Summary

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

Published: June 15, 2017
doi:

Summary

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Abstract

L'uso di topi geneticamente modificati ha contribuito in maniera significativa agli studi sui processi fisiologici e patologici in vivo . L'iniezione pronucleare di espressioni del DNA in oociti fecondati rimane la tecnica più comunemente utilizzata per generare topi transgenici per sovraespressione. Con l'introduzione della tecnologia CRISPR per il targeting genico, l'iniezione pronucleare in oociti fecondati è stata estesa alla generazione di topi di knockout e knockin. Questo lavoro descrive la preparazione del DNA per l'iniezione e la generazione di guide CRISPR per il targeting genico, con particolare attenzione al controllo di qualità. Le procedure di genotipizzazione necessarie per l'identificazione dei potenziali fondatori sono critiche. Le strategie innovative di genotipizzazione che sfruttano le funzionalità "multiplexing" di CRISPR sono qui presentate. Sono inoltre descritte procedure chirurgiche. Insieme, i passaggi del protocollo consentiranno la generazione di genI topi eticamente modificati e per la successiva istituzione di colonie del mouse per una pletora di campi di ricerca, tra cui immunologia, neuroscienza, cancro, fisiologia, sviluppo e altri.

Introduction

I modelli animali, sia in vertebrati che in invertebrati, sono stati strumentali ad esaminare la fisiopatologia delle condizioni umane come la malattia di Alzheimer 1 , 2 . Sono anche strumenti preziosi per la ricerca di modificatori della malattia e per sviluppare in ultima analisi nuove strategie di trattamento nella speranza di una cura. Sebbene ogni modello abbia limiti intrinseci, l'uso degli animali come interi modelli sistemici è fondamentale per la ricerca biomedica. Questo perché l'ambiente fisiologico metabolico e complesso non può essere interamente simulato nella cultura del tessuto.

Fino ad oggi, il topo rimane la specie mammiferi più diffusa per la manipolazione genetica perché presenta diversi vantaggi. I processi fisiologici e i geni associati alle malattie sono altamente conservati tra topi e esseri umani. Il topo è stato il primo mammifero a sequenziare il proprio genoma (2002), un anno prima del genoma umanoMe (2003). Oltre a questa ricchezza di informazioni genetiche, il mouse ha buone capacità di allevamento, un veloce ciclo di sviluppo (6 settimane dalla fecondazione allo svezzamento) e una dimensione ragionevole. Tutti questi vantaggi, accoppiati con indicatori fisiologici, come i colori del cappotto distinti (richiesti per le strategie di attraversamento), hanno reso il topo un modello attraente per la manipolazione genetica. Soprattutto, nella prima età della genetica moderna, Gregor Mendel ha iniziato a lavorare sui topi prima di passare alle piante 3 .

Le tecniche di trasferimento del gene hanno determinato la generazione del primo topo transgenico più di tre decenni fa 4 , inizialmente creato usando la consegna virale. Tuttavia, i ricercatori hanno subito capito che una delle principali sfide del transgenesi del mouse era l'incapacità di controllare il destino del DNA esogeno. Poiché la consegna virale di transgeni nei oociti del mouse ha portato a copie multiple integrate casualmente nel genoma, la possibilitY di stabilire linee transgeniche successive era limitata.

Una tale limitazione è stata superata quando Gordon et al. Ha generato la prima linea del mouse transgenica mediante microinjection 5 , 6 . Ciò ha inizio l'epoca della tecnologia del DNA ricombinante ei parametri che influenzano l'esito di una sessione di microinjection sono stati ampiamente studiati 7 . Sebbene la microinjection non consente di controllare il sito di integrazione del transgene (che alla fine determina livelli di espressione specifici per ogni mouse fondatore), il vantaggio principale della microinjection pronucleare rimane la formazione di concatenanti ( cioè, array di copie multiple del transgene, Collegati in serie) prima dell'integrazione genomica 5 . Questa caratteristica è stata utilizzata nel corso degli anni per stabilire migliaia di linee di topi transgenici che sovraespressionano un gene di interesse. Da allora, la transgenesis, l'aModificazione rtificale del genoma di un organismo, è stata ampiamente utilizzata per identificare il ruolo dei geni singoli nel verificarsi di malattie.

Un altro successo chiave nella manipolazione del genoma del mouse è stato raggiunto quando Mario Capecchi ha interrotto con successo un singolo gene nel topo, aprendo l'era del gene targeting 8 . Tuttavia, i principali inconvenienti sono emersi rapidamente dal targeting genico basato su cellule ES, incluse le sfide di coltura delle cellule ES, il grado di chimerismo un po 'variabile e la durata del processo ( ovvero 12-18 mesi, minimo per ottenere il topo) .

Recentemente, i metodi alternativi per le nuove tecnologie, come le endonucleasi ingegnerizzate ( es. Le nucleasi a dito di zinco (ZFN), le nucleasi efficace di attivazione della trascrizione (TALEN) e le cluster ripetute palindromiche brevi (CRISPR / Cas9) Accelerare il processo di targeting genico nel micE 9 , 10 . Queste endonucleasi possono essere facilmente iniettate in oociti del mouse mediante microinjection, permettendo la generazione di topi mirati per il gene in appena 6 settimane.

