril pipet uçları kullanarak kontroller için 0.2 mL'ye uygulayın.
NOT: Elektrotlara zarar verebileceğinden MEA'nın merkezine, pipetle, ucuyla dokunmamaya dikkat edin. Dağıtılan tam PDL miktarı, yüzeyin hidrofilitesine bağlıdır. - Her çanağa küçük bir laboratuvar doku kağıdı yerleştirin ve gece boyunca PDL buharlaşmasını önlemek için steril suyla ıslatın. Biyolojiden çıkarmadan önce tüm tabakları örtün. Bulkuları bir gece boyunca 37 ° C'de inkübatöre yerleştirin.
- Kullanılmayan ÇÇ'ları plazmaya maruz bırakarak hidrofilik hale getirin; Bu genellikle ilk kullanımdan sonra gerekli değildir. Kontrol kültürleri için kullanılan cam lamellerin plazma tedavisi aldığından emin olun.
- Kaplama günü.
- Kaplama gününde, lamininin 1 kısım (20 μg / mL) çözülmüştür; Her MEA, 40-50 μL laminin gerektirir ve her bir kontrol çanağı, 0.2 mL laminin gerektirir. Kullanılacak MEA'lar ve kontrollerin sayısına bağlı olarak gerekli laminin hacmini hesaplayın.
- İnkübatördeki tüm yemekleri biyolojikliğe aktarın.
- Tüm ÇÇ'ları steril olarak doldurunDI suya steril bir serolojik pipet kullanarak ve 10-15 dakika boyunca oturmalarına izin verin. Suyu steril Pasteur pipetlerini kullanarak aspire edin ve işlemi iki defa tekrarlayın.
- Steril pipet ipuçları kullanarak kontrol plakalarına her MEA'nın merkezine çözülmüş laminin 40 - 50 μL ve lamininin 0.2 mL ekleyin. Tüm ÇÇA'ları ve kontrol yemeklerini biyolojik ortamda kaplayın ve 1 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre aktarın.
- MEA'ların merkezindeki aşırı laminin dikkatli bir şekilde steril Pasteur pipetleri ile emilerek temizlenmeli ve kaplamadan önce yüzeyi hava ile kurutulmalıdır.
- Yemekleri biyolojik olarak bırakın veya hücreleri plakaya hazır olana kadar bir inkübatöre yerleştirin.
NOT: Yemekler ertesi güne kadar inkübatörde kalabilir. Bununla birlikte, daha fazla zaman gerekiyorsa, bulaşıkların temizlenmesi ve poli-D-lizin (PDL) adımından başlanması önerilir (adım 2.1.6).
3. Embriyo Çıkarma ve Beyinçıkarma
- L-15 (Leibovitz) orta maddesini 100 mm'lik Petri kaplarından 4'e dökün. Onları örtün ve -20 ° C'lik bir dondurucuda, orta derecede kaba bir kıvama gelinceye kadar, ancak donmuş katı (~ 40-60 dakika) olmadan yerleştirin.
- Diseksiyon öncesi bunu yaklaşık 40 dakika ila 1 saat yapın.
NOT: Bu, embriyoları ve beyinleri hızla soğutur, böylece sıkı bir tutarlılığa sahip olur ve ekstraksiyon sırasında çözülmez. - Embriyo çıkarma için diseksiyon alanını hazırlayın.
- Buz ile bir tepsiyi lavabonun yanına yerleştirin ve embriyo çıkartmak için cerrahi aletleri ve malzemeleri yerleştirin. Bunlar arasında soğuk L-15 "slush", kağıt havlu,% 70 etanol içeren bir sprey şişesi, künt-burun başparmak forsepsi, ince forsepsler, küçük cerrahi makaslar ve büyük makas içeren 4 petri yemeği yer alıyor ( Şekil 1 ).
- Beyin çıkarma için diseksiyon alanını hazırlayın.
- Bir cam Petri kabı yerleştirinBuz dolu bir tepsiye yerleştirin.
- Kağıt havlu, küçük cerrahi makas, ince çift uçlu bir spatula,% 70 etanol ile doldurulmuş bir sprey şişesi ve karkasın atılması için bir plastik torba da dahil olmak üzere beyin ekstraksiyonu için cerrahi aletleri ve malzemeleri yerleştirin ( Şekil 2 ).
- Bir laboratuvar ceketi, yüz maskesi ve eldiven giyin. Eldiven dahil tüm çalışma yüzeylerine% 70 etanol püskürtün.
NOT: Bu steril bir prosedür olmasa da, mümkün olduğunca kontaminasyon şansını azaltmak en iyisidir. - NIH kuralları 16 ve / veya Laboratuar Hayvanlara Hayvan Bakımı ve Kullanımı Üzerine Halk Sağlığı Hizmetleri Politikası ve birleşik olarak onaylanmış bir hayvan bakımı ve kullanımı protokolü (IACUC) uyarınca, CO 2 boğulması için E17 zamanlanmış gebe bir fareyi Euthanize edin. Panik ya da diskoya neden olmamak için CO 2 gazını 3 ila 5 dakika süreyle odaya yavaşça bıraktığınızdan emin olunFare mfort.
- Fareyi kesip, kağıt havlu, ventral taraf yukarıya yerleştirin. Alt karnına% 70 etanol püskürtün. Küçük cerrahi makas kullanarak, cildi ve alt karın subkutan yağını V şeklinde kesip, gövdeyi torasik boşluğun distal uçlarına kadar uzatarak uterusun ortaya çıkmasını sağlayın.
- Forseps kullanarak, embriyolar arasındaki uterus dikkatlice kaldırın. Tüm uterus serbest olana kadar bağ dokusunu diseksiyon makasıyla kesin. Herhangi bir kanı çıkarmak için kısaca% 70 etanolle çalkalayın ve soğuk L-15 ile doldurulmuş 4 Petri kapından birine yerleştirin.
- Bir çift ince uçlu forseps kullanarak uterus ve iç embriyonik keseden her embriyo serbest bırakın. Göbek kordonunun koptuğundan ve plasental kese çıkarıldığından emin olun. Serbest embriyoları soğuk L-15 ile dolu ikinci bulaşıkta yerleştirin. Embriyoları forseps ve makasla kesmek. Forseps kullanarak kafaları üçüncü bir Petri kabına aktarın ve gövdelerDördüncü, her ikisi de soğuk L-15 dolu.
