Summary
Musneuronceller dyrket på multi-elektrode arrays viser en stigning i respons efter elektrisk stimulering. Denne protokol viser hvordan man dyrker neuroner, registrerer aktivitet, og hvordan man etablerer en protokol til at uddanne netværket til at reagere på stimuleringsmønstre.
Abstract
Mikroelektrodearrayer (MEA'er) kan bruges til at undersøge narkotikatoksicitet, designparadigmer til næste generation af personlig medicin og studere netværksdynamik i neuronkulturer. I modsætning til mere traditionelle metoder, såsom patch-clamping, som kun kan registrere aktivitet fra en enkelt celle, kan MEA registrere samtidigt fra flere steder i et netværk uden at kræve den vanskelige opgave at placere hver elektrode individuelt. Desuden kan adskillige kontrol- og stimuleringskonfigurationer let anvendes inden for samme eksperimentelle opsætning, hvilket gør det muligt at udforske en bred vifte af dynamik. En af de centrale dynamikker af interesse i disse in vitro- undersøgelser har været, i hvilket omfang kultiverede netværk viser egenskaber, der indikerer læring. Musneuronale celler dyrket på MEA viser en stigning i respons efter træning induceret af elektrisk stimulering. Denne protokol viser hvordan man dyrker neuronelle celler på MEA'er; Med succes reLedning fra over 95% af de belagte skåle; Etablere en protokol til at uddanne netværket til at reagere på stimuleringsmønstre Og sorter, plot og fortolke resultaterne fra sådanne eksperimenter. Brugen af et proprietært system til stimulering og registrering af neuronkulturer er demonstreret. Softwarepakker bruges også til at sortere neuronale enheder. En brugerdefineret grafisk brugergrænseflade bruges til at visualisere post-stimulus tid histogrammer, inter-burst intervaller og burst varighed, samt at sammenligne den cellulære respons til stimulering før og efter en træningsprotokol. Endelig drøftes repræsentative resultater og fremtidige retninger af denne forskningsindsats.
Introduction
Mikroelektrodearrayer (MEA'er) kan bruges til at undersøge narkotikatoksicitet, designparadigmer til næste generations personlig medicin og studere netdynamik i neuronkulturer 1 . I modsætning til mere traditionelle metoder, som f.eks. Patch-clamping, som kun kan registrere aktivitet fra en enkelt celle eller feltoptagelse med en glaspipette, som kan registrere ekstracellulære reaktioner fra neuronerne, der omgiver elektroden på et enkelt sted, kan MEA samtidigt Optage fra flere steder i en cellekultur uden at kræve den vanskelige opgave at placere hver elektrode individuelt. Dette giver mulighed for at studere de dynamiske interaktioner mellem grupper af celler, der danner et netværk i den kultur. Desuden er virkningerne af elektrisk stimulering på netværksbrændingsmønstre 2 , 3 , 4 , 5 og netværksstyring 6 </ Sup> i neuronkulturer er blevet veldokumenteret, og mange konfigurationer af elektrisk stimulering og kontroller kan let anvendes inden for samme eksperimentelle opsætning, hvilket gør det muligt at udforske en bred vifte af spatio-temporal dynamik.
En af de vigtigste dynamikker af interesse i disse in vitro- undersøgelser har været, i hvilket omfang kultiverede netværk viser egenskaber, der indikerer at lære 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Peixoto Lab undersøgte tidligere virkningerne af højfrekvente træningssignaler som beskrevet i Ruaro et al. 14 , på netværk af musneuroner belagt på mikroelektrode arrays 15 . I disse eksperimenter viste netværk en stigning i svaret efterfølgendeG træning induceret ved elektrisk stimulering. Det øgede respons blev betragtet som en form for læring via stimulusgenkendelse, hvorved netværkene reagerede på en konsistent måde til en ændring i stimulus efter anvendelse af en specifik stimuleringsprotokol ( dvs.
Denne protokol demonstrerer, hvordan man dyrker neuronelle celler på MEA, registrerer med succes fra over 95% af de belagte opskrifter, etablerer en protokol til at uddanne netværket til at reagere på stimuleringsmønstre, sortere enhedsaktivitet, plothistogrammer og fortolke resultaterne fra Sådanne eksperimenter. Brugen af et proprietært system (se Materialetabellen ) til stimulering og registrering af neuronkulturer er demonstreret, såvel som anvendelsen af softwarepakker (se Materialetabellen ) for at sortere neuronale enheder. En brugerdefineret grafisk brugergrænseflade (se Materialebordet ) bruges til at visualisere post-sTimulus tidshistogrammer, inter-burst intervaller og burst varighed, samt at sammenligne den cellulære respons til stimulering før og efter en træningsprotokol.
Protocol
Alle dyreprocedurer følger NIH's retningslinjer og / eller folkehelsepolitikken om human pleje og brug af laboratoriedyr og er under en institutionel godkendt dyrepleje og brugs (IACUC) protokol ved George Mason University.
1. Materialepræparation
- Autoklaver følgende materialer: 5.75 tommer lange glaspipetter arrangeret lodret i (2) 500 ml bægerglas, ca. 24 stykker filterpapir (150 mm diameter, hver skåret i 8 kiler, porestørrelsen er ligegyldig), 1000 μL filtreret pipette Tips, 200 μL filtrerede pipettespidser, 10 μL filtrerede pipettespidser og deioniseret (DI) vand til vaskerne (mindst 200 ml).
- Klargør reagenser og medier.
- Forbered alle reagenser og medier i biohood ved hjælp af aseptiske teknikker.
- Klargør poly-D-lysin (PDL) som i tabel 1 .
- Bland PDL med sterilt DI vand til en endelig cKoncentration på 50 μg / ml som følger. Brug en steril serologisk pipette til at overføre 96 ml sterilt DI-vand til en autoklaveret glasreagensflaske.
- Brug en steril serologisk pipette til at tilføje 4 ml sterilt DI-vand til producentens hætteglas indeholdende PDL. Opløs PDL ved pipettering. Brug den samme pipette til at overføre PDL-opløsningen til glasreagensflasken indeholdende 96 ml sterilt DI-vand.
- Læg flasken tæt på, inden du fjerner den fra biohoodet og virvler løsningen. I biohoodet opdeles opløsningen i 5 ml alikvoter; Frys en eventuel ubrugt opløsning ved -20 ° C. Opdrættet PDL kan genfryses en gang. Kassere optøet opløsning, hvis den fryses igen før.
- Forbered lamininopløsning som i tabel 2 .
- Bland laminin med PBS til en slutkoncentration på 20 μg / ml som følger. Brug en steril serologisk pipette til at overføre 49 ml PBS til et 50 ml centrifugerør.
- Brug en steril serologicaL pipette for at tilføje 1 ml PBS til producentens hætteglas indeholdende den passende vægt af laminin. Opløs laminatet ved pipettering. Brug den samme pipette til at overføre lamininopløsningen til 50 ml centrifugerøret indeholdende 49 ml PBS.
