Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kvantificering af forgreningsdensitet i rotte mammary Gland Whole-mounts ved hjælp af Sholl analysemetoden

Published: July 12, 2017 doi: 10.3791/55789
Automatic Translation
1, 1
1National Toxicology Program Laboratory, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

Summary

Udvikling af mammakirtler i gnaveret er typisk blevet vurderet ved hjælp af beskrivende vurderinger eller ved at måle grundlæggende fysiske egenskaber. Forgreningsdensitet er en indikator for brystudvikling, der er vanskeligt at kvantificere objektivt. Denne protokol beskriver en pålidelig metode til kvantitativ vurdering af brystkirtelsforgreningsegenskaber.

Abstract

Et stigende antal undersøgelser udnytter gnaverbrystkirtlen som et slutpunkt til vurdering af den udviklingstoksicitet af en kemisk eksponering. Virkningerne disse eksponeringer har på udvikling af brystkirtlen evalueres typisk ved hjælp af enten basisdimensionelle målinger eller ved at score morfologiske egenskaber. Den brede vifte af metoder til tolkning af udviklingsmæssige ændringer kan dog føre til inkonsekvente oversættelser på tværs af laboratorier. En fælles vurderingsmetode er nødvendig, så der kan dannes ordentlige fortolkninger ud fra data sammenlignet på tværs af undersøgelser. Den foreliggende undersøgelse beskriver anvendelsen af ​​Sholl analysemetoden til at kvantificere brystkirtlen forgreningsegenskaber. Sholl-metoden blev oprindeligt udviklet til brug ved kvantificering af neuronale dendritiske mønstre. Ved hjælp af ImageJ, en softwarepakke til open source-billedanalyse og et plugin udviklet til denne analyse, forgreningsdensiteten i brystkirtlen og kompleksiteten af ​​amAmmerkirtlen fra en peripubertal hunrot blev bestemt. De metoder, der beskrives her, muliggør brugen af ​​Sholl-analysen som et effektivt redskab til kvantificering af et vigtigt kendetegn ved udvikling af brystkirtler.

Introduction

Mammekirtlen forgrening er en egenskab, der almindeligvis vurderes som en indikator for kirteludvikling, men det er svært at objektivt kvantificere. I 1953 beskrev Sholl 1 en metode til måling af neuronal dendritisk arborisering i katte visuelle og motoriske cortices, og et plugin til denne teknik blev udviklet af Ferriera et al. 2 . Da både neuroner og brystkirtler udviser en lignende trælignende struktur, blev plugin brugt til at kvantificere brystepithelialforgreningsdensiteter i 2D-billeder af peripubertal-rottebrystkirtlen. Peripubertaletrinnet blev udvalgt til analyse, fordi fravænning er et livsstadium, der ofte bedømmes i akademiske laboratorier og testretningslinjer. Sholl analysen er et plugin distribueret med FIJI, som er open source billedbehandling pakke ImageJ, med yderligere plugins inkluderet. Pluggen skaber en række koncentriske ringe, der omgiver en predefCenter (typisk soma af en neuron eller oprindelsen af ​​den primære kanal i en brystkirtle) og strækker sig ud til den fjerneste del af objektet (den omgivende radius). Det tæller derefter antallet af kryds (N), der forekommer på hver af ringene. Plugin'en returnerer også en Sholl-regressionskoefficient ( k ), som er en måling af hastigheden af ​​henfald af epithelialforgrening.

Ved hjælp af ImageJ er der skabt et skelettet billede af en brystkirtel helmontering, og brystepithelområdet (MEA) måles. Billedet analyseres ved hjælp af Sholl analyse plugin, og værdierne for N og k , blandt andre værdier, der ikke benyttes her, returneres. Mammary epithelial branching density bestemmes ved at beregne N / MEA. I hvilket omfang forgrening fortsætter i de yderste områder af kirtlenepitelet er forgrenings-kompleksiteten og er en indikator for ensartet distal epithelvækst. Da k er et mål for det distale fald i epithElial branching, er det et effektivt mål for forgreningskompleksiteten og en pålidelig indikator for brystudvikling.

