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Chemistry

Integration von miniaturisierter Festphasenextraktion und LC-MS / MS-Nachweis von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen

doi: 10.3791/55778 Published: July 14, 2017

Summary

Ein selektives und empfindliches Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrieverfahren (LC-MS / MS), gekoppelt mit einer effizienten Festphasenextraktion auf einer gemischten Kationenaustausch- (MCX) 96-Well-Mikroplatte, wurde für die Messung von freiem 3-Nitrotyrosin ( 3-NT) im menschlichen Urin mit hohem Durchsatz, der für klinische Anwendungen geeignet ist.

Abstract

Freies 3-Nitrotyrosin (3-NT) wurde weitgehend als möglicher Biomarker für oxidativen Stress eingesetzt. Erhöhte Niveaus von 3-NT wurden in einer Vielzahl von pathologischen Bedingungen berichtet. Allerdings fehlt es den vorhandenen Methoden an der ausreichenden Empfindlichkeit und / oder Spezifität, die notwendig sind, um das niedrige endogene Niveau von 3-NT zuverlässig zu messen und für klinische Anwendungen zu schwerfällig zu sein. Daher ist eine analytische Verbesserung dringend erforderlich, um die Niveaus von 3-NT genau zu quantifizieren und die Rolle von 3-NT in pathologischen Zuständen zu überprüfen. Dieses Protokoll stellt die Entwicklung einer neuartigen Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) -Erkennung in Kombination mit einer miniaturisierten Festphasenextraktion (SPE) für die schnelle und genaue Messung von 3-NT im menschlichen Urin als nicht-invasiven Biomarker dar Für oxidativen Stress SPE mit einer 96-Well-Platte vereinfachte den Prozess durch die Kombination von Probenreinigung und Analytanreicherung ohne mühsame Derivatisierungs- und Verdampfungsschritte deutlich, Verringerung des Lösemittelverbrauchs, Abfallentsorgung, Verunreinigungsgefahr und Gesamtverarbeitungszeit. Die Verwendung von 25 mM Ammoniumacetat (NH 4 OAc) bei pH 9 als SPE-Elutionslösung verbesserte die Selektivität wesentlich. Die Massenspektrometrie-Signalantwort wurde durch die Einstellung der MRM-Übergänge (MRM) verbessert. Die Verwendung von 0,01% HCOOH als Additiv auf einer Pentafluorphenyl (PFP) -Säule (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) verbesserte die Signalantwort weiter 2,5-fach und verkürzte die Gesamtlaufzeit auf 7 min. Es wurde eine untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) von 10 pg / ml (0,044 nM) erreicht, was eine signifikante Empfindlichkeitsverbesserung gegenüber den angegebenen Assays darstellt. Diese vereinfachte, schnelle, selektive und empfindliche Methode erlaubt es, zwei Platten von Urinproben (n = 192) in einer 24-Stunden-Zeitspanne zu verarbeiten. In Anbetracht der deutlich verbesserten analytischen Leistungsfähigkeit und der nicht-invasiven und kostengünstigen Urinprobenentnahme ist der vorgeschlagene Assay für präklinische und klinische Zwecke von VorteilStudien.

Introduction

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Die Auswirkungen von oxidativem Stress auf die klinische Präsentation wurden in den letzten Jahren in den Vordergrund gerückt 1 . Einer der untersuchten Biomarker ist 3-Nitrotyrosin (3-NT), ein endstabiles Produkt, das gebildet wird, wenn reaktive Stickstoffspezies (RNS) mit Tyrosin, einem Catecholamin-Neurotransmitter-Vorläufer, zusammenwirken. Während 3-NT klinischen Wert als Biomarker für RNS in vivo haben kann, können die wesentlichen Veränderungen der Eigenschaften und Funktionen von Tyrosin die entsprechenden Proteine ​​und zellulären Funktionen 1 , 2 nachteilig beeinflussen. Emerging Research hat vorgeschlagen, dass 3-NT eine wichtige Rolle bei entzündlichen Zuständen spielen kann 3 , neurodegenerative Erkrankungen 4 , 5 , Herz-Kreislauf-Erkrankungen 6 und Diabetes 7 sowie Zustände im Zusammenhang mit oxidativem Stress. Doch diese obseRvations basiert auf Ergebnissen aus Methoden, denen keine Sensitivität und / oder Selektivität fehlt 8 , 9 , 10 , 11 . Die enormen 3-NT-Konzentrationsbereiche für die bisher in der Literatur berichteten biologischen Proben zeigen, dass mit diesen Assays ernsthafte analytische Probleme verbunden sind und technische Verbesserungen erforderlich sind, um die Niveaus von 3-NT genau zu quantifizieren und ihre Rolle in der Pathologie dieser Bedingungen zu überprüfen .