- Løsn røret tæt, før det fjernes fra biohoodet og virvler løsningen. I biohoodet opdeles opløsningen i 5 ml alikvoter; Frys en eventuel ubrugt opløsning ved -20 ° C. Optøet laminin kan ikke genfryses; Kassere enhver ubrugt optøet opløsning.
- Forbered opbevaringsmediet, som i tabel 3 .
BEMÆRK: Opbevaringsmedium bruges til at opbevare væv i op til en måned ved omgivende CO 2 -niveauer. Det kan købes (se materialebordet) eller det kan fremstilles ved hjælp af den generelle opskrift af: omgivende CO 2 -cellelagringsmedium + 2% serumfrit supplement til neuralcellekultur + 0,5 mM cellekulturmedium, der indeholder en stabiliseret Form af L-glutamin (se materialebordet).- Til fremstilling af 10 ml opbevaringsmedium overføres 10 ml opbevaringsmedium til embryonvæv uden CaCl2 til et 15 ml centrifugerør. Tilsæt 210 μL serumfrit supplement til neuralcellekultur og 55 μl af en stabiliseret form af L-glutamin. Bland forsigtigt ved inversion.
- Da lagermediet er lysfølsomt, skal du beskytte det ved at dække 15 ml centrifugerørene med aluminiumsfolie. Aliquot 2 ml opbevaringsmedium pr. Rør i i alt 5 alikvoter. Opbevares i køleskab i op til 2 uger eller indtil klar til brug, men frys ikke.
- Forbered DMEM 5/5 medium, som i tabel 4 .
- Optø alikvoter af serumfrit supplement til neurale cellekultur, hesteserum (HS), føtalt bovint serum (FBS) og ascorbinsyre. Optø en aliquot af pen-strep om nødvendigt for at kontrollere bakteriel forurening. Pipetter hver ingrediens i et 50 ml centrifugerør. Sørg for, at pipettespidserne ikke berører overflader eller objekterts.
- Indenfor biohoodet, tilslut filteret til vakuumrøret med vakuumet stadig væk. Hæld blandingen i filter toppen og luk den. Tænd vakuumet i biohoodet og lad mediet filtrere til bunden af beholderen. Træk filteret ud af vakuumet, før du slukker for vakuumet.
- Stram låget på den sterile mediumbeholder, mærket den, og opbevar ubrugt medium ved 4 ° C i op til en måned. Åbn beholderen inde i biohood for at holde mediet sterilt.
- Forbered DMEM + -medium, som i tabel 5 .
- Optø alikvoter af serumfrit supplement til neuralcellekultur og askorbinsyre (og penstrimmel, hvis det er nødvendigt). Pipetter hver ingrediens i et 50 ml centrifugerør. Gentag trin 1.2.5.2-1.2.5.3 for den resterende proces.
2. Array / Dish Preparation
BEMÆRK: De MEA'er, der anvendes i proceduren, er 60-kanals arrayer oRganized i en 8 x 8 square. Interelektroderafstanden er 200 μm, og hver elektrode er 10 μm i diameter. Det ledende materiale til sporene er titanium, og elektroderne selv er lavet af TiN. Glasringen omkring elektroderne er 6 mm høj, med en ydre diameter på 24 mm. En kappe fremstillet af polyoxymethylen (POM) bruges til at dække MEA, og en gasgennemtrængelig / væske-impermeabel fluoreret ethylenpropylen (FEP) film anvendes til at forhindre forurening under optagelses- og stimuleringssessioner.
- Dagen før plating.
- Gør ubrugte MEA hydrofile ved at udsætte dem for plasma; Dette er normalt ikke nødvendigt efter første brug. Sørg for, at glasdæksler, der anvendes til kontrolkulturer, også modtager plasmabehandling.
BEMÆRK: Plastisk petriskål (35 mm) kan også bruges som kontrolskål og behøver ikke nogen forbehandling.- Administrer plasmabehandlingen ved hjælp af et plasma etcher i 40-60 s ved halv effekt (50 W), wiTh kammertrykket sat til 100-150 mT.
- Fyld straks MEA med DI vand. Dyk dækslisterne i en petriskål fyldt med DI vand. Lad DI vandet komme i kontakt med behandlede overflader i ca. 15 minutter.
- Inden i biohoodet suger du ud DI-vandet. Fyld MEA'erne til fælgen med 70% ethanol. Fjern DI-vandet fra petriskålen, der indeholder dækslip og fyld Petriskålen med ethanol, indtil dækslipene er helt nedsænket. Lad dette sidde i 10-15 min.
- Mærk alle petriskåle og kontrolskåle med MEA ID #, dato for operation, celletype og initialer. Derefter placeres hvert MEA i sin mærket Petri skål.
- Placer MEA'erne i individuelle petriskåle og fjern ethanolen ved hjælp af vakuumsugning. Fyld MEA'erne med sterilt DI-vand for at fjerne eventuelt resterende ethanol. Brug vakuumsugning til at fjerne DI-vandet. Lad MEA'erne lufttørre inde i biohoodiet.
- Tilsæt 40-70 μl 50 μg / ml poly-D-lysinE (PDL, høj molekylvægt, mindst 50 kDa) til midten af hvert MEA og 0,2 ml til kontroller ved anvendelse af sterile pipettespidser.
BEMÆRK: Sørg for ikke at røre midt på MEA med pipetten, tip, da dette kan beskadige elektroderne. Den nøjagtige mængde af PDL dispenseret afhænger af overfladens hydrofilitet. - Placer et lille stykke laboratoriepapir i hver skål og våd det med sterilt vand for at undgå PDL-fordampning natten over. Dæk alle retter inden du fjerner dem fra biohood. Læg opvasken i en inkubator ved 37 ° C natten over.
- Gør ubrugte MEA hydrofile ved at udsætte dem for plasma; Dette er normalt ikke nødvendigt efter første brug. Sørg for, at glasdæksler, der anvendes til kontrolkulturer, også modtager plasmabehandling.
- Plating dag.
- På plating dagen optøes 1 alikvot af laminin (20 μg / ml); Hvert MEA kræver 40-50 μl laminin, og hver kontrolskål kræver 0,2 ml laminin. Beregn mængden af laminin, der kræves, baseret på antallet af MEA'er og kontroller, der skal anvendes.
- Overfør alle retter fra inkubatoren til biohood.
- Fyld alle MEA'er med sterilDI vand med en steril serologisk pipette og lad dem sidde i 10-15 minutter. Aspirer DI-vandet ved hjælp af sterile Pasteur pipetter og gentag processen to gange.
- Tilsæt 40-50 μL optøet laminin til midten af hvert MEA og 0,2 ml laminin til kontrolpladerne ved hjælp af sterile pipettespidser. Dæk alle MEA'erne og kontrolskålene i biohoodet og overfør dem til en inkubator ved 37 ° C i 1 time.
- Fjern forsigtigt laminin fra midten af MEA'erne ved hjælp af suge med sterile Pasteur pipetter og lad overfladen lufttørre før plettering.
- Lad skålene i biohoodet, eller placere dem i en inkubator, indtil de er klare til at plette cellerne.