Denne protokol beskriver en computerassisteret metode til at skabe skeletoniserede billeder af brystkirtler i hele mund og kvantitativt evaluerende brystforgreningsegenskaber hos peripubertal han- og hunrotter. Denne metode er forholdsvis hurtig og kræver ikke brug af specialiseret mikroskopi udstyr. Udvikling og validering af denne fremgangsmåde er beskrevet i Stanko et al. (2015) 3 . Denne rapport beskriver også forberedelse af rotte brystkirtler hele = mounts. Lignende helbredsfremgangsmåder for bryst er blevet beskrevet i de Assis et al. (2010) 4 og Plante et al. (2011) 5 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreanvendelser og procedurer til denne undersøgelse blev godkendt af NIEHS Laboratory Animal Care and Use Committee og udført i en Association for Assessment og Akkreditering af Laboratory Animal Care-akkrediterede facilitet.

1. punktafgift mammakirtler

  1. Mærk alle lysbilleder med en xylen-korrekt metode (blyant fungerer bedst). Dæk dem med monteringsløsning i enden for at bevare etiketten.
  2. Euthanize dyret ved en godkendt metode til institutionel dyresundhed og brugskomité.
  3. Efter eutanasi placeres dyret på ryggen på et dissekationskort ( figur 1 ). Stram og pin alle fire lemmer fast, med de bageste lemmer, der danner en omvendt V (holdepind eller småmåle nåle fungerer godt).
  4. Sprøj abdomen liberalt med 70% ethanol for at holde håret ud af brystprøven.
  5. Ved hjælp af pincet skal du trække op i maveskindet ved midterlinjen og lave et lille snit medDissekere saks, være forsigtig med ikke at punktere peritoneum.
    1. Begynd ved indsnittet skære huden op til nakkeområdet og derefter distalt til forbenet. Skær ned til inguinalområdet og derefter distalt til den første ledd af den bageste del på samme side; Dette snit adskiller sædvanligvis brystkirtler 5 og 6. Undgå at skære peritoneum.
    2. Træk huden tilbage med den vedhæftede brystfedtplade ved hjælp af tang og adskilles forsigtigt fra peritoneumet ved hjælp af den stumpede ende af dissekerende saks. Adskille så langt dorsalt som muligt fuldt eksponere 4 og 5. ingvinale mælkekirtler på undersiden af huden; Pin huden til dissekationskortet ( figur 2 ).
    3. Tag forsigtigt brystvæv af den femte kirtel med den afrundede side af buede tang og langsomt trim klangen væk fra huden, idet du er forsigtig med ikke at nippe kirtlen eller huden.
    4. Fortsæt med at trimme,bevæger dorsalt indtil 4 og 5. kirtler er blevet fuldstændig løftet fra huden. Sørg for, at nippelområdet er fjernet med resten af ​​kirtlen, da dette tjener som udgangspunkt for Sholl-analysen. Skær brystvævet væk fra kroppen, hvor det er fastgjort til kirtel 4.
  6. Når kirtlen er fjernet fra dyret, spred den jævnt på et elektrostatisk ladet, 25 mm x 75 mm x 1 mm mikroskopisk dias, med den side, der støder op til huden nedad.
    BEMÆRK: For kirtler fra ældre eller lakterende dyr kan der kræves en 51 x 75 x 1 mm glide.
  7. Mens du bærer handsker, skal du forsigtigt klemme ud luftbobler. Dæk kirtlen med en plastisk paraffinfilm og et andet mikroskopglas og komprimer kirtlen for at klæbe den til glideren.
    BEMÆRK: Et 50 ml konisk rør fyldt med vand tjener som en passende vægt. Den tid, der kræves for at klæbe til diaset, afhænger af tykkelsen af ​​kirtlen. Tynd, postnaTal dag (PND) 4 kirtler bør komprimeres i mindst 30 minutter, mens tykkere voksne kirtler kan kræve så meget som 2-5 timer.