Die Quantifizierung von freiem 3-NT in biologischen Matrizen stellt eine besondere Herausforderung für Mensch und Instrument 8 , 9 , 10 , 11 dar . Erstens verlangt der Spurengrad des endogenen 3-NT eine hochempfindliche Detektion; Zweitens die Existenz zahlreicher strukturell ähnlicher Analoga, insbesondere Tyrosin, die inGroßer Überschuss erfordert einen hohen Grad an Selektivität; Drittens erfordert die artefaktuelle Bildung von 3-NT durch Tyrosin-Nitrierung mit ubiquitärem Nitrat und Nitrit eine besondere Berücksichtigung während der Probenvorbereitung, um eine falsche Überschätzung von 3-NT zu vermeiden.

Unter einer Vielzahl von Methoden, die zur Messung von 3-NT eingesetzt wurden, wurde MS / MS aufgrund seiner überlegenen Empfindlichkeit und Selektivität 11 , 12 , 13 , 14 als Goldstandardmethode angesehen. Gaschromatographie (GC) gekoppelte MS / MS bietet die beste Empfindlichkeit, jedoch sind die unentbehrlichen Probenderivatisierungsschritte zu langwierig und zeitaufwendig, um für den klinischen Nutzen 15 , 16 effizient zu sein. LC-MS / MS erfordert keine komplexe Musterderivatisierung und ist damit vielversprechender. Dennoch gibt es mehrere Hindernisse zu überwinden wie die seDie in der Literatur berichteten LC-MS / MS-Methoden müssen sich für die Messung von niedrigen 3-NT 7 , 17 , 18 verbessern und die relativ lange Durchlaufzeit für die Hochdurchsatzanwendungen 12 , 13 , 17 , 19 verkürzen .

Darüber hinaus spielt bei der Betrachtung klinischer Anwendungen die verwendete biologische Matrix eine bedeutende Rolle. Es sollte einfach und kostengünstig zu erhalten und nicht-invasiv, wenn möglich 20 , 21 , 22 . Plasma, die traditionell verwendete Probe in der Literatur, ist keine klinisch wünschenswerte Matrix, so dass eine Methodik, die Urin verwendet, die nicht-invasiv und kostengünstig ist, gesucht wurde.

Mehrere Versuche zu entwickeln relUnd spezielle LC-MS / MS-Methoden wurden mit Urin 9 , 10 , 11 gemacht . Allerdings haben sie alle nicht selektiv, zuverlässig oder effizient genug für die klinische Anwendung. Die Effektivität der vorherrschenden SPE mit herkömmlicher Umkehrphasenpatrone (C18-Typ) als Probenreinigung für die 3-NT-Analyse wurde in Frage gestellt und eine sequentielle SPE von starkem Kationenaustausch (SCX) und umgekehrter Phase C18-OH wurde vorgeschlagen 6 , 7 , 19 Eine kürzlich entwickelte LC-MS / MS-Methode verwendete ein mehrstufiges Reinigungsverfahren von manueller C18 SPE, präparative Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Online-SPE zur Analyse von 3-NT 23 . Obwohl diese Methode für klinische Zwecke empfindlich genug war, mit einem LLOQ von 0,041 nM, war der Cleanup-Prozess intensiv und langwierig und requiRote 3 ml Urin, die ihre Durchführbarkeit für Hochdurchsatz begrenzt. Ein molekular geprägtes Polymer wurde als SPE-Sorptionsmittel verwendet, um die Effizienz des Reinigungsverfahrens 14 zu verbessern, aber das resultierende LLOQ (0,7 & mgr; g / ml) war für klinische Proben nicht niedrig genug. Eine andere Methode erforderte zweidimensionale (2D) LC-MS / MS- und Immunoaffinitätschromatographie zur Probenreinigung, um eine Nachweisgrenze (LOD) von 0,022 nM 24 zu erreichen . Während alle diese Methoden Fortschritte bei der Bewertung von 3-NT gemacht haben, hat keiner die Empfindlichkeit, Zuverlässigkeit und Effizienz für klinische Anwendungen erreicht.