4. Frontal Cortex Giderilmesi
- Bir biyolojik ortamda, soğutulmuş cam Petri kabı etabına otoklavlanmış bir filtre kağıdı yerleştirin. Filtre kağıdına tek bir embriyo başlığı yerleştirin. Hakim olmayan elle oküler boşluklardan bir çift forseps yerleştirerek kafatasını tutun. Bir çift iris makası ile deriyi ve alttaki kas dokusunu çıkarın.
- İris makasının alt dikişinin kesici kenarını kafatasının tabanına yerleştirin. Alt tabakayı, kafatasının iç yüzeyine karşı beyinden uzak tutmak, oksipital plakayı kesip, sonra da parietal plakalar arasındaki orta çizgiyi keser. Kıkırdak önü kafatası plakaları arasında rostral olarak kesmeye devam edin.
- Oksipital tabakanın ortasından başlayarak, ortadaki kesimin sağında ve solunda dikey bir kesim yapın.
- Ventral yüzey arasında dikkatli bir şekilde küçük bir spatula kaydırarak beyni çıkarınBeyin ve alt kafatası plakaları tamamen beynin altına gelene kadar. Ispanağı kaldırın; Bütün beyin bozulmadan ortaya çıkacak.
- Beynin kağıda yapışıp kalmayacağı şekilde filtre kağıdına birkaç damla L-15 solüsyonu yerleştirin ve beyni spatula üzerindeki filtre kağıdına, ventral yüzeye hafifçe kaydırın. Koku motorlu ampulü dikkatle spatula ucuyla kesin.
- Temiz bir spatula kullanarak frontal lobu yamuk biçiminde inceleyin. Saklama ortamı içeren 15 mL santrifüj tüpüne doku aktarın. Kalan embriyolarla yukarıdaki işlemleri tekrarlayın. Her seferinde taze bir filtre kağıdı kullandığınızdan emin olun ( örneğin, bir kama filtresi kağıdı başına kama).
5. Hücre Ayrımı
- Biyolojide, Tablo 6'da listelenen maddeleri bir araya getirin.
- Bir papain şişesine 5 mL DMEM + eklemek için steril bir serolojik pipet kullanın; Isıtılmış DMEM +, papaini daha iyi çözmek için kullanılabilir. NazikçeÇözümü karıştırmak için pipet.
- Bir DNase şişesine 0.5 mL DMEM + eklemek için steril bir mikropipet kullanın. DNase, shear denaturasyona duyarlı olduğu için, DNase çözeltisi hazırlanırken güçlü pipetleme yapmaktan kaçının.
- 2.5 mL papain solüsyonunu steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve aynı tüpe 125 uL DNaz ekleyin. Kapatılan santrifüj borusunu yaklaşık 8 kez hafifçe ters çevirerek çözeltiyi karıştırın.
- Steril, geniş çaplı bir pipet kullanarak, saklama ortamını içeren tüpten dokuyu çıkarın ve steril, 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Mümkün olduğunca az miktarda toplarlar. Mümkün olduğunca dokuyu çıkarmadan fazla fazla depolama ortamı çıkarmak için steril bir pipet kullanın. Doku orta düzeyde yüzen olmamalı, ancak nemli olmalıdır.
- Doku kesmek için iki steril bisturi bıçağı kullanın. Petri kabındaki kıyılmış dokuya 2.5 mL DNaz / papain karışımı eklemek için steril bir serolojik pipet kullanın. Petri kabını hafifçe döndürerekŞapka çözeltide tüm dokuların serbesttir ve tabağın tabanına yapışmaz. Çanağı 37 ° C'de 15 dakika inkübatöre yerleştirin.
- Biyolojide, tüm medya ve dokuları steril 5 mL kriyojenik bir tüpe aktarmak için steril, geniş çaplı bir pipet kullanın. Aynı geniş çaplı transfer pipet ucunu tüpün tabanına yakın yerleştirin. Yavaş yavaş 10-15 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak toz haline getirin.
- Pipetleme yaparken kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. İşlemi homojen bir karışım sağlanıncaya dek küçük çaplı bir transfer pipeti kullanarak tekrarlayın. Doku çözülmemişse, 1000 μL'lik bir pipet kullanarak toz haline getirin.
- Ayrışan hücre karışımına 2 mL sıcak DMEM 5/5 ilave edin. Hala biyolojide iken santrifüj tüpünü kapatın. Ters çevirerek yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında (20-25 ° C) 5 dakika boyunca yaklaşık 573 xg'de santrifüjleyin.
- Biyolojide, tüm süpernatanı uzaklaştırmak ve süpürmek için steril bir serolojik pipet kullanın;pelet. Hücreleri tekrar süspanse etmek için tüp içindeki pelet içine 1 mL ısıtılmış DMEM 5/5 eklemek için steril bir pipet kullanın. Karışım homojen olana kadar nazikçe yukarıya ve aşağı pipetle pelet parçalamak için steril, küçük delikli bir pipet kullanın.
NOT: pipetleme yaparken kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Çok az doku toplanırsa, sadece 0.5 mL DMEM 5/5 ilave edin. - Biyolojinin içinde, 10 μL hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için steril bir pipet kullanın. Biyolojinin dışında, mikrosantrifüj tüpünde 10 μL hücre süspansiyonuna tripan mavisi 10 μL ekleyin.
NOT: Bu adım sterildir gerektirmez. - Hücreleri saymak için tek kullanımlık bir hemositometre çipi içine 10 mcL'lik Tripan mavisi hücre süspansiyonu yükleyin.
6. Kaplama Hücreleri
- Biyolojide, her dizinin merkezine ve her kontrol Petri kabına hücre süspansiyonunun 50 μL'sini aktarmak için steril bir mikropipet kullanın. Bir pi kullanınÇanak başına pette ucu. Hücreleri tam olarak dizinin merkezine koyduğunuzdan emin olun. Torbadaki steril su ile laboratuvar doku kağıdını ıslatın veya her çanağa yeni doku kağıdı yerleştirin. Bulaşıkları örtün.
- Kaplanmış Petri kaplarını 37 ° C'ye ve% 10 CO 2'ye 3-4 saat inkübatöre yerleştirin.
- Biyolojide, hafifçe her MEA'ya 1 mL sıcak DMEM 5/5 ilave edin.
NOT: Ortamı eklerken hücreleri merkez diziden uzak tutarak yıkamayın (önemli!). Çok dikkatli bir şekilde, iç kenarların çevresine bir damla eklemek için steril bir mikropipet kullanın. - Her bir MEA üzerine gaz geçirgen bir FEP zar içeren bir kap yerleştirin. Onları iki gün boyunca kuluçka makinasına geri ver.