2. Forbered Mammary Whole-Mounts

  1. Forbered carmin alunopløsningen mindst 24 timer i forvejen, da det kræver kogning og nedkøling.
    1. 1 g af carmin alun og 2,5 g aluminiumkaliumsulfat (AIK (SO4) 2 · 12H 2 O) i 500 ml destilleret vand og koges i 20 minutter i en 1-liters kolbe. Bring det endelige volumen til 500 ml ved anvendelse af destilleret vand.
    2. Filtrer opløsningen gennem filterpapir under vakuum og opbevares i køleskab.
      BEMÆRK: Carmine alum-opløsningen kan genbruges, men bør kasseres, når farven begynder at falme.
  2. Før fiksering skal du skille parafinfilmen ud af kirtlen, idet du er forsigtig med ikke at trække kirtlen ud af glideren. Placer diaset (r) i en glasholdningsfarve og dyp i fixativ (100% ethanOl, chloroform og iseddikesyre i forholdet 6: 3: 1) i 12-48 timer afhængigt af tykkelsen af ​​kirtlerne.
  3. Hæld fikseret og sug kirtlerne i 70% ethanol i 15 minutter. Gensidigt rehydrere kirtlerne ved at hælde 1/3 af ethanolopløsningen og erstatte den med destilleret vand. Soak i 5 min. Gentag denne proces tre gange.
  4. Efter den sidste skylning hældes alle ethanol / vandopløsningen ud og erstattes med 100% destilleret vand. Sug kirtlerne i 5 min.
  5. Hæld det destillerede vand ud og sænk kirtlerne i carmin alunopløsningen. Sæt kirtlerne i 12-24 timer afhængigt af tykkelsen.
    BEMÆRK: Kirtlerne kan ikke overfarves, men farvningstiden for flere satser bør være den samme, så farvningsintensiteten er den samme.
  6. Hæld karmin alunopløsningen og skyll kirtlerne i 100% destilleret vand i 30 s. Gradvis dehydrere kirtlerne ved at sænke dem i 70% ethanol i 15 minutter, 95% ethanol i 15 minutter, aNd 100% ethanol i 20 minutter.
  7. Ryd kirtlerne af fedt ved at dyppe dem i xylen i 12-72 timer afhængigt af tykkelsen.
    BEMÆRK: Kirtlerne skal være gennemsigtige (klare). Hvis der forekommer uigennemsigtige (hvidlige) områder, fortsæt blødning i xylen indtil gennemskinnelig. Hvis lakterende eller på anden måde meget tykke kirtler bliver farvet og ryddet, kan xylenet muligvis udskiftes en gang for fuldt ud at fjerne kirtlerne.
  8. Monter gliderne med et xylenbaseret monteringsmedium ved at pipettere tilstrækkeligt medium til kun at dække kirtlen. Tilsæt en dæksel, der sikrer, at der ikke dannes luftbobler.
  9. Lad gliderne tørre. Da monteringsmediet tørrer, vil det indgå under afdækningen, og det kan være nødvendigt at tilføje yderligere monteringsmedium. Når der ikke er brug for noget ekstra medium, skal slidene tørre helt. Dette kan tage 2-3 uger.
  10. Når gliderne er helt tørre, kan det resterende monteringsmedium fjernes med en vatpind og en lille mængde xylen. Pas på ikke at brugeFor meget xylen, da dette kan opløse monteringsmediet og løsne dækslet. Hvis dette sker, og luftbobler samles under dækslet, skal dækslet fjernes i xylen, og monteringsprocessen skal gentages.