Um die Pathologie der freien 3-NT und seine Rolle als Biomarker für oxidativen Stress im klinischen Umfeld zu untersuchen, haben wir eine Methode entwickelt , die einfache, effiziente, genaue und präzise ist, so dass für Hochdurchsatz - klinische Anwendungen 25. Ein miniaturisierter Mischmodus Kation exc(MCX) 96-well Extraktion Mikroplatte wurde implementiert, um eine einfache und effektive Probenreinigung und Anreicherung von 3-NT in einer einzigen Extraktion zu erreichen, die die Nachteile bei den bestehenden Methoden, die eine Derivatisierung, Verdampfung und 2D-LC erfordern, umgehen. Die Flüssigkeitschromatographie mit 0,01% HCOOH als Additiv in der mobilen Phase lieferte eine verbesserte Signalantwort mit einer schnellen Zykluszeit. Die Selektivität wurde durch die Anwendung einer milden NH 4 OAc-Elutionslösung für die selektive Elution von 3-NT und die Verwendung des MRM-Übergangs für sowohl 3-NT als auch den internen Standard (IS) weiter verbessert. Der Matrixeffekt wurde durch die Verwendung einer reduzierten Menge eines bevorzugten 13 C-markierten Isotopen IS zur Quantifizierung kompensiert. Mit dem Aufkommen dieser Methodik werden Forscher und Kliniker in der Lage sein, die Rolle von 3-NT in klinischen Zuständen zu überprüfen und die Auswirkungen von oxidativem Stress weiter zu erforschen.

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Protocol

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Alle Studien mit menschlichen Urinproben wurden unter Einhaltung des von Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB) genehmigten Verfahrens durchgeführt.

1. Urinprobenentnahme und Creatinin (Cr) Bestimmung

  1. Sammle 5 ml des nächsten Morgens Urinproben nach ca. 10 h über Nacht in einem 5 mL Transportrohr A mit 250 μl 3 N HCl als Konservierungsmittel und bei -20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
  2. Tau und Wirbel 5 mL Transport Urin Eine Röhre und zentrifugieren in einer Zentrifuge ( zB Sorvall) (2297 xg, 10 min).
  3. Aliquot 1 ml Urin zweimal aus dem 5 ml Transportrohr A
  4. Bestimmen Sie Cr durch eine Urin-Kreatinin-Methode 26 .

2. Vorbereitung von Standard-, IS- und Qualitätskontroll- (QC) Proben

  1. Eine Stammlösung von 3-NT mit 100 μg / ml in Wasser mit 0,01% HCOOH-Mobilphase A (MA) herstellen und bei -20 ° C aufbewahren.
  2. MachenEine 3-NT-Arbeits-Standardlösung bei einer Konzentration von 100 ng / ml durch Verdünnen der 100 μg / ml 3-NT-Stammlösung mit MA.
  3. Generierung von Standards von 5 bis 2500 pg / ml durch Verdünnung des 100 ng / mL-Arbeitsstandards mit 0,15 M HCl angesäuerter Blindurin frei von 3-NT zusammen mit leeren und doppelten Blindproben.
  4. Eine Stammlösung von IS 13 C 9 -3-NT bei 100 μg / mL in Wasser mit MA vorbereiten und bei -20 ° C aufbewahren.
  5. Machen Sie eine IS-Arbeitslösung bei 500 pg / ml durch Verdünnung der 100 μg / mL 13 C 9 -3-NT IS-Stammlösung mit MA.
  6. Stellen Sie fünf Niveaus von QC-Proben fest, die das LLOQ, niedrige, mittlere und hohe Niveaus ( dh 10, 25, 100, 500 und 1.250 pg / ml) abdecken, durch Verdünnung des 3-NT-Arbeitsstandards im angesäuerten leeren Urin.