NOT: Başlık kirlenme ve buharlaşmayı önler. Onları MEA üzerine koymadan önce %% etanol ile kapların kurumasını sağlayan aseptik tekniği uygulayın. Kültürler, biyolojide sınırlanmalı ve her zaman sınırlandırılmalıdır.
7. AnaKültürleri korumak
- İki gün sonra, ılıman DMEM + ile komple bir değiştirme gerçekleştirin.
- Kültürleri çok uzun süre vurgulamaktan kaçınmak için inkübatörden biyolojikliğe yalnızca birkaç yemek yerleştirin.
- Merkezdeki hücrelere dokunmadan kaçınarak, çanağın iç duvarı üzerindeki pipetin ucunu dikkatlice yerleştirerek çanağın içindeki tüm ortamı çıkarmak için steril 1 mL'lik bir mikropipet kullanın. Kirlenmenin yayılmasını önlemek için çanak başına yalnızca bir pipet ucu kullanın.
- Plakanın ucunu dikkatle çanağın iç duvarı üzerine yerleştirerek 1 mL sıcak DMEM + dağıtmak için steril bir mikropipet kullanın.
- Yukarıda anlatıldığı gibi, haftada 2-3 kez ve beslemeler arasında en fazla 4 gün olmak üzere, ılıman DMEM + ile% 50 orta değişiklik yapın.
- Çanak orta 500 mcL çizmek için steril 1 mL mikropipet kullanın. 500 μL sıcak DMEM + dağıtmak için steril bir mikropipet kullanın. </ Li>
8. Görsel Kontroller ve Kayıt
- Çanak numunelerini mikroskop altında aralıksız olarak muayene edin (4X ve 10X büyütme kullanarak) ve bakteri veya mantar bulaşması (20X büyütme kullanarak) üzerinde hücre kapsama alanı arayın.
NOT: Şekil 3a , optimal hücre kapsama alanının bir örneğini gösterirken, Şekil 3b kötü hücre yoğunluğuna sahip bir kültürü göstermektedir. - Kaplamadan iki hafta sonra, spontan aktivite için MEA tabaklarının bir örneğini test edin. ÇÇA'lardan, aşağıda açıklandığı gibi, 3-5 dakika boyunca kaydedin. Aktivite mevcutsa sivri uçlar saptanır ( Şekil 4 ).
NOT: Araştırılacak deney türüne ve hipoteze dayanarak teste ne zaman başlayacağınızı belirlemek deneyleyene aittir.- Bir MEA'da faaliyet kaydetmek için aşağıdaki ekipmanları kullanın: güç kaynağı, amplifikatör, headstage / pre amplifikatör, Sıcaklık kontrol cihazı ve stimülasyon jeneratörü (materyal tablosuna ve Şekil 5'e bakınız).
- Kültürleri kuluçka makinesinden çıkarmadan önce sıcaklık denetleyicisini takın ve güç kaynağını (imalatçının talimatlarına göre) çalıştırarak, preamplifikatörün ısıtmalı taban plakasının 35 ° C'ye erişmesini sağlayarak sistemi açın.
- Sınırlandırılmış kültürün preamplifikatör içine yerleştirilmesi, böylece MEA'daki siyah çizginin referans zeminle hizalanması sağlanır. Preamplifikatör pinlerinin sıraya dizildiğinden, preamplifikatörün üst kısmının sabitlendiğinden ve kültür kapağının hala açık olduğundan emin olun.
- Kültür plakaya yerleştirildiğinde, veri toplama yazılımındaki "Change MEA" seçeneğini kaldırın (yazılım adları ve kullanım kılavuzları için materyal tablosuna bakın). Ayrıca, herhangi bir kayıt yapmadan önce "Kesme" etiketli kutunun işaretini kaldırın.
- T sonra "MEA_Select" bölümünde "Download" seçeneğini seçin.O kültür sisteme yerleştirilir. Devam etmeden önce programın "Download OK" yazdığından emin olun.
- Sinyalleri görselleştirmeye başlamak için yazılım ortamında "Başlat" a basın. Ana pencerede "Spikes" → "Algılama" → "Otomatik" seçeneğini seçin ve "Std Dev" değerini "5" olarak değiştirin ve eşiği sıfırlamak için "yenile" düğmesine tıklayın.
NOT: "Spikes" penceresinde, eşiği aşan çarpılar gösterilir. - Ana pencerede "Kaydedici" → "Kaydedici" → "Gözat" ı seçin. Tarih, saat, yemek ve deneyi tanımlamak için yol ve dosya adını değiştirin. Zaman sınırını ayarlayın ( örn., 5 dakika). "Durdur", "Kaydet" ve "Oynat" ı tıklayın. Kaydın otomatik olarak durduğunu unutmayın.
- Uyarım yazılımını açın. Bir dosya oluşturmak ve zaman ayarlamak için "Kaydedici" → "Kaydedici" → "Gözat" ı seçinSınırla Tekrar kaydetmek için "Dur", "Kaydet" ve "Oynat" ı tıklayın. Çanağa verilecek uyarı için "Download and Start" (uyarılma yazılımında) düğmesine tıklayın.
- Bulaşıkları değiştirmek için yazılım kontrolündeki "MEA Değiştir" düğmesini seçin.
NOT: Kültürü, CO 2 atmosferi korumak için bir sistem olmadan bir seferde 30 dakikadan fazla inkübatör dışına kültür tutmayın. Daha uzun kayıt oturumları gerekiyorsa, CO 2 sağlamak için piyasada bulunan bir adaptörü kullanın.
9. Eğitim Ağları
NOT: Şekil 6 , aşağıda açıklanan 9.1-9.3 adımlarının genel bir görünümünü göstermektedir.
- Hücre kültüründen 5 dakikalık spontan aktivite taban çizgisini kaydedin (adım 8'de açıklandığı gibi). Baz çizgi oluşturulduktan sonra, 0.5 Hz bifazikten oluşan 5 dakikalık bir ön eğitim problama stimülasyonunu uygulayınŞekil 8'de gösterildiği gibi seçilen stimülasyon elektrotları boyunca 200 μs darbe süresi ve 900 mV puls amplitüdlü ( Şekil 7a ) puls atabilir (stimülasyon elektrotlarını seçme ile ilgili detaylar için materyal tablosundaki yazılım kılavuzuna bakın).