BEMÆRK: Skålene kan forblive i inkubatoren indtil den følgende dag. Men hvis der er brug for mere tid, er det tilrådeligt at vaske opvasken og starte over fra poly-D-lysin-trinnet (trin 2.1.6).
3. Embryofjernelse og hjerneUdvinding
- Hæld L-15 (Leibovitz) medium i 4 af 100 mm petriskålene. Dæk dem og læg dem i en -20 ° C fryser, indtil mediet har en slushy konsistens, men ikke frosset fast (~ 40-60 min).
- Gør dette ca. 40 minutter til 1 time før dissektion.
BEMÆRK: Dette vil afkøle embryoerne og hjernerne hurtigt, så de har en fast konsistens og ikke opløses ved udvinding. - Forbered dissektionsområdet til embryonfjernelse.
- Placer en bakke med is nær en vask og læg de kirurgiske instrumenter og materialer til embryofjernelse. Disse omfatter 4 petriskåle med koldt L-15 "slush" papirhåndklæder, en sprøjteflaske med 70% ethanol, tøsnus tommelfingre, fine tænger, små kirurgiske saks og store saks ( figur 1 ).
- Forbered dissektionsområdet til hjernekstraktion.
- Placer et glas petriskål faCe ned i en bakke fuld af is.
- Læg de kirurgiske instrumenter og materialer til hjernekstraktion, herunder papirhåndklæder, små kirurgiske saks, en tynd dobbeltsidet spatel, en sprøjteflaske fyldt med 70% ethanol og en plastpose til bortskaffelse af slagtekroppen ( figur 2 ).
- Sæt på et lab coat, en facemask og handsker. Spray alle arbejdsflader, herunder handskerne, med 70% ethanol.
BEMÆRK: Selv om dette ikke er en steril procedure, er det bedst at reducere chancerne for kontaminering så meget som muligt. - Euthanize en E17 timed-pregnant mus efter NIH retningslinjerne 16 og / eller folkehelsepolitikken om human pleje og brug af laboratoriedyr og i henhold til en institutionelt godkendt dyrepleje og brugsprotokol (IACUC) til CO 2- kvælning. Sørg for at frigøre CO 2 -gassen langsomt ind i kammeret i en periode på 3 til 5 minutter for at undgå induktion af panik eller discoMfort i musen.
- Dekapiter musen og læg den på et papirhåndklæde, ventral side opad. Spray dets underliv med 70% ethanol. Ved hjælp af de små kirurgiske saks, lav en V-formet snit gennem huden og subkutant fedt i underunderlivet, og udvid snittet til de distale ender af thoracic hule og udsætte livmoderen.
- Ved hjælp af tang, løft forsigtigt livmoderen mellem embryonerne. Skær bindevæv med dissektionssaks, indtil hele livmoderen er fri. Skyl livmoderen kortvarigt med 70% ethanol for at fjerne eventuelt blod og placere det i en af de 4 petriskåle fyldt med kold L-15.
- Frigør hvert embryo fra livmoderen og indvendig embryonale sække ved hjælp af et par fintipede tang. Sørg for, at navlestrengen er adskilt, og placentasekken er fjernet. Placer de befriede embryoner i den anden skål fuld af kold L-15. Dekapiter embryoerne med pincet og saks. Overfør hovedene til en tredje petriskål og kroppene ved hjælp af tangTil en fjerde, begge fulde af kolde L-15.
4. Fjernelse af frontal cortex
- I et biohood skal du placere en kil af autoklaveret filterpapir på det kølede glas Petri-skål. Placer et enkelt embryohoved på filterpapiret. Grip på kraniet ved at placere et par tang gennem de okulære hulrum med den ikke-dominerende hånd. Fjern hud og underliggende muskelvæv med et par iris saks.
- Placer forkanten af den nedre skive af iris saks i bunden af kraniet. Holde den nederste skive mod den indre overflade af kraniet, væk fra hjernen, skåret gennem oksepitalpladen og derefter langs midterlinjen mellem parietalpladerne. Fortsæt med at skære rostrally mellem de bruskhindeplader.
- Begynd i midten af occipitalpladen, lav et vinkelret snit til venstre og til højre for center cut.
- Fjern hjernen ved forsigtigt at glide en lille spatel mellem den ventrale overfladeAf hjernen og bunden kraniet plader, indtil det er helt under hjernen. Løft spatelen op; Hele hjernen kommer ud i intakt.
- Placer et par dråber L-15 medium på filterpapiret, så hjernen ikke holder fast i papiret og forsigtigt glider hjernen fra spatelen på filterpapiret, ventral side nedad. Skær forsigtigt den olfaktive pære med spidsens spids.
- Ved hjælp af en ren spatel skal du dissekere frontalbenet i et trapezformet mønster. Overfør vævet til et 15 ml centrifugerør indeholdende opbevaringsmedium. Gentag ovenstående med de resterende embryoner. Sørg for at bruge en ny kile filterpapir hver gang ( dvs. en kile filterpapir pr. Hoved).
5. Celldissociation
- I biohoodet samler du de elementer, der er angivet i tabel 6 .
- Brug en steril serologisk pipette til at tilføje 5 ml DMEM + til et hætteglas papain; Opvarmet DMEM + kan bruges til bedre opløsning af papainen. forsigtigtPipette for at blande opløsningen.
- Brug en steril mikropipette til at tilsætte 0,5 ml DMEM + til et hætteglas med DNase. Undgå kraftig pipettering, mens du fremstiller DNase-opløsningen, fordi DNase er følsom over for shear denaturering.
- Overfør 2,5 ml papainopløsning til et sterilt centrifugerør og tilsæt 125 μL af DNasen til det samme rør. Bland opløsningen ved forsigtigt at dreje det dækkede centrifugerør ca. 8 gange.
- Ved hjælp af en steril pipette med brede boringer fjernes vævet fra røret, der indeholder opbevaringsmediet, og placeres i en steril, 35 mm petriskål. Indsamle så lidt medium som muligt. Brug en steril pipette til at fjerne så meget overskydende opbevaringsmedium som muligt uden at fjerne vævet. Vævet bør ikke flyde i medium, men det skal være fugtigt.
- Brug to sterile skalpelsblade til at hakke vævet. Brug en steril serologisk pipette til at tilsætte 2,5 ml DNase / papain-blandingen til hakket væv i Petri-skålen. Forsvigt forsigtigt Petriskålen for at sikre tHat alt væv er ledigt i opløsningen og ikke klæbet til bunden af parabolen. Placer opskålen i en inkubator 37 ° C i 15 minutter.
- I biohoodet skal du bruge en steril, overføringspipette med bred bore for at overføre alle medier og væv til et sterilt, 5 ml kryogen rør. Placer spidsen af den samme brede boreoverføringspipette tæt på bunden af røret. Træk forsigtigt ved langsomt pipettering op og ned 10-15 gange.
- Undgå at danne bobler under pipettering. Gentag processen ved hjælp af en lille boreoverføringspipette, indtil der opnås en homogen blanding. Hvis vævet ikke dissocieres, triturateres med en 1000 μL pipette.