3. Festphasenextraktion

  1. Tau-und Vortex Urin Proben, Standards und QC Proben.
  2. Fügen Sie Urin Proben, Standards und QC-SampLes (jeweils 250 & mgr; l) bis 32 Vertiefungen einer sauberen 2 ml 96-Well-Sammelplatte.
  3. Stellen Sie die 500 pg / ml IS-Arbeitslösung (50 μL) in jede Vertiefung vor, außer bei doppelter Blindprobe gut. Füge 0,01% HCOOH (50 μl) zu der doppelten Blindprobe gut hinzu.
  4. Füge LC-MS / MS Wasser mit 0,1% HCOOH (250 μL) hinzu.
  5. Mischen Sie die obige Mischung mit einer 8-Kanal-Pipette dreimal.
  6. Abdeckung der Platte bis zum SPE-Laden.
  7. Legen Sie eine MCX 96-well Extraktion Platte und ein Sammelbehälter auf einem positiven Druck Prozessor.
  8. Bedingung der Extraktionsplatte mit fließendem MeOH (200 μL) durch das Sorptionsmittel.
  9. Äquilibrieren durch Fließen von Wasser mit 2% HCOOH (200 μL) durch das Sorptionsmittel.
  10. Laden Sie das gesamte Volumen jeder der vorgemischten Proben sorgfältig auf die vorkonditionierte Extraktionsplatte mit einer 8-Kanal-Pipette.
  11. Setzen Sie einen niedrigen positiven Druck ( z. B. 3 psi) auf den positiven Druckprozessor, um zu ermöglichen, dass die Mischung durchströmtOust das Sorptionsmittel langsam, stellen Sie den Druck, wenn nötig.
  12. Waschen Sie die Vertiefungen durch Fließen von Wasser mit 2% HCOOH (200 & mgr; l) durch das Sorptionsmittel.
  13. Waschen Sie die Vertiefungen durch Fließen von Methanol (200 & mgr; l) durch das Sorptionsmittel.
  14. Waschen Sie die Vertiefungen durch Fließen von Wasser (200 & mgr; l) durch das Sorptionsmittel.
  15. Trocknen Sie die Vertiefungen vollständig mit einer hohen positiven Druckeinstellung ( z. B. 40 psi) auf dem positiven Druckprozessor.
  16. Ersetzen Sie das Reservoir durch eine saubere 2 mL 96-Well-Sammelplatte.
  17. 25 mM NH 4 OAc bei pH 9 (50 μL) auftragen, um den zurückgehaltenen Analyten und IS aus der Extraktionsplatte zu eluieren.
  18. LC-MS Wasser mit 5% HCOOH (50 μL) pipettieren, um das Eluat zu neutralisieren.
  19. Mit der 8-Kanal-Pipette dreimal mischen und zur LC-MS / MS-Station zur Analyse einreichen.

4. LC-MS / MS-Analyse

  1. Messen Sie 2.000 mL LC-MS-Wasser mit einem Messzylinder genau und überführen Sie ihn in eine 2-l-Flasche.
  2. PIpette 200 μl reines HCOOH in die obige Flasche, die LC-MS Wasser enthält.
  3. Gründlich mischen und als mobile Phase A (MA) etikettieren. Include Initialen, Vorbereitungsdatum und Ablaufdatum.
  4. Nehmen Sie eine 2-l-Flasche LC-MS Methanol und Etikett als mobile Phase B (MB) mit Startdatum und Verfallsdatum.
  5. Stellen Sie die Temperatur des Auto-Samplers auf 4 ° C ein.
  6. Legen Sie die Sammelplatte mit vorbereiteten Proben in den Autosampler.
  7. Legen Sie eine PFP-Säule (150 mm x 2,1 mm id, 3 μm) und Schutzsäule in den Ofen.
  8. Stellen Sie die Ofentemperatur auf 30 ° C ein.
  9. Äquilibrieren Sie 10 min unter Verwendung des Erfassungsverfahrens mit der LC-Gradientenelution, wie in Tabelle 1 gezeigt .
Zeit (min) Modul Veranstaltungen Parameter
0 Pumps Pumpe B konz. 5
0,5 Pumps Pumpe B konz. 20
1 Pumps Pumpe B konz. 50
3 Pumps Pumpe B konz. 80
4 Pumps Pumpe B konz. 90
4.01 Pumps Pumpe B konz. 95
5.5 Pumps Pumpe B konz. 95
5.6 Pumps Pumpe B konz. 5
7 Regler Halt

Tabelle 1: Flüssigchromatographie-Gradienten-Elutionsbedingungen

  1. Erstellen Sie eine Batch-Liste mitStandards, QC und Urinproben.
  2. Starten Sie die Charge durch Injektion der vorbereiteten Proben (12 μL).