- Eğitim öncesi uyarımı tamamladıktan sonra, tarama uyarımı ile aynı elektrotları kullanarak ağlara bir "eğitim" protokolü uygulayın. Yüksek frekanslı trenleri her 2 saniyede bir teslim edin, Hamilton ve ark. Şekil 15 ( Şekil 7b ve Şekil 7c ).
NOT: Eğitim sinyali 40 darbe treninden oluşur. Her darbe treni, 100 bifazik darbeden oluşur; darbeler arasında 4 ms, 200 μs darbe süresi ve 900 mV darbe genliği bulunur. - Egzersiz periyodunu tamamladıktan sonra, hücrelere antreman sonrası uyarımı 5 dakika uygulayın,Eğitim öncesi uyarı ile aynıdır. Eğitim sonrası stimülasyon sona erdikten sonra, ağdan uyarı sonrası kendiliğinden aktivite için 5 dakikanızı kaydedin (8. adımda açıklandığı gibi).
- Doğal dalgalanmalar veya sistemin durgunluğundan dolayı şebeke yanıtında olası değişiklikleri hesaba katmak için ayrı bir kontrol grubu MEA kullanın. Kontrol grupları, gerçek eğitim sinyali uygulanmayan bir sahte eğitim dönemi almak dışında, yukarıda açıklanan deney protokolünü bu kontrol gruplarına uygulayın.
10. Veri Analizi
Not: Veri dosyaları kaydedilir ve daha sonra tescilli bir sıralama yazılımı kullanarak nöronal üniteler halinde sıralanır (materyal tablosuna bakın). Birimleri yüklemek ve kültürlerdeki, kesişim aralıkları arasında, patlama süresinde ve uyaran sonrası zaman histogramında (PSTH) etkinlik modellerini analiz etmek için özelleştirilmiş bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) kullanılır (materyal tablosuna bakın). PSTHAnaliz edilmesi gereken en önemli grafiğin, ağın kutu boyutlarında (değişken uzunluktaki) aktivitesini sergilediği ve böylece ağın uyarıya verilen cevabın görsel bir sunumunu sağlamasıdır.
- Özel bir sıralama yazılımı kullanarak .mcd veri dosyalarını .plx formatına dönüştürün (yazılım adları ve kullanım kılavuzları için malzeme tablosuna bakın). .plx dosyasını aynı program içindeki yeni bir .plx dosyasına aktarın. Kanalları nöronal birimlere ayırın ( Şekil 9 ). Sıralama tamamlandıktan sonra, verileri bir .nex dosyası olarak dışa aktarın.
- .nex dosyasını ilgili yazılımda açın (bkz. Malzeme Tablosu ) ve analiz etmek için bir .mat dosyası olarak serbestçe bulunan özel oluşturulan GUI ile kaydedin (bakınız Malzeme Tablosu ).
NOT: Grafiksel kullanıcı arabirimi (malzeme tablosuna bakınız), PSTH'leri kullanıcı girdisine göre ( yani, PSTH nüfusu , önyargılı ortalama PSTH veya bireysel kanal PSTH), uyarılma deneyine genel bir bakış ve post-ve ön uyaran dosyaları arasında anlık karşılaştırma yapılmasına izin verir. Aynı zamanda ilk 6'ya ve son 6 uyarana karşı ağ tepkisini karşılaştıran ilk ve son PSTH'leri gösterir. GUI, hem uyarı dosyaları hem de kendiliğinden etkinlik gösteren dosyalar için başak oranı, aralıklar arası aralık, patlama başına düşen sivri uçlar, parazit aralığı ve patlama süresi gibi çeşitli diğer işlevleri yerine getirir. - Önce, başak trenleri içeren değişkenler ve uyarılma eserini içeren bir değişken içeren bir .mat dosyası seçin; Komut dosyası verileri analiz eder ve ana GUI sağda bir PSTH ortalama grafiği açılır ( Şekil 10 ).
- Tekli PSTH'yi (mavi renkte) ortalama PSTH'ye (kırmızıya kıyasla) görebilmek için aktif elektrod düğmelerine tıklayın.
NOT: Aktif elektrotlar, daha yüksek değerler (daha fazla kırmızı) daha büyükTepe PSTH değerleri, stimülasyona daha güçlü bir yanıt verdiğini gösterir. - Açılır menüyü kullanarak bir analiz seçeneği seçin. Elektrotların bir alt kümesini seçmek ve o alt grubun ortalamasını çizmek için "Biased Average" düğmesini seçin; Bu, bir kültür içindeki alt ağ davranışını karşılaştırmak için kullanışlıdır.
NOT: Açılır menüden seçilen çoklu analiz seçenekleri vardır ve bunların hepsi yazılımın "yardım" butonunda açıklanmıştır. - Şu anda görüntülenen grafiği yüksek çözünürlüklü bir jpeg dosyası olarak kaydetmek için "Save Graph" düğmesini seçin. Verileri bir elektronik tabloya vermek için "Veri Tablosu" düğmesini seçin.
- Tekli PSTH'yi (mavi renkte) ortalama PSTH'ye (kırmızıya kıyasla) görebilmek için aktif elektrod düğmelerine tıklayın.
Representative Results
Burada sunulan prosedürü kullanarak ( Şekil 11 ) , E17 fare nöronal hücreleri ile plakalı 60 kanallı MEA'lar kültürler, hücrelerin sağlıklı bir halıda dizileri kaplayana kadar inkübe edildi ( Şekil 12 ve Şekil 3a ) . % 10 C02 ve 37 ° C'de 3 hafta süreyle inkübasyondan sonra kültürler, ticari kayıt sistemi kullanılarak spontan aktivite açısından kontrol edildi (bkz. Malzeme Tablosu ). Sıcaklık, nüonal aktiviteyi ve ateşlenme oranlarını etkilediğinden, bir sıcaklık denetleyicisi kullanarak kayıt işlemi sırasında sıcaklık 37 ° C'de tutulmuştur.