3. Klargør helmonterede billeder til analyse

  1. Optag billeder af helmuffer ( Figur 3 ) ved hjælp af et makroskop eller dissekeringsmikroskop og et digitalkamera med den relevante software.
    BEMÆRK: Mens enhver forstørrelse, der fanger hele glandularepitelet, kan vælges, er det afgørende at indfange alle fuldmonterede billeder, som vil blive sammenlignet med hinanden ved samme forstørrelse.
  2. Download ImageJ software (eller FIJI software) 6 .
  3. Åbn det britiske helmonterede billede i ImageJ ved at klikke på "File" → "Open." Vælg Freehand-værktøjet og spore rundt på glandularepitelet. Vælg "Rediger" & #8594; "Clear Outside."
    1. Fjern lymfeknuderne ved at spore rundt knuden og bruge Freehand værktøjet og "Edit" → "Cut."
  4. Separat farvekanaler ved at vælge "Image" → "Color" → "Split Channels." Vælg kanalen med den bedste kontrast, typisk den blå kanal.
    BEMÆRK: Et RGB-billede består af en stak af de røde, grønne og blå komponenter i billedet. Denne handling adskiller disse komponenter i tre 8-bit gråtonebilleder.
  5. Træk baggrunden ved at vælge "Process" → "Træk baggrund." Vælg de ønskede parametre, og klik derefter på "Preview" for at få vist ændringerne.
    BEMÆRK: "Subtract Background" fjerner glatte, kontinuerlige baggrunde. Desuden kan "Process" → "Filtre" → "Unsharp Mask" bruges til at oprette kontrast.
  6. Vælg en af ​​th E følgende metoder til automatisk fjernelse af støj: despeckle eller fjerne outliers.
    BEMÆRK: ImageJ tilbyder en tredje metode til automatisk støjfjernelse: fjern NaNs. Kommandoen Fjern NaNs er imidlertid ikke anvendelig, da den bruger 32-bit billeder, og den nuværende metode bruger 8-bit billeder.
    1. Fjern støj ved hjælp af despeckle kommandoen ved at vælge "Process" → "Noise" → "Despeckle."
      BEMÆRK: Dette svarer til at tilføje et medianfilter, som erstatter hver pixel med medianværdien i dens 3 × 3 kvarter.
    2. Fjern støj ved hjælp af kommandoen Fjern eliminatorer ved at vælge "Process" → "Støj" → "Fjern udlæsere."
      BEMÆRK: Denne proces erstatter en pixel med medianen af ​​pixels i de umiddelbare omgivelser, hvis den afviger fra medianen med mere end en bestemt værdi (tærsklen).
  7. Fjern eventuelt resterende støj manuelt (Lass = "xfig"> Figur 4).
    1. Åbn en kopi af det originale billede og brug dette som vejledning til hvad der er, og hvad der ikke er støj. Klik på den dobbeltrøde pil knappen helt til højre på værktøjslinjen. Vælg tegneværktøjerne; Tegneværktøjerne vises nu i værktøjslinjen.
    2. Klik på Eraser-værktøjet. Juster viskelediameteren ved at højreklikke på værktøjsknappen Eraser. Hold venstre museknap for at slette støj.
      BEMÆRK: Kun en session med sletning kan fortrydes. Når den venstre museknap er frigivet og klikket igen, kan den tidligere sletning ikke fortrydes.
  8. Juster tærsklen ved at vælge "Image" → "Adjust" → "Threshold." Flyt skyderne for at justere minimumsværdierne (øverste skyder) og maksimumsværdierne (nederste skyderen), indtil der opnås en passende billede af kirtlen.
    BEMÆRK: Indstil tærskelværdisegmenterne gråtonebilleder til funktioner af interesse og baggrund.
    1. Klik på Anvend. Fjern eventuelt ekstra støj på dette tidspunkt ved at følge trin 3.6.1 og 3.6.2.
  9. Rekonstruere de dele af glandularepitelet, der blev fjernet ved tærskelværdier og fjernelse af støj ( figur 5 ).
    1. Gennemfør billedrekonstruktionen omhyggeligt og på et minimum for at opretholde integriteten af ​​det originale billede. Se det originale billede for en henvisning til hvad der er og hvad der ikke er epithelium.
    2. Klik på Spray Can-værktøjet (på værktøjslinjen med Tegneværktøjer). Juster spraydiameteren og hastigheden ved at højreklikke på Spray Can-værktøjsknappen. Udfyld forsigtigt manglende kirtler ved at klikke eller holde nede på venstre museknap.
  10. Opret et skeletformet billede af kirtlen til gennemførelse af Sholl Analysis. Sørg for, at det tærskede billede er binært ved at vælge "Process" → "Binary" → "Make B inary."
    1. Hvis billedet er hvidt på en sort baggrund, skal du vælge "Process" → "Binær" → "Valg" og afmarkere "Sort baggrund." Skeletoniser billedet ved at vælge "Process" → "Binary" → "Skeletonize."
      BEMÆRK: Dette gentages gentagne gange pixels fra kanterne af det binære billede, indtil det reduceres til en enkelt pixel bred form.
    2. Fortynd billedet en gang ved at vælge "Process" → "Binær" → "Dilere".
      BEMÆRK: Dette fylder huller skabt af tærskelværdier og skeletonisering ved at tilføje pixels til kanterne af det binære billede.
  11. Gem billedet ved at vælge "File" → "Save As". Vælg en billedtype (typisk jpeg), indtast filnavnet, og klik på "OK".
  12. Kontroller nøjagtigheden af ​​det skeletformede billede ved at overlejre det skeletbaserede billede til det originale billede (Ass = "xfig"> Figur 6).
    1. Lav et overlay ved at åbne både det originale billede og det skeletoniserede billede. Vælg "Image" → "Overlay" → "Tilføj billede". I dialogboksen "Tilføj billede" skal du vælge skeletbilledet fra rullemenuen "Billede til tilføjelse" og indstille opacitet ved 30%.
    2. Gem billedet af skeletbilledet overlejret på originalen ved at vælge "File" → "Save As". Vælg en billedtype, indtast filnavnet, og klik på "OK".