5. Peak Identification, Integration und Datenprozess

  1. Steuerung der Datenerfassung und -verarbeitung mit der Software.
  2. Identifizieren und integrieren 3-NT- und IS-Peaks für alle Proben.
  3. Stellen Sie eine Standardkurve mit einem Bereich von 10-2.500 pg / mL für die 3-NT-Quantifizierung durch lineare Regression des Peakflächenverhältnisses von 3-NT und IS gegenüber der nominalen 3-NT-Konzentration mit einem Gewichtungsfaktor von 1 / x fest.
  4. Quantifizieren Sie alle Proben mit der Standardkurve.
  5. Bestimmen Sie, ob die QC-Proben in den festgelegten Bereich fallen.
  6. Umwandlung der detektierten Konzentrationen von Urinproben in endgültige Ergebnisse in der Einheit von nM oder nmol / mmol Cr.

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Representative Results

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Fig. 1 veranschaulicht, daß 3-NT vollständig chromatographisch von anderen strukturell ähnlichen Tyrosin-Analoga unter der optimierten LC-Bedingung getrennt ist, was die Co-Elutions-Interferenzen aufgrund dieser stark übermäßigen Verbindungen eliminiert und folglich den Grad der Assay-Selektivität erhöht. Darüber hinaus ermöglicht die Gradientenelution mit 0,01% HCOOH als Additiv in MA und Methanol bei einer Durchflussrate von 0,45 mL / min eine schnelle Elution von 3-NT ( dh 3 min bei einer Durchlaufzeit von 7 min).

Abbildung 1
Abbildung 1: Baseline LC Chromatographische Trennung von 3-NT aus anderen Tyrosin-Analoga in einer Standardlösung. ( A ) p- Tyrosin; ( B ) m -Tyrosin; ( C ) o -Tyrosin; ( D ) Cl-Tyrosin; ( E ) 3-NT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2 zeigt, dass in der doppelten Blindprobe kein 3-NT-Signal beobachtet wird, was während des gesamten Prozesses keine Bildung von artefaktischem 3-NT anzeigt. Abbildung 3 zeigt repräsentative MRM-Chromatogramme von 3-NT und IS für eine gesunde Person. Wie zu sehen ist, werden bei den Retentionszeiten von 3-NT und IS keine Störsignale beobachtet. Darüber hinaus wurde weniger als ± 6% Unterschied in 3-NT zwischen den nicht-stacheligen und stacheligen gepoolten Urinproben mit Nitrit (50 μM), Nitrat (50 μM) und Tyrosin (50 mg / L) 25 beobachtet, was weiter Unterstützung bietet Auf die Spezifität des Assays.


Abbildung 2: MRM-Chromatogramme von 3-NT und IS in einer repräsentativen Double Blank Sample. ( A ) 3-NT-MRM-Quantifizierer 227,0> 90,0; ( B ) IS MRM-Quantifizierer 236.0> 189.0. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: MRM-Chromatogramme von 3-NT und IS in einer repräsentativen Urinprobe von gesunden Menschen. ( A ) 3-NT-MRM-Quantifizierer 227,0> 90,0; ( B ) IS MRM-Quantifizierer 236.0> 189.0. Bitte klicken Sie auf ihnUm eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Standardkurve wurde durch Extraktion von angesäuertem Blindurin mit 3-NT im Bereich von 10-2500 pg / ml durch Auftragen des Peakflächenverhältnisses von 3-NT und IS gegenüber der Nennkonzentration von 3-NT mit einer linearen Anpassung ermittelt Von 1 / x Gewichtung. Eine repräsentative Standardkurve ist in Abbildung 4 dargestellt . Die LOD, definiert als die niedrigste Konzentration mit einem Signal-Rausch-Verhältnis größer als drei, wurde mit 2 pg / ml (0,0088 nM) bestimmt. Das LLOQ wurde mit 10 pg / ml (0,044 nM) definitionsgemäß als die niedrigste zu messende Konzentration innerhalb von ± 20% der Ungenauigkeit und Genauigkeit mit dem Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als zehn bestimmt.