Etkinlik için test
Kendiliğinden aktif şebekeler normalde değişen sinyal düzenleri sergilerler. Ortalama bir aktif kültür etkinliği birElektrotların yaklaşık% 40'ı. Bu aktif elektrod bölgelerinden neredeyse yarısı spontan sinyaller kaydeder, atış hızları 5 - 10 Hz arasında değişir. Spontan aktivitenin temsili bir çizimi Şekil 4a'da gösterilmiştir. Tik işaretleri, 20 saniyelik bir pencerede 9 aktif elektrottan 25 kHz'lik bir edinim hızında ve 300 Hz ile 3 kHz arasında bir bant geçiren filtre aralığı içinde kaydedilen aksiyon potansiyellerinin zaman damgalarını gösterir. Şekil 4b , sıralama prosedüründen önceki 8 patlama aktivitesi esnasında temel gürültüyü ve filtrelenmiş ham hücre dışı sinyali göstermektedir. Aksiyon potansiyellerini gürültüye ayırmak için, her bir kanalın eşikleri, temel gürültünün standart sapmasının 5 katına ayarlanır ve 500 ms penceresi 15 üzerinden hesaplanır.
Analizden önce, her bir elektrod için kaydedilen sivri uçlar, fizyoMantıksal aktivite ve uyarıcı eserler bir k-means algoritması ve prensip bileşen analizi kullanarak. Fizyolojik yanıt olarak tanımlanan sinyaller, her bir elektrotda bir nüfus tepkisi yaratmak üzere gruplandı ( Şekil 13 ve Şekil 9 ) .
Elektrik stimülasyonu ile sinir ağları eğitimi
Ağlar, bir uyarıcı jeneratörü kullanarak doğrudan MEA elektrotları vasıtasıyla kültüre uygulanan elektrik uyarımı kullanılarak eğitildi (materyal tablosuna bakın). Bu temsilci kümesinde, 13 elektrottan oluşan bir "L"-şekilli konfigürasyon kullanılmıştır ( Şekil 8 ), ancak birçok başka konfigürasyon uygulanabilir. Problama ve eğitim stimülasyonu, Ruaro ve ark. 14 .
Başlangıçta, stimülasyondan önce 5 dakika spontan aktivite kaydedilerek bir taban çizgisi belirlendi. Başlangıç noktası belirlendikten sonra, seçilen uyarı siteleri ( örn., "L") boyunca 200 μs darbe süresi ve 900 mV puls amplitüdü ( Şekil 7a ) ile 0.5 Hz bifazik darbeden oluşan 5 dk ön eğitim problama stimülasyonu uygulandı. şekilli). Daha sonra bir antreman protokolü, aynı set elektrotları kullanarak her 2 s ağa uygulanmıştır. Eğitim sinyali her biri 100 bifazik darbeli, 4 ms darbeli periyot, 200 μs darbe süresi ve 900 mV darbe genliği içeren 40 darbe treninden oluşuyordu ( Şekil 7b ve Şekil 7c ). Bu eğitim periyodunun ardından eğitim öncesi uyarıma benzer şekilde 5 dakikalık bir eğitim sonrası dönem izledi. Protokol daha sonraUyarılma sonrası spontan aktivitenin 5 dakikalık bir kaydı ile sonuçlandı.
Aynı deney protokolü, bir ağ kontrol yanıt grubundaki doğal dalgalanmaları hesaba katmak için bir kontrol grubu grubuna uygulanmıştır. Bununla birlikte, kontrol protokolündeki tek fark, gerçek bir eğitim sinyali uygulanmadığı bir sahte eğitim periyodunun uygulanması idi.
Veri setlerinin istatistiksel analizleri ( örn., Eğitimle kontrol), tek yönlü bir ANOVA ile, "eğitim" değişkenini konu-içi faktör olarak kullanarak gerçekleştirildi. Gecikme, bir özne içi faktör olarak kullanılmıştır. Önemli etkileşim bulunursa, Tukey'nin post-hoc işlemi gerçekleştirildi. Sonuçlar, uyarı sonrası 20 ms içerisinde bir antrenman öncesi tepki göstermiş olsa da, ilk yanıttan sonra etkinlik aralığı tutarsızdı. Bununla birlikte, eğitim sonrası etkinlik yalnızca ar Bununla birlikte, ön-eğitim sırasında görülen ilk uyaran-müdahaleden 20 ms sonra, ancak uyaran sonrası 30-50 ms'de önemli bir aktivite sergiledi ( Şekil 14 ve Şekil 15 ). "Uyarıdan sonraki süre" ve "uyarıdan sonraki süre" karşı "başak güvenilirliği" karşısında "başak frekansı" ile istatistiksel olarak anlamlı bir korelasyon vardı. "Spike güvenilirliği", bir uyarana bir yanıt ağı görme ihtimali olarak tanımlanabilir; burada her bir uyarıya verilen yanıt maksimum 1 değerine atanmıştır. Şekil 16 , başak frekansında neredeyse% 50 artış ve 30 Eğitilmiş ağlar için başak güvenilirliğinde% 50 artış, uyarandan sonraki 20-50 ms aralığında kontrol. Bu sonuçlar, eğitimin temel olarak ağ dinamiklerini değiştirdiğini göstermektedir.
1 "class =" xfigimg "src =" / dosyalar / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/>
Şekil 1 : Embriyo Sökme için kullanılan araçlar ve malzemeler. ( A ) Buz dolu tepsi. ( B ) Petri yemekleri soğuk L-15 "bulamaç" ile doldurulur. ( C ) Kağıt havlu. ( D )% 70 etanol ile püskürtme şişesi. ( E ) İnce forsepsler (x2). ( F ) Küçük cerrahi makas. ( G ) Künt-burun başparmak forsepsi. ( H ) Büyük makas. ( I ) Vücut çantası. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Beyin Çıkarma için Kullanılan Aletler ve Malzemeler. ( A B ) Embriyo kafaları içeren petri kabı. ( C ) Depolama ortamı olan folyo kaplı santrifüj tüpü. ( D ) Tepsi cam petri kabı. ( E ) Otoklavlı filtre kağıdı. ( F )% 70 etanol içeren beher. ( G ) Plastik pipet. ( H ) Iris makas. ( I ) İnce forseps. ( J ) İnce iki uçlu spatula. ( K ) Kağıt havlu. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Optimal ve Optimal Olmayan Kültürler. ( A ) hücrelerin dizilerini örten sağlıklı bir halı gösterir, aksine ( B ),Zayıf hücre çoğalması var. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Spontan Aktivitenin Temsilci Sonuçları. ( A ) Spontan aktivitenin temsili raster çizelgesi. Tik işaretleri, 25 kHz'lik bir edinim hızında ve 3 kHz ila 300 Hz arasında bir bant geçiren filtre aralığı içinde 20 saniye süreyle 9 aktif elektrottan kaydedilen aksiyon potansiyellerini belirtir. ( B ) Temsilci, aktif bir siteden hücre dışı eylem potansiyelini filtreledi. Şekil referans 15'den değiştirildi. Daha büyük bir versiyon görüntülemek için lütfen tıklayınızBu rakam n.