4. Gennemfør Sholl-analysen

  1. Åbn et skeletbillede og gør billedet binært ved at vælge "Process" → "Binært" → "Gør binært."
    1. Før du indstiller forstørrelsesskalaen, skal du måle antallet af pixels / mm ved hjælp af et mikrometer til forstørrelsen, hvor billederne blev taget.
    2. Indstil den målte forstørrelse sCale ved at vælge "Analyze" → "Set Scale." Indtast antal pixels / mm. Indstil "Kendt afstand" og "Pixel Aspect Ratio" til både 1. Indtast "mm" for "Unit of Length" og kontroller "Global" (vedligeholder samme skala for hvert billede).
  2. Bestem slutningsradiusen (omslutningsradius) for Sholl-analysen ved at tegne en linje fra starten af ​​den primære kanal (analysens centrum) til det mest distale punkt af glandularepitelet ( figur 7 ).
    1. Brug linjetegningsværktøjet i værktøjslinjen til at tegne en linje mellem de interessante steder. Tryk på "M" tasten for at foretage en måling og bemærk at et resultatvindue åbnes.
      BEMÆRK: Værdien i kolonnen "Længde" er længden af ​​linjen i mm. Denne værdi indtastes automatisk som slutlinien ved indstilling af Sholl-parametrene. Sholl-plugin'et bruger startpunktetAf linjen som centrum for de centriske ringe.
  3. Kører Sholl Analysen.
    1. Kør analysen ved at vælge "Plugins" "Advanced Sholl Analysis;" Et parametervindue vises.
    2. Indstil startradius i "I. Definition af skaller" til 0,00 mm; Længden af ​​linjen målt i trin 4.2 indtastes automatisk som "slutrute".
    3. Indstil "Radius Step Size" til 0,1 mm.
      BEMÆRK: Radiestegstørrelsen bestemmer antallet af ringe (effektivt antallet af iterationer); En mindre trinstørrelse vil øge antallet af ringe, mens en større trinstørrelse reducerer antallet af ringe. Radien kan ikke indstilles for lille, selvom en for lille radius vil resultere i et unødigt stort antal ringe. Det kan imidlertid indstilles for stort, hvilket vil skabe færre ringe og efterfølgende undervurdere det ægte antal kryds. Se Stanko et al.(2015) for yderligere information om bestemmelse af trinstørrelse.
    4. Indstil "# Prøver" til 1 og "Integration" til "Mean" i "II. Flere prøver pr. Radius."
    5. Indstil "Afslutningsradiusafbrydelse" til 1 og kontroller "Afled fra startradius" for "# Primære grene" i "III. Beskrivelser og kurvemontering."
      BEMÆRK: "Tilpas profil og beregningsbeskrivelser" og "Vis monteringsdetaljer" kan kontrolleres som ønsket.
    6. Check "Linear" og vælg "Best fit degree" i "Profiler uden normalisering;" Check "mest informative." Vælg "Område for normaliserede profiler" i "IV. Sholl-metoder".
    7. Check "Create Intersections Mask" i "V. Output Options" for at oprette et varmekort af krydsene (valgfrit).
    8. Klik på "Se segmentering" for at generere et preview-vindue på billedet med ringe for at bekræfte områdetAf analyse.
  4. Klik på "OK" for at køre analysen.