- Tilsæt 2 ml opvarmet DMEM 5/5 til dissocieret celleblanding. Cap centrifugerøret, mens det stadig er i biohoodiet. Bland forsigtigt ved inversion. Centrifuger ved ca. 573 xg i 5 minutter ved stuetemperatur (20-25 ° C).
- I biohoodet skal du bruge en steril serologisk pipette til at fjerne og kassere hele supernatanten uden at brydepellet. Brug en steril pipette til at tilføje 1 ml opvarmet DMEM 5/5 til pellet i røret for at suspendere cellerne igen. Brug en steril pipette med små boringer til at opdele pelleten ved forsigtigt pipettering op og ned, indtil blandingen er homogen.
BEMÆRK: Undgå at danne bobler under pipettering. Hvis meget lille væv blev opsamlet, tilsættes kun 0,5 ml DMEM 5/5. - Inde i biohoodet, brug en steril pipette til at overføre 10 μl af cellesuspensionen til et mikrocentrifugerør. Uden for biohedet tilsættes 10 μL Trypanblåt til 10 μl celle suspensionen i mikrocentrifugerøret.
BEMÆRK: Dette trin kræver ikke sterilitet. - Indlæs 10 μL af Trypan-blåcellesuspensionen i en engangshemocytometerchip for at tælle cellerne.
6. Plating celler
- I biohoodet skal du bruge en steril mikropipette til overførsel af 50 μl cellesuspension til midten af hvert array og hver kontrol petriskål. Brug en piPette tip per skål. Sørg for at lægge cellerne nøjagtigt i midten af arrayet. Gentag laboratoriepapiret, der var i opvasken med sterilt vand, eller læg nyt papirpapir i hver skål. Dæk opvasken.
- Placer de overdækkede petriskåle i en inkubator til 37 ° C og 10% CO 2 i 3-4 timer.
- I biohoodet tilsættes forsigtigt 1 ml opvarmet DMEM 5/5 til hvert MEA.
BEMÆRK: Undgå at vaske cellerne væk fra center-arrayet, når du tilføjer mediet (vigtigt!). Brug meget forsigtigt en steril mikropipette til at tilføje en dråbe ad gangen omkring indersiden. - Anbring en kappe indeholdende en gasgennemtrængelig FEP-membran på hvert MEA. Returner dem til inkubatoren i to dage.
BEMÆRK: Hætten forhindrer kontaminering og fordampning. Følg aseptisk teknik, tørre caps i biohoodet med 100% ethanol, før de sættes på MEA. Kulturen skal være begrænset inden for biobrændet og skal til enhver tid forblive begrænset.
7. MainBesidder kulturerne
- Efter to dage, udfør en komplet medium udskiftning med opvarmet DMEM +.
- Overfør kun nogle få retter fra inkubatoren til biohood ad gangen for at undgå at stresse kulturerne for længe.
- Brug en steril 1 ml mikropipette til at trække alt mediet ud af fadet ved omhyggeligt at placere pipettens spids på indersiden af fadet og undgå at berøre cellerne i midten. Brug kun en pipettespids pr. Skål for at undgå at sprede kontaminering.
- Brug en steril mikropipette til at dispensere 1 ml varm DMEM +, og læg forsigtigt pipettens spids på indersiden af parabolen.
- Udfør 50% mellemstore ændringer med opvarmet DMEM + som beskrevet ovenfor, 2-3 gange om ugen og højst 4 dage mellem fødninger.
- Brug en steril 1 ml mikropipette til at tegne 500 μl medium fra parabolen. Brug en steril mikropipette til at dispensere 500 μL varm DMEM +/ Li>
8. Visuelle inspektioner og optagelse
- Undersøg parabolprøverne hver anden dag under et mikroskop for at kigge efter celledækning over arrayet (ved hjælp af 4X og 10X forstørrelse) og forurening (ved hjælp af 20X forstørrelse), enten bakterielle eller svampe.
BEMÆRK: Figur 3a viser et eksempel på optimal celledækning, hvorimod figur 3b viser en kultur med dårlig celletæthed. - To uger efter plating test en prøve af MEA skålene til spontan aktivitet. Optag fra MEA, som beskrevet nedenfor, i 3-5 minutter. Spikes vil blive detekteret, hvis aktiviteten er til stede ( figur 4 ).
BEMÆRK: Det er op til eksperimentet at bestemme, hvornår man skal starte testen baseret på den type forsøg og hypotese, der undersøges.- For at optage aktivitet i et MEA skal du bruge følgende udstyr: strømforsyning, forstærker, headstage / forforstærker, Temperaturregulator og stimuleringsgenerator (se materialebordet og figur 5 ).
- Inden du tager kulturer ud af inkubatoren, skal du tilslutte temperaturregulatoren og tænde for systemet ved at tænde for strømforsyningen (ifølge producentens anvisninger), så den forvarmeres opvarmede bundplade når op til 35 ° C.
- Placer den kappede kultur i forforstærkeren, så den sorte linje i MEA passer godt ind i referenceområdet. Sørg for, at forforstærkerstifterne stiger op, at formen af forforstærkeren er sikret, og at kulturdækslet stadig er på.
- Når kulturen er anbragt på pladen, skal du fjerne markeringen for "Change MEA" på dataovervågningssoftware (se materialebordet til softwarenavne og brugervejledninger). Desuden afkrydses afkrydsningsfeltet mærket "Blanking", inden du tager optagelser.
- Vælg "Download" i "MEA_Select" efter tHan er placeret i systemet. Kontrollér, at programmet viser "Download OK", inden du fortsætter.
- Tryk på "Start" i softwaremiljøet for at starte visualisering af signalerne. I hovedvinduet skal du vælge: "Spikes" → "Detection" → "Automatic", skift værdien "Std Dev" til "5" og klik på "refresh" for at nulstille tærsklen.
BEMÆRK: Vinduet "Spikes" viser pigge, der passerede tærsklen. - I hovedvinduet skal du vælge "Optager" → "Optager" → "Gennemse". Ændre stien og filnavnet for at identificere datoen, klokkeslættet, opskriften og eksperimentet. Indstil tidsgrænsen ( f.eks. Til 5 min). Klik på "Stop", "Optag" og "Afspil". Bemærk, at optagelsen stopper automatisk.
- Åbn stimuleringssoftware. Vælg "Optager" → "Optager" → "Gennemse" for at oprette en fil og indstille timenE grænse. Klik på "Stop", "Record" og "Play" for at optage igen. Klik på "Download and Start" (på stimuleringssoftware) for at stimuleringen skal leveres til parabolantenne.
- Vælg "Change MEA" knappen i software kontrol for at skifte skål.
BEMÆRK: Hold ikke kulturen ud af inkubatoren i mere end 30 minutter ad gangen uden et system til at opretholde en CO 2 atmosfære rundt om kulturen. Hvis der kræves længere optagelsessessioner, skal du bruge en kommercielt tilgængelig adapter til at levere CO 2 .
9. Uddannelsesnetværk
BEMÆRK: Figur 6 viser et overblik over trin 9.1-9.3, som beskrevet nedenfor.