Şekil 5 : Kayıt Ayarı. ( A ) Uyarıcı jeneratör. ( B ) Sıcaklık kontrolörü. ( C ) Güç kaynağı. ( D ) Amplifikatör. ( E ) Sahne / ön yükseltici. ( F ) Kaplanmış MEA. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6 : Elektrik Eğitim Protokolünün Şematik Temsil Edilmesi. 5 dakika için bir başlangıç taban çizgisi ve 3 dakika süreyle bir prob stimülasyonu kaydedin. Tetanik stimulati uygula Kaydedilmemiş olan 90 saniye açık. 3. dakika için ikinci bir prob uyarımı uygulayın ve 5 dakika süreyle nihai bir başlangıç ölçümü yapın. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 7 : Sondalama Uyarıcı ve Eğitimi Sinyal Parametreleri. ( A ) Problama stimülasyonu 0.5 Hz'lik bir frekansta uygulanan ± 900 mV iki fazlı atımlardan oluşur. ( B ) Darbe trenleri, 250 Hz'lik bir frekansta 100, ± 900 mV iki fazlı darbelerden oluşur. ( C ) Eğitim sinyali, her 2 saniyede bir verilen 40 darbe treninden oluşur. Şekil referans 15'den değiştirildi."_blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 8 : "L" -shape Konfigürasyonunun Temsili. Kareler bir MEA'daki tek tek elektrotları temsil eder. Mavi kareler, uyarı için kullanılan elektrotları gösterirken, diğerleri kayıt için kullanılır. Şekil referans 15'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 9 : Birimlerin Gürültüyü ve Uyarıcı Yapılardan Ayrımlaştırılması. Birkaç üst paneller ( A -
Şekil 10 : Uyarıcı sonrası Zaman Histogramı (PSTH). Bir grafik kullanıcı arabirimi (Malzeme Tablosuna bakınız), PSTH'leri kullanıcı girişine göre ( yani, PSTH, önyargılı ortalama PSTH veya bireyselKanal PSTH), uyarı denemesinin genel bir görünümüne ve post-ve ön uyaran dosyaları arasındaki anlık karşılaştırmaya izin verir. Ayrıca, başlangıç ile nihai PSTH'leri de çizmektedir; Bu ağ yanıtını ilk 6 ve son 6 uyaranlarla karşılaştırır. GUI, hem uyarı dosyaları hem de kendiliğinden etkinlik gösteren dosyalar için başak oranı, aralıklar arası aralık, patlama başına düşen sivri uçlar, parazit aralığı ve patlama süresi gibi çeşitli diğer işlevleri yerine getirir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 11 : Hücre Hazırlama ve Kaplamaya Genel Bakış. ( A ) E17 hamile bir fare, CO 2 ile ötenazi yapılır. ( B ) Fare, decapitatEd ve uterus çıkarılır. ( C ) Embriyolar serbest bırakılır ve başları kesilir. ( D ) Beyin her bir embriyo çıkarıldı ve frontal loblar çıkarıldı. ( E ) Hücreler ayrıştı. ( F ) Ayrışan hücreler ortamda süspanse edilir. ( G ) Askıdaki hücreler, 60 kanallı çok elektrotlu diziler (MEA'lar) üzerine kaplanır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 12 : Mikroelektrod Dizilerinde Nöronal Kültürler Kaplama. Embriyonik fare nöronları, her bir elektrottan ağ boyunca nöronal aktivitenin aynı anda kaydedilmesine izin veren 60 kanallı MEA'lara kaplanmıştır. (Şekil değiştirildiReferans 15'den ). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 13 : Her Kanaldaki Dalga Formlarını Sıralamak için Kullanılan Sıralama Programı. Sıralama programı ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir veri dosyası yükler ve başlangıçta her kanal için elde edilen tüm birimleri görüntüler. Sinyalleri belirli birime atamak için çeşitli yöntemlerden biri seçilmiştir. Bu örnekte, k-aracı kümeleme algoritması seçildi ve sarı birim (alt pencerede "birim a" etiketli) tanımlandı. Başka bir program (bkz. Malzeme Tablosu ), .nex dosyasını özel oluşturulan GUI için girdi dosyası olan bir .mat dosyasına aktarmak için kullanılır (bkz.
Şekil 14 : Bir Eğitim Süresinden Sonra Uyarılmaya Karşı Değişiklik Yapılmış Ağ Aktivitesi. Sekiz elektrottan rastgele seçilmiş aktivite temsili. Dikey kırmızı çizgi uyarı saatini, siyah tırnak işaretleri aksiyon potansiyellerini belirtir. Eğitim öncesi ( A ), kanallardaki uyaran darbesine ani bir yanıt vardır. Eğitim sonrası ( B ) ağ, uyarıyı 15 anında yanıtlayarak yanı sıra, daha uzun süreli bir aktivite yanıtı sergiler..jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 15 : Eğitimli Şebekelerin Spike Frekanslarında Önemli Değiştirmeler. Kontrol şebekeleri için ağın sızdırma frekansı, her uyarımdan hemen sonra ve o periyota bölünen 50 ms üzerindeki sivri uçların sayısının toplanmasıyla hesaplanır. Gösterilen 12 eğitimli ve 10 kontrol şebekesinin ortalamasıdır (hata çubukları ortalamanın standart hatasını gösterir). Yıldız (*), iki veri kümesi arasındaki istatistiksel farkı ( p-değeri <0.05) göstermektedir. Şekil referans 15'den değiştirildi. Görmek için lütfen tıklayınız.Bu şeklin ger versiyonu.