5. Måling af MEA

  1. Mål MEA ved at spore den korteste afstand omkring epiteletræet ( figur 8 ).
    1. I ImageJ med skeletbilledet af kirtlen åbent, klik på polygonværktøjet. Klik på et punkt på epithelantræets omkreds for at begynde polygonen, bevæg rundt om kirtlen og klik for at tilføje et linjesegment.
    2. Når hele epitelområdet er omgået, dobbeltklik for at lukke polygonen. Tryk på "M" -tasten for at åbne et resultatvindue; Værdien i kolonnen "Område" er MEA.
  2. I tilfælde, hvor glandularepitelet har forlænget ud over lymfeknudepunktet, trækker lymfeknudeområdet (LNA) fra MEA, når der beregnes forgreningsdensitet.
    1. Mål LNA ved at spore lymfeknudepunktet i samme mandEr som epithelialet og trykke på "M."
      BEMÆRK: LNA'en skal trækkes fra MEA i disse tilfælde, fordi lymfeknude forhindrer analysen fra at tælle kryds i LNA'et. Når epitelet ikke har nået lymfeknudepunktet, er LNA nul.

6. Rapporteringsdata

  1. Rapportværdier for den omgivende radius, MEA, N, K og forgreningsdensitet.
    BEMÆRK: Den omgivende radius bestemmes i trin 4.2, og MEA bestemmes i trin 5.1.
    1. Kør analysen for at generere et Sholl-resultatvindue.
      BEMÆRK: Den rapporterede N er værdien for summen inters. Den rapporterede k er værdien for Sholl-regressionskoefficienten (semi-log). Sholl-analysen vil returnere en værdi for k over en hvilken som helst målt region af kirtlet epithelium. For at opnå en nøjagtig værdi for k over hele epitelet skal dualeenderne være til stede.
    2. Ændr thE Sholl analyse for brystkirtlen ved at bruge outputværdien for N til at beregne forgreningsdensiteten (den grundlæggende endepunkt for denne metode). Beregn forgreningsdensiteten ved hjælp af formlen N / (MEA-LNA) og angiv værdien som N / mm 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Værdierne for den målte lukkede radius, MEA, N, k og beregnet forgreningsdensitet for brystkirtlen analyseret i denne protokol er angivet i tabel 1 . Sholl analysen genererer lineære og semi-log plots af antallet af krydsninger i hver radius ( Figur 9 ) og, hvis valgt, et varmekort af krydsene ( Figur 10 ). Mindre udviklede kirtler udviser færre krydsninger inden for samme MEA og har derfor en lavere forgreningsdensitet. En veludviklet kirtle vil fortsætte med at gren ensartet gennem hele kirtlet epitel, især i distale regioner. Omfanget af forgreningen fortsætter i disse regioner kan beskrives som forgreningskompleksitet, og fald i kompleksitet overføres som en forfaldshastighed (eller Sholl-regressionskoefficient, k ). Nedfaldshastigheden afspejler ændringen i distal epithelialbhNching og måles som hældningen af ​​linjen for antallet af krydsninger, der er tegnet mod den indesluttende radius ( dvs. epithelets langsgående vækst). Således beregnes Sholl regressionskoefficienten ved at tage hældningen af ​​linjens linie (N / S) mod den radiale afstand (r), hvor log (N / S) = - k r + m, hvor N er Antallet af krydsninger for hver ring af radius r og område S (πr 2 ), og m er aflytningen. Fordi hældningen - k beskriver henfaldet af skæringerne, en værdi på - ville k = 0 indikerer nul henfald og ensartet forgrening fra midten af analysen til kanten af epitelet. I tyndt udviklede kirtler er forgreningsforfald øget; Der er færre kryds i det distale område af epiteletræet; Og hældningen, k , øges. Derfor er værdier for k, der nærmer sig 0, indikative for større distal forgrening ( dvs. forgreningskompleksitet) og en brønd-udviklet brystkirtlen.