- Optag en 5-min baseline for spontan aktivitet fra cellekulturen (som beskrevet i trin 8). Når først baseline er blevet etableret, administrere en 5-min før-træning probing stimulation bestående af en 0,5 Hz bifasiskPuls med en 200 μs pulsvarighed og en 900 mV pulsamplitude ( figur 7a ) gennem de valgte stimuleringselektroder som vist i figur 8 (se softwarehåndbogen i materialetabellen for detaljer om valg af stimuleringselektroder).
- Ved fuldførelse af føruddannelsestimuleringen skal du administrere en "trænings" -protokol til netværkene ved hjælp af de samme elektroder som i probing-stimuleringen. Lever højfrekvenstogene en gang hver anden s som beskrevet i Hamilton et al. 15 ( figur 7b og figur 7c ).
BEMÆRK: Træningssignalet består af 40 pulstog. Hvert pulstog består af 100 bifasiske impulser, med 4 ms mellem impulser, en 200 μs pulsvarighed og en 900 mV pulsamplitude. - Efter afsluttet træningsperiode administrere en 5 min post-træning stimulering til cellerne,Identisk med præ-træning stimulering. Når først efteruddannelsesstimuleringen er færdig, skal du registrere 5 minutter post-stimulation spontan aktivitet fra netværket (som beskrevet i trin 8).
- Brug en separat kontrolgruppe af MEA'er til at tage højde for mulige ændringer i netværkssvar på grund af naturlige udsving eller systemfri stationaritet. Administrer den samme forsøgsprotokol som beskrevet ovenfor til de kontrolgrupper, med undtagelse af, at kontrolgrupperne modtager en sham-træningsperiode, hvor intet egentligt træningssignal administreres.
10. Dataanalyse
Bemærk: Datafilerne gemmes og sorteres senere i neuronale enheder ved hjælp af en proprietær sorteringssoftware (se materialebordet). En brugerdefineret grafisk brugergrænseflade (GUI) bruges til at indlæse enhederne og analysere aktivitetsmønstre i kulturerne, inter-burst intervaller, burst-varighed og post-stimulus tid histogram (PSTH) (se materialebordet). PSTH erDen vigtigste graf, der skal analyseres, da den viser netværkets aktivitet i binstørrelser (med variabel længde) og således tilvejebringer en visuel repræsentation af netværksresponsen til den viste stimulering.
- Konverter .mcd-datafiler til .plx-format ved hjælp af en proprietær sorteringssoftware (se materialebordet til softwarenavne og brugervejledninger). Eksportér .plx-filen til en ny .plx-fil i det samme program. Sorter kanalerne i neuronale enheder ( figur 9 ). Når sorteringen er gennemført, skal du eksportere dataene som en .nex-fil.
- Åbn .nex-filen i den relevante software (se Materialebord ) og gem den som en .mat-fil, der skal analyseres med den brugerdefinerede GUI, som er frit tilgængelig (se Materialebord ).
BEMÆRK: Den grafiske brugergrænseflade (se materialebordet) tegner PSTH'er ifølge brugerindgang ( dvs. befolkning PSTH, forudindtaget gennemsnitlig PSTH eller individuel kanal PSTH), der giver mulighed for et overblik over stimuleringsforsøg og øjeblikkelig sammenligning mellem post- og pre-stimulus-filerne. Det tegner også de oprindelige versus de endelige PSTH'er, der sammenligner netværksresponset med de første 6 og de sidste 6 stimuli. GUI'en udfører flere andre funktioner, såsom spidshastighed, interspidsinterval, spidser pr. Burst, inter-burst interval og burst-varighed for både stimuleringsfiler og filer med spontan aktivitet. - Først skal du vælge en .mat-fil med variabler, der indeholder spike-tog og en variabel, der indeholder stimuleringsartefacten; Scriptet vil analysere dataene, og hovedguiden vil komme op med en gennemsnitlig PSTH-graf til højre ( figur 10 ).
- Klik på de aktive elektrode knapper for at se den enkelte PSTH (i blå) i forhold til den gennemsnitlige PSTH (i rød).
BEMÆRK: De aktive elektroder bliver farvet for at vise et varmekort, hvor højere værdier (mere rød) repræsenterer størrePeak PSTH værdier, hvilket indikerer et stærkere respons på stimulering. - Vælg en analyseindstilling ved hjælp af pop op-menuen. Vælg knappen "Biased Average" for at vælge en delmængde af elektroder og plot gennemsnittet af den pågældende delmængde; Dette er nyttigt for at sammenligne undernetværksadfærd inden for en kultur.
BEMÆRK: Der er flere forskellige analysemuligheder, der er valgt via pop op-menuen, og de forklares alle i "hjælp" -knappen i softwaren. - Vælg "Gem graf" -knappen for at gemme den viste graf som en jpeg-fil med høj opløsning. Vælg "Data Table" knappen for at eksportere dataene til et regneark.
- Klik på de aktive elektrode knapper for at se den enkelte PSTH (i blå) i forhold til den gennemsnitlige PSTH (i rød).
Representative Results
Ved anvendelse af den her viste fremgangsmåde ( Figur 11 ) blev 60-kanals MEA'er plettet med E17 musneuronale celler inkuberet, indtil kulturerne dækkede arraysne i et sundt tæppe af celler ( figur 12 og figur 3a ) . Efter 3 ugers inkubation ved 10% CO 2 og 37 ° C blev kulturerne kontrolleret for spontan aktivitet ved anvendelse af et kommercielt registreringssystem (se Materialetabel ). Temperaturen blev holdt ved 37 ° C under registreringsproceduren under anvendelse af en temperaturregulator, da temperaturen påvirker neuronaktivitet og brændhastigheder.
Testing for aktivitet
Spontant aktive netværk udviser normalt varierende signalmønstre. En gennemsnitlig aktiv kultur kan registrere aktivitet i enPproximately 40% af elektroderne. Af disse aktive elektrodsteder registrerer næsten halvdelen spontane signaler med afbrændingshastigheder fra 5 - 10 Hz. Et repræsentativt rasterplot af spontan aktivitet er vist i figur 4a . Tippemærkerne angiver tidsstemplerne for aktionspotentialer optaget fra 9 aktive elektroder i et 20 s vindue ved en opkøbshastighed på 25 kHz og et båndpasfilterområde på mellem 300 Hz og 3 kHz. Figur 4b viser baseline støj og det filtrerede rå ekstracellulære signal under 8 udbrudstykker inden sorteringsproceduren. For at adskille aktionspotentialerne fra støj, sættes tærsklerne for hver kanal til 5 gange standardafvigelsen for basislinjen og beregnes over et vindue på 500 ms. 15 .
Før analysen blev de registrerede pigge for hver elektrode sorteret offline for at skelne mellem physioLogisk aktivitet og stimuleringsartefakter ved anvendelse af en k-middelalgoritme og principkomponentanalyse. Signaler, der var blevet identificeret som fysiologiske reaktioner, blev grupperet sammen for at skabe et befolkningsrespons ved hver elektrode ( figur 13 og figur 9 ) 15 .