Dalla prima relazione sull'utilizzo di CRISPR per la modifica del genoma 11 , questo sistema immunitario adattativo batterico ha sostituito ZFN e TALEN a causa dei suoi molti vantaggi, tra cui la facilità di sintesi e la capacità di individuare contemporaneamente più loci (indicati come "multiplexing "). CRISPR è stato utilizzato per l'individuazione genica nei topi 12 e da allora è stato applicato a innumerevoli specie, dalle piante agli esseri umani 13 , 14 . Ad oggi non esiste alcuna relazione di una singola specie resistente al montaggio del genoma CRISPR.

Le due principali fasi di limitazione della generazione di topi transgenici sono l'iniezione di oociti e la reimplantazioneDi questi oociti in femmine pseudo-incinte. Anche se questa tecnica è stata descritta da noi 15 e altri 16 , i recenti miglioramenti tecnici nell'embrione del topo e nelle tecniche di trasferimento del gene hanno rivoluzionato il processo di generazione di topi geneticamente modificati. Questi miglioramenti saranno descritti qui.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dall'Università del Nuovo Galles del Sud. 1. Preparazione del transgene (integrazione casuale) Elettroforesi analizzante per gel agarosio. Digestare il plasmide per accise il transgene usando enzimi appropriati (1 h di incubazione) o enzimi digestivi (15-30 minuti di incubazione) in un termociclista seguendo le raccomandazioni del produttore (vedere la figura 2A e la sua leggenda)….

Representative Results

Di seguito sono descritti i flussi di lavoro per la microinjection in caso di integrazione casuale e CRISPR-mediated gene targeting ( Figura 1 ). Figura 1: flusso di lavoro tipico per la generazione di topi modificati geneticamente. Per l'integrazione casuale, il transgene purificato vien…

Discussion

Fasi critiche all'interno del protocollo

La generazione di topi geneticamente modificati è noto per essere tecnicamente impegnativa. Tuttavia, il protocollo qui presentato è un metodo ottimizzato e semplificato che consente di masterizzare e risolvere la tecnica in tempo record. Ci sono due fasi necessarie per il completamento della tecnica. In primo luogo, la sintesi di modelli lineari del DNA (per la sintesi di sgRNAs) può essere ottenuta senza cloruro di magnesio (MgCl2). Tuttavia, è…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano il personale della struttura animale (BRC) per il loro sostegno continuo. Questo lavoro è stato finanziato dal National Health and Medical Research Council e dal Australian Research Council.

Materials

Micropipette 0.1-2.5 ul Eppendorf 4920000016
Micropipette 2-20 ul Eppendorf 4920000040
Micropipette 20-200 ul Eppendorf 4920000067
Micropipette 100-1000 ul Eppendorf 4920000083
Molecular weight marker  Bioline BIO-33025 HyperLadder 1kb
Molecular weight marker  Bioline BIO-33056 HyperLadder 100 bp
Agarose Bioline BIO-41025
EDTA buffer Sigma-Aldrich 93296 10x – Dilute to 1x
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific 15585011
SYBR Safe gel stain Invitrogen S33102
Gel extraction kit Qiagen 28706
PCR purification kit (Qiaquick) Qiagen 28106
Vacuum system (Manifold) Promega A7231
Nuclease-free microinjection buffer  Millipore MR-095-10F
Ultrafree-MC microcentrifuge filter  Millipore UFC30GV00
Cas9 mRNA Sigma-Aldrich CAS9MRNA
CRISPR expressing plasmid (px330) Addgene 42230
Nuclease free water Sigma-Aldrich W4502
Phusion polymerase New England Biolabs M0530L
T7 Quick High Yield RNA kit New England Biolabs E2050S
RNA purification spin columns (NucAway) Thermo Fisher Scientific AM10070
ssOligos Sigma-Aldrich OLIGO STANDARD
Donor plasmid Thermo Fisher Scientific GeneArt
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884
KSOMaa embryo culture medium Zenith Biotech  ZEKS-100
Mineral oil Zenith Biotech  ZSCO-100
M2 Medium Sigma-Aldrich M7167
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762
Mouthpiece Sigma-Aldrich A5177
Glass microcapillaries Sutter Instrument BF100-78-10
Proteinase K Applichem A3830.0100
Dumont #5 forceps Fine Science Tools  91150-20
Iris scissors Fine Science Tools  91460-11
Vessel clamp Fine Science Tools  18374-43
Wound clips  Fine Science Tools  12040-01
Clips applier  Fine Science Tools  12018-12
Micro-scissors  Fine Science Tools  15000-03
Cauterizer Fine Science Tools  18000-00
Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) Ethicon 1691H
5% CO2 incubator MG Scientific Galaxy 14S
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000c
Thermocycler Eppendorf 6321 000.515
Electrophoresis set up BioRad 1640300
UV Transilluminator BioRad 1708110EDU
Thermocycler Eppendorf 6334000069
Stereoscopic microscope Olympus SZX7
Inverted microscope Olympus IX71
2x Micromanipulators Eppendorf 5188000.012
Oocytes manipulator Eppendorf 5176000.025
Microinjector (Femtojet) Eppendorf 5247000.013
Mice C57BL/6J strain Australian BioResources C57BL/6JAusb 

References

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Cite This Article
Delerue, F., Ittner, L. M. Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes. J. Vis. Exp. (124), e55765, doi:10.3791/55765 (2017).

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