figur 1
Figur 1: Ventral visning. Billede af den ventrale del af en voksen kvindelig Sprague Dawley rotte, der illustrerer, hvordan man sikrer rotten på dissekeringsfladen og placeringen af ​​de 12 brystkirtler, hvor brystvinklerne cirkler. * Kirtlerne på kirtlerne 6 og 7 er ikke synlige. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Female Rat Mammary Gland. Illustration af eksponerede brystkirtler 4 (MG4) og 5 (MG5), med huden fastgjort til dissekeringsfladen over MG4 og lige under MG5. Kirtlerne skal fjernes fra sk I begyndelsen med MG5 og fortsætter op og dorsalt indtil MG5 og 4 er helt fjernet. Brystvorten er i det distale område af kirtlen 4, og der skal udvises forsigtighed for at indsamle dette område. Lymfeknudepunktet er angivet som reference. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Mammary Gland Whole-mount. Et helmonteret billede af en brystkirtle indsamlet fra en postnatal dag 25 Sprague Dawley rotte fra hun. Skalbjælke = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

.jpg "/>
Figur 4: Fjernelse af støj. Den blå farvekanal af et brysthovedfontsbillede med baggrunden subtraheret. ( A ) demonstrerer eksempler med støj. Pilene angiver støj, der er skabt af blodkar, og den mere stærkt skyggede region omkring de endelige ender er et eksempel på støj, der er skabt ved at subtrahere baggrunden. ( B ) illustrerer billedet efter at støj er blevet fjernet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5
Figur 5: Billedgenopbygning. Rekonstruktion af de slettede dele af det tærskede billede. ( A ) De røde pile indikerer områder, hvor dele af billedet var tabt på grund af tærskelværdier. Image reconstRuktion bør udføres i disse regioner. ( B ) Mammalbillede efter rekonstruktion af de slettede områder. Image rekonstruktion bør udføres omhyggeligt og på minimal basis for at opretholde integriteten af ​​det originale billede. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6
Figur 6: Overlejring af et skeletoniseret billede. Overlejringsbillede, der viser et skeletformet billede, der er lagt på det originale helmonterede billede. Dette billede viser, at den skeletformede kirtel afspejler forgreningen af ​​selve kirtel med en høj grad af nøjagtighed. Klik her for at se en større version af denne figur.


Figur 7: Omslutningsradius. Skeletoniseret billede af en brystfuld helbøjle, der viser, hvor den omgivende radius måles (gul). Linjen skal begynde ved bunden af ​​epithelietræet (analysens centrum) og strække sig til epithelets fjerneste punkt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8
Figur 8: Mammary Epithelial Area. Skeletoniseret billede, der viser en polygon sporet omkring epithelialet for at bestemme MEA. Klik her for at se en større verSion af denne figur.