Abbildung 4
Abbildung 4: Eine repräsentative 3-NT-Standardkurve imBereich von 10-2.500 pg / ml. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Wesentliche Schwankungen der bisher in der Literatur berichteten Konzentrationen für das endogene freie 3-NT in menschlichen Urinproben zeigen methodische Probleme, die mit den verfügbaren Assays 8 , 9 , 10 , 11 verbunden sind . Eine genaue Bestimmung des niedrigen Basalniveaus von 3-NT im menschlichen Urin bleibt eine anspruchsvolle Aufgabe, die besondere Vorkehrungen für die Probenvorbereitung und die LC-MS / MS-Analyse erfordert. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige SPE-Prozedur, kombiniert mit einer selektiven LC-MS / MS-Detektion, die die spezifische und empfindliche Bestimmung von Harn-3-NT mit hohem Durchsatz ermöglicht.

Sorgfältige Auswahl von MRM-Parametern verbesserte die Selektivität für den Nachweis von 3-NT. Der MRM-Übergang m / z 236,0> 96,0 von IS für 3-NT im Plasma 27 verursachte eine schwere Kontamination bei Urinproben. Eine sauberere, 9-fache Erhöhung des SignalsAntwort wurde mit MRM-Übergang m / z 236.0> 189.0 erreicht. MRM-Übergang m / z 227,0> 90,0 wurde für die 3-NT-Quantifizierung aufgrund einer starken Interferenz mit dem intensivsten Übergang m / z 227.0> 181.0 ausgewählt. Die detaillierten MRM-Übergänge und zusammengesetzten Parameter sind in Tabelle 2 zusammengefasst .

Analyt MRM-Übergang (m / z) DP (V) EP (V) CE (eV) CXP (V)
3-NT (Quantifizierer) 227,0> 90,0 50 10 38 13
3-NT (Qualifikation) 227,0> 103,9 50 10 45 16
13 C 9 -NT (IS) 236,0> 189,0 50 10 21 14
Eine Ionenspritzspannung: 2200 V; Temperatur: 600ºC; Vorhanggas: 35; CAD-Gas: 9; Verneblergas (GS1): 50; Heizgas (GS2): 55.

Tabelle 2: Optimierte MRM-Bedingungen.

Die herkömmliche Säule des Typs C18, die üblicherweise für die LC-chromatographische Trennung von 3-NT in der Literatur 12 , 13 , 17 , 19 verwendet wird, erfordert typischerweise eine lange Umlaufzeit zur Verringerung der Interferenz, was sie für einen hohen Durchsatz nicht förderlich macht. In diesem Protokoll wurde eine PFP-Säule zur Optimierung der LC-chromatographischen Trennung von 3-NT verwendet, basierend auf ihrer verstärkten Retention der polaren Verbindungen 22 ,> 27 , 28 Die Konzentration von mobilen Phasenzusätzen hat einen wichtigen Einfluss auf die Signalintensität 25 , 28 . HCOOH bei 0,01% wurde als das optimale Additiv in MA gefunden, da es zu einer 2,5-fachen Signalverstärkung über 0,1% -Konzentration führte und weiter eine verminderte Konzentration reduzierte Signalantwort verringerte. Ein Gradienten-Elutionsprofil mit 0,01% HCOOH in Wasser (MA) und Methanol (MB) wurde mit einer Durchflussrate von 0,45 mL / min hergestellt, wobei eine optimale Trennung und schnelle Elution von 3-NT innerhalb von 3 min mit einer Gesamtlaufzeit von Nur 7 min, was eine deutlich schnellere Analyse von 3-NT in komplizierten biologischen Matrizen ermöglicht, wie in der Literatur 12 , 13 , 17 , 19 berichtet .