Şekil 16 : Sinaptik aracılı Yanıtlar, Eğitimli Ağlarda Önemli Değiştirilir. ( A ) 10 ms'lik bidonlarda ölçülen ve kontrol ağlarına normalize edilen başak güvenilirliği, elektrotların yakınındaki nöronların doğrudan aktivasyonu (0-20 ms) için herhangi bir değişiklik göstermez. Bu nedenle, kontroller ve bu kutular için eğitimli şebekeler arasında istatistiksel olarak bir fark bulunmamaktadır. Öte yandan, daha uzun gecikmeli yanıtlar (30-50 ms), sinaptik olarak aracılık edilir, bu yöntemin yukarıdaki Şekil 15'ten daha güvenilirliğin daha ayrıntılı bir incelemesini sağladığını gösterir. ( B ) Popülasyon hızlı frekansı güvenilirlik davranışını tekrarlar ve doğrudan etkinleştirme (0-20 ms) için hiçbir değişiklik göstermezken, statIstikrarlı olarak uzun vadeli yanıtlar için (30-50 ms) önemli farklılık bulunmuştur. Bu davranış önceki şekil 15'deki ortalama sonuçlarla tutarlıdır. Hata çubukları, 10 kontrol şebekesi ve 12 eğitimli şebeke için hesaplanan, ortalama değerin standart hatasıdır. (*) P-değeri <0.05; (**) p-değeri <0.001. Şekil referans 15'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Adet | madde |
| 1 | Otoklavlanmış cam reaktif şişesi (en az 100 mL boyutunda) |
| 20 | 15 mL steril santrifüj tüpleri |
| 1 | 10 mL steril serolojik pipet |
| 4 | 25 mL sterilSerolojik pipet |
| 2 | 50 mL steril serolojik pipet |
| 1 | Santrifüj boru rafı |
| 150 mL | Steril DI su |
| 5 mg | Poli-D-lisin şişesi |
Tablo 1: PDL Hazırlama - Malzemelerin ve Reaktiflerin Listesi.
| Adet | madde |
| 1 | 50 mL steril santrifüj tüpleri |
| 10 | 15 mL steril santrifüj tüpleri |
| 2 | 1 mL steril serolojik pipet |
| 2 | 50 mL steril serolojik pipet |
| 1 | Santrifüj boru rafı |
| 1 mL | FosfatTampon tuzlu su (PBS) |
| 1 mg | laminin |
Tablo 2: Laminin Hazırlama - Malzemelerin ve Reaktiflerin Listesi.
| Adet | madde |
| 1 | Otoklavlanmış cam reaktif şişesi (en az 100 mL boyutunda) |
| 20 | 15 mL steril santrifüj tüpleri |
| 1 | 10 mL steril serolojik pipet |
| 4 | 25 mL steril serolojik pipet |
| 2 | 50 mL steril serolojik pipet |
| 1 | Santrifüj boru rafı |
| 150 mL | Steril DI su |
| 5 mg | Poli-D-lisin şişesi |
Tablo 3: Depolama Ortamı Hazırlığı - Malzemelerin ve Reaktiflerin Listesi www.europa.eu
| Adet | madde |
| 44 mL | L-glutamin'in dengelenmiş bir şekli ile DMEM (materyal tablosuna bakın) |
| 1 mL | Sinir hücresi kültürü için serum içermeyen eklenti (materyal tablosuna bakınız) |
| 2.5 mL | At serumu |
| 100 uL | Askorbik asit [4 mg / mL] |
| 2.5 mL | Fetal sığır serumu (FBS) |
| 0.5 mL | Kalem bükme (isteğe bağlı) |
| 1 | 50 mL steril santrifüj tüpleri |
| 2 | 25 mL steril serolojik pipet |
| 2 | 10 mL steril serolojik pipet </ Td> |
| 2 | 1 mL steril serolojik pipet |
| 1 | 250 mL filtre |
Tablo 4: DMEM 5/5 Orta Hazırlık - Malzemelerin ve Reaktiflerin Listesi.
| Adet | madde |
| 49 mL | L-glutamin'in dengelenmiş bir şekli ile DMEM (materyal tablosuna bakın) |
| 1 mL | Sinir hücresi kültürü için serum içermeyen eklenti (materyal tablosuna bakınız) |
| 100 uL | Askorbik asit [4 mg / mL] |
| 0.5 mL | Kalem bükme (isteğe bağlı) |
| 1 | 50 mL steril santrifüj tüpleri |
| 2 | 25 mL steril serolojik pipet |
| 2 | 1 mL steril serolojik pipet |
| 1 | 250 mL filtre |
Tablo 5: DMEM + Orta Hazırlık - Malzeme ve Reaktiflerin Listesi.
| Adet | madde |
| 1 | Papain 140 U / şişe |
| 1 | Dnase 1,260 U / flakon |
| 7 mL | DMEM + (soğutulmuş) |
| 5 mL | DMEM 5/5 (ılıtılmış) |
| 10 μL | Trypan mavisi |
| 2 | Biçim bıçakları |
| 1 | 35 mm steril Petri kabı |
| 4 | 15 mL steril santrifüj tüpleri |
| 2 | 5 mL steril kriyojenik tüpler |
| 2 | 2 mL steril kriyojenik tüpler |
| 1 | 50 mL steril santrifüj tüpleri |
| 1 | Mikrosantrifüj tüpü |
| 2 | Büyük çaplı transfer pipeti |
| 3 | Küçük çaplı transfer pipeti |
| 5 | 2 mL steril serolojik pipet |
| 5 | 1 mL steril serolojik pipet |
| 2 | 10 μL steril mikropipet uçları |
| 1 | 1000 μL steril mikropipet ipuçları |
| 1 | Hemositometre çipi |
Tablo 6: Hücre Ayrışımı - Malzemelerin ve Reaktiflerin Listesi.
Discussion
Bu protokolde özetlenen adımlar, yeni başlayanlar için kendi nöronal kültürlerini ÇÇ'lar üzerine yerleştirip ağ etkinliklerini kaydetmek için yeterli ayrıntı sağlar. Bu protokol, kültürlerin düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamaya, elektrot dizileri üzerinde bir halı hücre tabakası oluşturmaya ve aylardır sağlıklı ve kirletici olmamasına yardımcı olacaktır.
Protokolün tüm bölümlerine uymak en iyisi olsa da, süreç boyunca başarılı sonuç için kritik öneme sahip adımlar vardır. Tüm süreç boyunca aseptik tekniğin kullanılması, kültürlerin kontamine olmasını önlemek için zorunludur. Yeni ÇÇA'lar, protokolde tarif edildiği gibi hidrofil hale getirilmelidir veya yoksul hücre yapışması ortaya çıkar. Ayrıştırma sırasında sert pipetleme ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek, hasar gören hücrelerin sayısını azaltacak ve daha yüksek ve daha sağlıklı bir verim sağlayacaktır. İlk önce DMEM 5/5'ten DMEM +'ye geçmeBeslenme de önemlidir. DMEM 5/5 at serumu içerir; bu, eğer glial hücrelerin devamlı kullanılması halinde kültüre egemenlik kazandıracak ve kültürler zayıf nöronal aktiviteye neden olacaktır, ancak kültürler sağlıklı görünecektir 17 . Kültürleri planlandığı gibi besleme ve bunları uygun kuluçka koşullarında tutmak da çok önemlidir.