Uddannelse neurale netværk med elektrisk stimulering
Netværk blev trænet ved hjælp af elektrisk stimulering påført kulturen direkte via MEA-elektroderne ved hjælp af en stimulusgenerator (se materialebordet). I dette sæt repræsentative resultater blev en "L" -formet konfiguration bestående af 13 elektroder anvendt ( figur 8 ), selvom mange andre konfigurationer kan påføres. Undersøgelses- og træningsstimuleringen var baseret på parametre defineret i Ruaro et al. 14 .
En baseline blev oprindeligt indstillet ved at registrere 5 min spontan aktivitet før stimulering. Når basislinjen blev etableret, blev en 5 min før-træningsundersøgelsesstimulering bestående af en 0,5 Hz bifasisk puls med en 200 μs pulsvarighed og en 900 mV pulsamplitude ( Figur 7a ) administreret gennem de udvalgte stimuleringssteder ( dvs. "L" -formede). En træningsprotokol blev derefter administreret til netværket hver anden s ved hjælp af det samme sæt elektroder. Træningssignalet bestod af 40 pulstog, der hver indeholdt 100 bifasiske impulser med en 4 ms interpulsperiode, en 200 μs pulsvarighed og en 900 mV pulsamplitude ( Figur 7b og Figur 7c ). Denne træningsperiode blev derefter efterfulgt af en 5-min efteruddannelsesfase, svarende til føruddannelsestimuleringen. Protokollen var daAfsluttet med en 5-minutters registrering af spontan aktivitet efter stimulation.
Den samme eksperimentelle protokol blev anvendt til en kontrolgruppe af kulturer for at tage højde for naturlige udsving i netværksrespons. Den eneste forskel i kontrolprotokollen var imidlertid anvendelsen af en sham-træningsperiode, hvor intet egentligt træningssignal blev administreret.
Statistiske analyser af datasættene ( dvs. træning kontra kontrol) blev udført med en envejs ANOVA, med den variable "træning" som en mellemfaktor. Latensen blev anvendt som en individsfaktor. Hvis der blev fundet signifikant interaktion, blev Tukey's post-hoc-procedure udført. Resultaterne viste et præ-træningsrespons inden for 20 ms post-stimulus, selvom aktivitetsområdet var inkonsekvent efter det første respons. Men efteruddannelsesaktiviteten udstillede ikke kun ar Esponse inden for den første 20 ms post-stimulus, som set under præ-træning, men det udviser også signifikant aktivitet 30-50 ms post-stimulus ( Figur 14 og Figur 15 ) 15 . Der var også en statistisk signifikant korrelation af "piggfrekvens" versus "time after stimulus" og "piggens pålidelighed" versus "time after stimulus". "Spike pålidelighed" kan defineres som sandsynligheden for at se et netværkssvar på en stimulering, hvor et svar på hver stimulus er tildelt en maksimal værdi på 1. Figur 16 viser næsten en 50% stigning i spikefrekvensen samt en 30 -50% stigning i piggens pålidelighed for trænet netværk versus kontrol i intervallet 20-50 ms post-stimulus. Disse resultater tyder på, at uddannelsen fundamentalt ændrede netværksdynamikken.
1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/>
Figur 1 : Værktøj og materialer anvendt til fjernelse af embryo. ( A ) Isfyldt bakke. ( B ) Petriskål fyldt med kold L-15 "slush." ( C ) Papirhåndklæde. ( D ) Sprøjteflaske med 70% ethanol. ( E ) Fine tang (x2). ( F ) Små kirurgiske saks. ( G ) Blunt-næse tommelfingre. ( H ) Store saks. ( I ) Kropspose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Værktøj og materialer anvendt til hjernekstraktion. ( A B ) Petriskål med embryohoveder. ( C ) Folie-dækket centrifugerør med opbevaringsmedium. ( D ) Inverteret glas Petriskål. ( E ) autoklaveret filterpapir. ( F ) bæger med 70% ethanol. ( G ) Plastpipette. ( H ) Iris saks. ( I ) Fine tang. ( J ) Tynd dobbelt-ended spatel. ( K ) Papirhåndklæde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Optimale versus ikke-optimale kulturer. ( A ) viser et sundt tæppe af celler, der dækker arrays, i modsætning til ( B )Hvor der er dårlig celleproliferation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Repræsentative resultater af spontan aktivitet. ( A ) Repræsentativ raster plot af spontan aktivitet. Tippemærkerne angiver aktionspotentialer optaget fra 9 aktive elektroder i et 20 s vindue ved en opkøbshastighed på 25 kHz og et båndpasfilterområde på mellem 3 kHz og 300 Hz. ( B ) Repræsentativt filtreret ekstracellulært virkningspotentiale fra et aktivt sted. Figur ændret fra reference 15 . Klik her for at se et større versioN af denne figur.
Figur 5 : Optagelsesopsætning. ( A ) Stimuleringsgenerator. ( B ) Temperaturregulator. ( C ) Strømforsyning. ( D ) Forstærker. ( E ) Headstage / forforstærker. ( F ) Capped MEA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6 : Skematisk repræsentation af den elektriske træningsprotokol. Optag en initial basislinje i 5 min og en sondestimulering i 3 min. Påfør tetan stimulering På i 90 s, som ikke er optaget. Ansøg og registrer en anden sondestimulering i 3 minutter og en endelig basislinje i 5 minutter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7 : Probing Stimulation and Training Signal Parameters. ( A ) Probing stimulering består af ± 900 mV bi-fasiske impulser administreret ved en frekvens på 0,5 Hz. ( B ) Pulstog består af 100, ± 900 mV bi-fasepulser med en frekvens på 250 Hz. ( C ) Træningssignalet består af 40 puls tog administreret hver 2. s. Figur ændret fra reference 15 ."_blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8 : Repræsentation af "L" -formkonfigurationen. Firkanter repræsenterer individuelle elektroder fra et MEA. Blå firkanter angiver elektroder, der anvendes til stimulering, mens alle andre bruges til optagelse. Figur ændret fra reference 15 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9 : Distinguishing Units fra Noise and Stimulation Artifacts. De flere øverste paneler ( A -