Um die Unwirksamkeit der herkömmlichen Umkehrphasen-Kartusche (C18-Typ) p zu adressierenRedominant für SPE von biologischen Proben 6 , 7 verwendet , haben wir vor kurzem eine LC-MS / MS-Methode entwickelt, um 3-NT im menschlichen Plasma durch SPE auf einer einzigen zweifach funktionellen 96-well MCX Platte 27 zu bestimmen, was zu Verbesserungen in SPE führte Effizienz und Selektivität. Allerdings ist ein deutlicher Nachteil aller SPE-Ansätze in der Literatur mühsame und risikoassoziierte Verdampfungs- und Rekonstitutionsschritte. Zusätzlich erforderte das Plasmaverfahren ein zusätzliches Vorwaschen der Extraktionsplatte, um eine Verunreinigung aus dem Sorptionsmittel zu eliminieren. In diesem Protokoll wurden diese Nachteile durch eine maßgeschneiderte SPE mit der Verwendung einer miniaturisierten 96-Well-Mikroplatte eliminiert. Die Auswahl der Elutionslösung war für die Extraktionseffizienz entscheidend. Erhebliche Störungen wurden in den Urinproben beobachtet durch die gemeinsame NH 4 OH Elutionslösung mit unterschiedlicher Zusammensetzung MeOH Anwendung. Es wurde vermutet, dass interferWurden aufgrund der starken Elutionskraft der methanolischen NH 4 OH-Elutionslösung mit dem Analyten co-eluiert, was folglich zu einer geringen Selektivität führte. Um die Selektivität zu verbessern, war es notwendig, eine Lösung zu identifizieren, die sowohl stark genug war, um 3-NT zu eluieren und schwach genug zu sein, um die Elution von interferierenden Verbindungen nicht zu verursachen. Nach eingehender Untersuchung von weniger basischen NH 4 OAc und bei unterschiedlichen pH - Konzentrationen wurde eine 25 mM NH 4 OAc - Lösung mit pH 9 als optimal als Elutionslösung gefunden. Mit der optimierten Elutionslösung wurde die Frage der interferierenden Verbindungen aufgelöst und im Vergleich zur regulären methanolischen NH 4 OH-Elutionslösung eine 40% ige Sensitivitätssteigerung erreicht.

Tabelle 3 enthält eine detaillierte Zusammenfassung der analytischen Leistungsfähigkeit dieses Protokolls 25 im Vergleich zu anderen verfügbaren Methoden zur Bestimmung des freien 3-NT in biologischen Matrizen. Dieses Protokoll von Viele deutliche Vorteile gegenüber bereits gemeldeten Assays. Zuerst wurde durch Verwendung der 96-Well-Extraktions-Mikroplatte ein einzelner Schritt zur Probenreinigung und Analytanreicherung erreicht, wobei die 1 bis 5 Zyklen der Verdampfung und Rekonstitution, die typischerweise bei den 3-NT-Verfahren mit SPE erforderlich sind, vermieden werden. Zweitens wurde der Lösemittelverbrauch pro Probe für SPE drastisch reduziert, von 5,5 - 118 ml auf nur 1,1 ml, was eine 5-107fache Reduktion der Lösungsmittel- und Abfallentsorgung darstellt. Drittens wurde die LC-Turnaround-Zeit pro Probe im Vergleich zu anderen Assays um das 2-7fache verringert und war um 30% schneller als unsere bisherige Plasma-Methode. Viertens wurde eine 10-3000fach niedrigere Menge des bevorzugten 13 C-markierten IS für die Kompensation des Matrixeffekts benötigt. Schließlich stellt dieser Assay eine signifikante Sensitivitätsverbesserung gegenüber anderen herkömmlichen SPE-basierten LC-MS / MS-Verfahren für die Quantifizierung von Harn-3-NT dar.