ÇÇA'larda hücre kültürlerinin plaklanması, optimal sonuçların altında kalmasına neden olabilecek birçok değişkeni içerir. Hedef, hücrelerin mükemmel bir "halı" olmasına rağmen, yukarıda bahsedilen kritik adımları atlama başarısızlığı yetersiz hücre olgunlaşması veya bulaşma ile sonuçlanır. Fakir hücre adezyonu, fakir hücre olgunlaşmasından farklıdır, aynı zamanda bir endişe kaynağıdır. Bunun nedeni, kaplamadan önce zayıf MEA hazırlığı veya eski ortamın kullanılması da dahil olmak üzere birçok faktörden kaynaklanabilir. Eğer nöral hücre kültürü için stabilize edilmiş L-glutamin ve serum içermeyen bir form içeren eski ortam varsa (bkz. Malzeme Tablosu) Kullanılır, hücreler başlangıçta yapışır, ancak yaklaşık iki hafta sonra kaybolurlar. Bakteri kontaminasyonu kalıcı bir sorundaysa, ampisilin veya kalem strep gibi bir antibiyotik ortama ilave edilebilir. Mantar kontaminasyonunu tedavi etmek için mevcut fungisitler de mevcuttur. Bunlar, kültürlerin sonucunu etkileyebilecek daha yaygın değişkenlerden bazılarıdır. Yalnızca zaman ve deneyim sonrasında karşılaşılacak diğer pek çok şey vardır.
Cam mikroelektrodlarının kullanımıyla kıyaslandığında, bu teknik ağ dinamikleri ve farmakolojik cevapların incelenmesi için mükemmeldir. Birçok farklı uzaysal ve zamansal uyarılma modelinin kullanılmasını sağlar ve aynı anda birden çok bölgedeki nöronal yanıtların kaydedilmesini sağlar. Önceki gruplar burada açıklananlara benzer protokoller kullanarak ilginç sonuçlar verdi 18 . Kültürler hafta veya ay sürer ve aynı kültürler tekrar kullanılabilir olduğundan, bu teknik aynı zamandaAynı ağ üzerinde zamanla çoklu denemeler için geçerlidir.
Bununla birlikte, bu tekniğin sınırları vardır. ÇÇA'lar invaziv değildir. Bu nedenle, yalnızca pipet ile yama tutma veya hücre içi kayıt yerine, hücre dışı aktiviteyi kaydedebilirler. Dahası, bir dizideki her elektrod birkaç hücre ile kaplandığından, tek bir nöronun etkinliğini çözmek mümkün değildir. Tersine, bunlar in vitro kültürler olduğundan, beyindeki ağların yapısal özelliklerini tam olarak üretemezler. Ayrıca, aktivite, hücrelerin pH dengesini korumak için CO2 atmosferi sağlayan bazı mekanizmalar olmaksızın, aynı anda 30 dakikadan az sürede kaydedilebilir.
Bu tekniğe hakim olunca, elektrik stimülasyonlu veya elektriksel uyarı olmadan farmakolojik manipülasyonlar araştırılabilir. Nöronal ağlarda öğrenmeyi ve hafıza oluşumunu araştıran yeni protokoller de birlikte tasarlanabilir ve test edilebilirHipokampal veya omurilik ağları için rotokolatlar. Şebekelerin teşvik edilmesi ve eğitimi için protokoller daha önce yayınlanmış ve bunlardan bazıları, Eytan ve diğerleri tarafından önerilen "seçici adaptasyon" gibi in vivo protokollerle daha da geliştirilmiştir . 19 . Birkaç protokol test edildi. Bununla birlikte, sadece burada 2005 yılında Ruaro tarafından önerilen tetanoz prosedürüne yapılan bir değişiklik 14,20'de sunulmuştur.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı hibe CMMI-1300007 tarafından finanse edildi. Joseph J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack, bu protokollerin tasarımında yardımcı olan önceki laboratuar üyelerini ve beş yıldan uzun süre boyunca kültürlerin bakımını George Mason Üniversitesi'nde kabul etmek istiyoruz. , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera ve Robert Graham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4 mg/mL aliquots |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
| Beakers - glass - 100 mL | VWR | 13912-160 | |
| Beakers - glass - 500 mL | VWR | 10754-956 | |
| Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
| Cryogenic vial - sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Cryogenic vial - sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
| DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
| DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
| Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
| Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
| GlutaMAX -- I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
| Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
| Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
| Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
| MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
| MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
| MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
| MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
| MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
| MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
| Media storage bottle - glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
| Micropipette tips - 10 μL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
| Micropipette tips - 1,000 μL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
| Micropipette tips - 200 μL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
| Micropipetter - 10 μL | Thermo Fisher | 4641170N | |
| Micropipetter - 1,000 μL | Thermo Fisher | 4641210N | |
| Micropipetter - 200 μL | Thermo Fisher | 4641230N | |
| Papain - 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
| Petri dishes -100 mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes -100 mm glass | VWR | 10754-788 | |
| Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| Phosphate buffer saline (PBS) (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
| Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
| Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
| Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
| Scissors - iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
| Scissors - large | World Precision Instruments | 14214 | |
| Scissors - small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
| Serological pipette - sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
| Serological pipette - sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Serological pipette - sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
| Serological pipette - sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
| Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
| Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
| Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
| Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
| Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
| Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
| Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
| Spatula - small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
| Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
| Transfer pipette - large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
| Transfer pipette - small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
| Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |
References
- Charkhkar, H., Frewin, C., et al. Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing. Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).
- Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development. Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).
- Fröhlich, F., McCormick, D. A. Endogenous electric fields may guide neocortical network activity. Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).
- Ozen, S., Sirota, A., et al. Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats. J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).
- Shahaf, G., Marom, S. Learning in networks of cortical neurons. J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Marom, S., Eytan, D. Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons. Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors. Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays. Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. Network plasticity in cortical assemblies. Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).
- le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons. PloS one. 5 (1), 8871 (2010).
- Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures. IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).
- Hamilton, F., Graham, R., et al. Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation. PloS one. 10 (11), 0142399 (2015).
- Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf (2016).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells: Business Source. , MIT Press. Cambridge. (1998).
- Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array. J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).
- Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons. J. Neurosci. 23 (28), (2003).
- Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. Statistical properties of information processing in neuronal networks. Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).