Figur 10 : Post-stimulus-tidshistogram (PSTH). En grafisk brugergrænseflade (se Materialetabel ) tegner PSTH'erne i henhold til brugerindgang ( dvs. befolkning PSTH, forudindtaget gennemsnitlig PSTH eller individuelKanal PSTH), der giver mulighed for et overblik over stimuleringsforsøg og for øjeblikkelig sammenligning mellem post- og pre-stimulus-filerne. Det tegner også de oprindelige versus de endelige PSTH'er; Dette sammenligner netværkssvaret til de første 6 og de sidste 6 stimuli. GUI'en udfører flere andre funktioner, såsom spidshastighed, interspidsinterval, spidser pr. Burst, inter-burst interval og burst-varighed for både stimuleringsfiler og filer med spontan aktivitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11 : Oversigt over celleforberedelse og plating. ( A ) En E17 gravid mus euthaniseres med CO 2 . ( B ) Musen er decapitatEd og livmoderen fjernes. ( C ) Embryoerne frigives og halshugges. ( D ) Hjernen ekstraheres fra hvert embryo, og frontalloberne fjernes. ( E ) Cellerne dissocieres. ( F ) De dissocierede celler suspenderes i medium. ( G ) De suspenderede celler er belagt på 60-kanals multi-elektrode arrays (MEAs). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 12 : Neuronale kulturer belagt på mikroelektrode arrays. Embryoniske musneuroner er belagt på 60-kanals MEA'er, som muliggør samtidig registrering af den neuronale aktivitet på tværs af netværket fra hver elektrode. (Figur ændretFra reference 15 ). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 13 : Sorteringsprogrammet bruges til at sortere waveforms fra hver kanal. Sorteringsprogrammet (se Materialetabellen ) indlæser en datafil og viser alle enheder, der oprindeligt blev erhvervet for hver kanal. En af flere metoder er valgt til at tildele signaler til bestemte enheder. I dette eksempel blev k-middelklyngningsalgoritmen valgt, og den gule enhed (mærket "enhed a" på bundvinduet) blev identificeret. Et andet program (se Materialetabel ) bruges til at eksportere .nex-filen til en .mat-fil, som er inputfilen til den brugerdefinerede GUI (se
Figur 14 : Ændret netværksaktivitet som reaktion på stimulering efter en træningsperiode. Repræsentativ raster plot af aktivitet fra otte elektroder. Den lodrette røde linje angiver stimulustidspunktet, og de sorte markeringer angiver handlingspotentialer. I foruddannelse ( A ) er der et øjeblikkeligt svar på stimuluspulsen på tværs af kanaler. I efteruddannelse ( B ) udviser netværket et mere forlænget aktivitetsrespons såvel som det umiddelbare respons på stimuleringen 15 ..jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 15 : Træede netværk har ændret spidsfrekvenserne betydeligt. Frekvensen af netværksspiking for kontrolnettet beregnes ved at integrere antallet af pigge over 50 ms umiddelbart efter hver stimulering og opdele i den periode. Vist er gennemsnittet af 12 trænet og 10 kontrolnetværk (fejlstængene angiver standardfejl for middelværdien). Asterisken (*) angiver en statistisk forskel ( p-værdi <0,05) mellem de to datasæt. Figur ændret fra reference 15 . Klik her for at se en larGer version af denne figur.
Figur 16 : Synaptisk medierede responser ændres væsentligt i uddannede netværk. ( A ) Pålideligheden, målt i 10 ms kasser og normaliseret til kontrolnettet, viser ingen ændring for direkte aktivering af neuroner nær elektroder (0-20 ms). Der er derfor ingen statistisk forskel mellem kontroller og uddannede netværk til disse bakker. På den anden side er længere-latensresponserne (30-50 ms) synaptisk medierede, hvilket indikerer, at denne metode giver en mere detaljeret undersøgelse af pålidelighed end i figur 15 ovenfor. ( B ) Befolkningsspidsfrekvensen gentager opførslen af pålideligheden og viser ingen ændring for den direkte aktivering (0-20 ms), mens en statDer findes en signifikant forskel for de langsigtede svar (30-50 ms). Denne adfærd er i overensstemmelse med de gennemsnitlige resultater i foregående figur 15 . Fejlstængerne er standardværdien af middelværdien, beregnet for 10 kontrolnetværk og 12 uddannede netværk. (*) P-værdi <0,05; (**) p-værdi <0,001. Figur ændret fra reference 15 . Klik her for at se en større version af denne figur.
| Antal | Vare |
| 1 | Autoklaveret glasreagensflaske (mindst 100 ml størrelse) |
| 20 | 15 ml sterile centrifugerør |
| 1 | 10 ml steril serologisk pipette |
| 4 | 25 ml sterilE serologisk pipette |
| 2 | 50 ml steril serologisk pipette |
| 1 | Centrifugerørstativ |
| 150 ml | Sterilt DI vand |
| 5 mg | Poly-D-lysin hætteglas |
Tabel 1: PDL-forberedelse - Liste over materialer og reagenser.
| Antal | Vare |
| 1 | 50 ml sterile centrifugerør |
| 10 | 15 ml sterile centrifugerør |
| 2 | 1 ml steril serologisk pipette |
| 2 | 50 ml steril serologisk pipette |
| 1 | Centrifugerørstativ |
| 1 ml | FosfatBuffer saltvand (PBS) |
| 1 mg | Laminin |
Tabel 2: Lamininforberedelse - Liste over materialer og reagenser.
| Antal | Vare |
| 1 | Autoklaveret glasreagensflaske (mindst 100 ml størrelse) |
| 20 | 15 ml sterile centrifugerør |
| 1 | 10 ml steril serologisk pipette |
| 4 | 25 ml steril serologisk pipette |
| 2 | 50 ml steril serologisk pipette |
| 1 | Centrifugerørstativ |
| 150 ml | Sterilt DI vand |
| 5 mg | Poly-D-lysin hætteglas |
Tabel 3: Forberedelse til opbevaring af medium - Liste over materialer og reagenser.
| Antal | Vare |
| 44 ml | DMEM med en stablilzed form af L-glutamin (se tabel over materialer) |
| 1 ml | Serum-frit supplement til neuralcellekultur (se tabel over materialer) |
| 2,5 ml | Hesteserum |
| 100 μl | Ascorbinsyre [4 mg / ml] |
| 2,5 ml | Fetal bovint serum (FBS) |
| 0,5 ml | Pen strep (valgfrit) |
| 1 | 50 ml sterile centrifugerør |
| 2 | 25 ml steril serologisk pipette |
| 2 | 10 ml steril serologisk pipette </ Td> |
| 2 | 1 ml steril serologisk pipette |
| 1 | 250 ml filter |
Tabel 4: DMEM 5/5 Medium Forberedelse - Liste over materialer og reagenser.
| Antal | Vare |
| 49 ml | DMEM med en stablilzed form af L-glutamin (se tabel over materialer) |
| 1 ml | Serum-frit supplement til neuralcellekultur (se tabel over materialer) |
| 100 μl | Ascorbinsyre [4 mg / ml] |
| 0,5 ml | Pen strep (valgfrit) |
| 1 | 50 ml sterile centrifugerør |
| 2 | 25 ml steril serologisk pipette |
| 2 | 1 ml steril serologisk pipette |
| 1 | 250 ml filter |
Tabel 5: DMEM + Medium Forberedelse - Liste over materialer og reagenser.
| Antal | Vare |
| 1 | Papain 140 E / hætteglas |
| 1 | Dnase 1.260 U / hætteglas |
| 7 ml | DMEM + (kølet) |
| 5 ml | DMEM 5/5 (opvarmet) |
| 10 μl | Trypan blå |
| 2 | Scalpel blade |
| 1 | 35 mm steril petriskål |
| 4 | 15 ml sterile centrifugerør |
| 2 | 5 ml sterile kryogenrør |
| 2 | 2 ml sterile kryogenrør |
| 1 | 50 ml sterile centrifugerør |
| 1 | Mikrocentrifugerør |
| 2 | Stor boreoverføringspipette |
| 3 | Små boreoverføringspipette |
| 5 | 2 ml steril serologisk pipette |
| 5 | 1 ml steril serologisk pipette |
| 2 | 10 μL sterile mikropipette tips |
| 1 | 1000 μL sterile mikropipette tips |
| 1 | Hemocytometer chip |
Tabel 6: Celledissociation - Liste over materialer og reagenser.