Wege "> Probenvorbereitung Analytisch
Methode
Matrix LOD (nM) LOQ (nM) LC-Lauf (min) Evap c Sol d (mL) IS (ng) Ref. SPE (C18)
+ Filtration LC-MS / MS Plasma 0,034 0,112 20 1 13 Analog f 2 [6] SPE
(MCX-Platte) LC-MS / MS Plasma 0,0088 0,022 10 1 5.6 13 C 9 -NT 0,25 [27] PPT + SPE (MCX) + der a HPLC-UV Serum NA b 100 40 1 7.3 NA b NA b [12] HPLC + der a GC-MS / MS Urin 0,004 0,125 NA b 5 NA b D 3 -NT 4.6 [16] PPT + SPE (Amino) + der a LC-MS / MS Katzenurin NA b 14.5 40 3 23 D 3 -NT 75 [17] PPT + Hydrolyse + SPE (SCX-C18) LC-MS / MS Urin (Protein) 400 N / A 50 2 118 D 3 -NT 2 [19] IA-2D LC e LC-MS / MS Urin 0,022 N / A 14 NA b NA b 13 C 9 -NT 0,85 [24] SPE (C18) + Hydrolyse HPLC-ECD Urin (gesamt) NA b 4 40 2 5.5 NA b NA b [13] SPE (C18) + Vorbereitung LC g
+ Online SPE LC-MS / MS Urin 0,0088 0,041 30 2 38 D 3 -NT 5 [23] SPE (MIP) HPLC-UV Spiked Urin 700 N / A 20 18 NA b NA b [14] SPE (MCX μElution) LC-MS / MS Urin 0,0088 0,044 7 NEIN 1.1 13 C 9 -NT 0,03 Diese Arbeit A der Derivatisierung; B NA: nicht verfügbar; C Evap: Verdunstung; D Sol: Lösungsmittel pro Probe; E IA-2D LC: Immunoaffinitätschromatographie und zweidimensionales LC; F Analog: o-Methyl-Tyrosin; G Prep LC: präparative HPLC-Reinigung.

Tabelle 3: CompariSohn der analytischen Leistung dieses Protokolls mit bestehenden Assays für den Nachweis von 3-NT in biologischen Matrizen

Die analytische und klinische Gültigkeit des vorgeschlagenen Assay wurde weiter für 25 von den authentischen Urinproben von 82 gesunden Menschen etabliert Harn 3-NT durch die Bestimmung des Referenzintervalles bewertet. Die verbesserte Einfachheit und Durchsatzmethode ermöglicht es, zwei Platten von Urinproben (n = 192) in einer 24-Stunden-Zeitspanne zu verarbeiten und zu analysieren. Die entwickelte Methode, die die nicht-invasive Urinprobenahme verwendet, die einfach, schnell, empfindlich und selektiv ist, wird voraussichtlich ein mächtiges Instrument zur Überprüfung der Rolle von 3-NT in klinischen Zuständen und zur weiteren Erforschung der Auswirkungen von oxidativem Stress sein. Die kritischen Schritte des Protokolls umfassen SPE auf einer MCX-Mikroplatte unter Verwendung eines milden NH4OAc als Elutionspuffer, LC-Trennung auf einer PFP-Säule mit 0,01% HCOOH als Additiv und MRM-Selektion für 3-NT-Quantitäten. Die künftige Anwendung des Verfahrens ist die Quantifizierung von 3-NT-Konzentrationen bei Patienten mit pathologischen Zuständen wie entzündlichen und neurodegenerativen Störungen usw. Die potentiellen Fallstricke des vorgeschlagenen Protokolls für klinische Anwendungen sind weiterhin zu lösen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Acknowledgments

Die Autoren würden Scott Howard und Abigail Marinack für die allgemeine Unterstützung und Koordination dieser Arbeit anerkennen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Nitro-L-tyrosine Sigma N7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 Sigma 652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine Golden West Biologicals MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µElution plate Waters 186001830BA
2 mL 96 well collection plate Phenomenex   AH0-7194
96 positive processor Waters  186005521
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol   Sigma 14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV water Sigma 14263-2L
Formic acid for mass spectrometry Sigma 94318-50ML-F
Ammonium hydroxide solution Sigma 338818-1L
Ultra PFP propyl columns Restek 9179362
5500 Triple quad AB Sciex  / Contact manufacture for more detail
UFLC-XR Shimadzu  / Contact manufacture for more detail
Integra 400 Plus  Roche / Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method
LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial Waters 600000751CV
LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial Waters 186000384C
5 mL transport tube Phenix TT-3205
50 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2263
15 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2266
eLine electronic pipette Sartorius 730391
Microfuge centrifuge  Beckman Coulter A46474
OHAUS balance   Kennedy Scales, inc. 735
Vortex mixer  Bernstead Thermolyne M16715

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References

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Integration von miniaturisierter Festphasenextraktion und LC-MS / MS-Nachweis von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen
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Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).More

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).

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