Discussion
De trin, der skitseres i denne protokol, giver tilstrækkelig detaljer for begynderen at platte sine egne neuronalkulturer på MEA'er og registrere netværksaktivitet. Denne protokol vil bidrage til at sikre, at kulturerne klæber ordentligt og danner et tæppelag af celler over elektrodarrayerne og forbliver sunde og forureningsfrie i flere måneder.
Selv om det er bedst at overholde alle dele af protokollen, er der trin i hele processen, der er kritiske for det vellykkede resultat. Anvendelsen af aseptisk teknik gennem hele processen er afgørende for at forhindre kulturer i at blive forurenet. Nye MEA'er skal gøres hydrofile, som beskrevet i protokollen, ellers vil dårlig celleadhæsion resultere. At undgå hård pipettering og dannelsen af luftbobler under dissociation vil reducere antallet af beskadigede celler udpladet og vil føre til et højere og sundere udbytte. Skifter fra DMEM 5/5 til DMEM + efter den førsteFodring er også vigtig. DMEM 5/5 indeholder hesteserum, hvilket vil medføre, at glialceller dominerer kulturen, hvis de anvendes kontinuerligt og vil resultere i dårlig neuronaktivitet, selv om kulturerne vil fremstå sunde 17 . Det er også afgørende at fodre kulturen som planlagt og holde dem i rette inkubationsbetingelser.
Plating cellekulturer på MEA involverer mange variabler, der kan føre til mindre end optimale resultater. Selvom målet er et perfekt "tæppe" af celler, vil manglende overholdelse af de ovennævnte kritiske trin resultere i dårlig cellemodning eller i forurening. Dårlig celleadhæsion, som er forskellig fra dårlig celle modning, er også en bekymring. Dette kan skyldes flere faktorer, herunder dårlig MEA-præparation forud for plating eller brugen af gammelt medium. Hvis gammelt medium indeholdende en stabiliseret form af L-glutamin og serumfrit supplement til neuralcellekultur (se Materialebord) Anvendes, cellerne i første omgang klæber, men derefter flyder væk efter ca. to uger. Hvis bakteriel forurening er et vedvarende problem, kan et antibiotikum, såsom ampicillin eller pen-strep, tilsættes til mediet. Der er også fungicider til rådighed til behandling af svampekontaminering. Dette er nogle af de mere almindelige variabler, som kan påvirke udfaldet af kulturen. Der er mange andre, der kun opstår efter tid og erfaring.
I sammenligning med brugen af glasmikroelektroder er denne teknik fremragende til at studere netværksdynamik og farmakologiske reaktioner. Det muliggør brugen af mange forskellige spatio-temporale stimuleringsmønstre og muliggør optagelse af neuronale reaktioner fra flere områder på én gang. Tidligere grupper har vist interessante resultater ved hjælp af protokoller svarende til dem, der er beskrevet her 18 . Da kulturen varer i uger eller måneder, og de samme kulturer kan genbruges, er denne teknik også enLader til flere eksperimenter over tid på samme netværk.
Der er dog begrænsninger for denne teknik. MEA'er er ikke-invasive. Derfor kan de kun optage ekstracellulær aktivitet i modsætning til patch-clamping eller intracellulær optagelse med pipetter. Da hver elektrode i en matrix er dækket af flere celler, er det heller ikke muligt at løse aktiviteten af et enkelt neuron. Omvendt, fordi disse er in vitro kulturer, kan de ikke fuldt ud reproducere strukturelle egenskaber hos netværk i hjernen. Aktiviteten kan kun registreres i mindre end 30 minutter ad gangen uden nogen mekanisme, der giver en CO 2 atmosfære for cellerne til at opretholde deres pH-balance.
Når denne teknik er mestret, kan man undersøge farmakologiske manipulationer med eller uden elektrisk stimulering. Nye protokoller til sondring af læring og hukommelse i neuronale netværk kan også konstrueres og testes sammen med pRotokoller til hippocampale eller rygmarv netværk. Protokoller til stimulering og træning af netværk er tidligere blevet offentliggjort, og nogle af disse blev videreudviklet til in vivo protokoller, såsom den "selektive tilpasning" foreslået af Eytan et al. 19 . Flere protokoller blev testet. Kun resultater fra en modifikation af tetanus-proceduren foreslået af Ruaro i 2005 præsenteres her 14 , 20 .
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation tilskud CMMI-1300007. Vi vil gerne anerkende tidligere labmedlemmer, som har hjulpet med udformningen af disse protokoller og med opretholdelsen af kulturerne i over fem år på George Mason University: Dr. Joseph J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera og Robert Graham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4 mg/mL aliquots |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
| Beakers - glass - 100 mL | VWR | 13912-160 | |
| Beakers - glass - 500 mL | VWR | 10754-956 | |
| Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
| Cryogenic vial - sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Cryogenic vial - sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
| DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
| DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
| Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
| Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
| GlutaMAX -- I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
| Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
| Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
| Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
| MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
| MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
| MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
| MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
| MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
| MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
| Media storage bottle - glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
| Micropipette tips - 10 μL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
| Micropipette tips - 1,000 μL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
| Micropipette tips - 200 μL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
| Micropipetter - 10 μL | Thermo Fisher | 4641170N | |
| Micropipetter - 1,000 μL | Thermo Fisher | 4641210N | |
| Micropipetter - 200 μL | Thermo Fisher | 4641230N | |
| Papain - 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
| Petri dishes -100 mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes -100 mm glass | VWR | 10754-788 | |
| Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| Phosphate buffer saline (PBS) (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
| Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
| Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
| Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
| Scissors - iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
| Scissors - large | World Precision Instruments | 14214 | |
| Scissors - small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
| Serological pipette - sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
| Serological pipette - sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Serological pipette - sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
| Serological pipette - sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
| Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
| Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
| Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
| Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
| Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
| Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
| Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
| Spatula - small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
| Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
| Transfer pipette - large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
| Transfer pipette - small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
| Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |
References
- Charkhkar, H., Frewin, C., et al. Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing. Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).
- Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development. Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).
- Fröhlich, F., McCormick, D. A. Endogenous electric fields may guide neocortical network activity. Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).
- Ozen, S., Sirota, A., et al. Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats. J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).
- Shahaf, G., Marom, S. Learning in networks of cortical neurons. J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Marom, S., Eytan, D. Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons. Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors. Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays. Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. Network plasticity in cortical assemblies. Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).
- le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons. PloS one. 5 (1), 8871 (2010).
- Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures. IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).
- Hamilton, F., Graham, R., et al. Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation. PloS one. 10 (11), 0142399 (2015).
- Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf (2016).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells: Business Source. , MIT Press. Cambridge. (1998).
- Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array. J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).
- Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons. J. Neurosci. 23 (28), (2003).
- Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. Statistical properties of information processing in neuronal networks. Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).