Figur 9
Figur 9: Sholl Plot Output. Sholl output af lineære ( A ) og semi-log ( B ) plots af antallet af krydsninger ved hver radial inkrement. Den røde prik i panelet (A) er abscissen af ​​centroid (geometrisk center). I panel (B), den blå linje er den lineære regression over hele spektret af data, mens den røde linje er den lineære regression over 10 th -90 percentilen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 10
Figur 10: Intersections Mask. Når "Create InterSektionen Mask "er valgt (trin 4.3.7), vil analysen udgive et varmekort over antallet af krydsninger på tværs af billedets omslutningsradius. Dette varmekort afspejler tætheden af ​​forgreningskryds gennem epitelet (rød = hot = Høj densitet, blå = kold = lav densitet). Hele epitelet ville være den samme farve i et varmekort af et billede, hvor k = 0. Klik her for at se en større version af denne figur.

</ Table>

Tabel 1: Shollanalyseparametre. Værdierne er de rapporterede data for Sholl-analysen. Tilslutningsradius (trin 4.2) og MEA (trin 5.1) måles værdier, N og k er Sholl analyseresultater og returneres i vinduet Sholl analyseresultater (trin 6.1.), Og forgreningsdensiteten beregnes ved hjælp af formlen N / MEA-LNA) (trin 6.1.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fra fødslen til puberteten er brystkirtlen vækst allometrisk. Efter pubertet udvikler brystkirtlen gennem omfattende duktal forgrening og forlængelse, som fortsætter indtil brystepitelet optager hele fedtpuden. Forgreningsegenskaber er et vigtigt aspekt ved udviklingen af ​​brystkirtlen, og evnen til objektivt at kvantificere disse egenskaber kan være yderst nyttig til vurdering af normal brystudvikling og til at identificere unormal udvikling efter tidlig livseksponering for brystgiftige stoffer.

Scoring af morfologiske egenskaber, kvantificering af basisdimensionelle målinger og tælling af bryststrukturer er typiske metoder til evaluering af brystkirtlenudvikling. Disse metoder er imidlertid ikke særlig følsomme på grund af den betydelige variation i størrelse og form af gnaverkirtler og udviklingstolkning kan være vanskelig for en uerfaret evaluator. Desuden er potentialet forBias eksisterer i studier, der ikke er blinde korrekt. Sholl analysemetoden tilvejebringer en effektiv protokol til nøjagtigt kvantificering af bryst epithelial forgreningsdensitet og forgreningskompleksitet, diskrete morfologiske egenskaber ved udvikling af brystkirtler, der let kan sammenlignes i tværs af undersøgelser og laboratorier.

Der er kritiske trin i flere afsnit af denne protokol. Den første og vigtigste vedrører tilstanden af ​​brystkirtlen helmonteret. Nøjagtigheden af ​​denne metode er baseret på en brystkirtle, der er opsamlet helt intakt, monteret uden defekter, korrekt fastgjort og farvet, og viser ingen oxidation af kirtlen eller signifikant misfarvning af monteringsmediet. Hvis kirtlen er revet eller foldet, kan der ikke opnås en præcis måling af forgreningsdensiteten. Hvis de duale ender ikke er til stede, vil værdien for k ikke være repræsentativ for hele kæden. Tærskelværdien vil være vanskelig i kirtlerSom ikke er fuldstændig fikseret på grund af manglende farveskontrast i ductalepitelet. Og endelig, hvis oxidation eller misfarvning er til stede, kunne disse pletter forhindre analysen i at måle kryds i det berørte område.

Når der er udarbejdet egnede helmounts, er det næste kritiske trin at fange billederne med samme forstørrelse. Det er almindeligt at optage digitale billeder med den højeste opløsning muligt. Men for Sholl-analysen er det vigtigere, at alle billeder optages i samme forstørrelse. Som beskrevet i Stanko et al. (2015) 3 blev der fundet en advarsel, hvor billeder af mindre kirtler fanget ved høj forstørrelse udviser større forgreningsdensiteter end billeder af større kirtler fanget ved en lavere forstørrelse, selv om de visuelt syntes at være mindre udviklede. Vi antog, at den højere forstørrelse resulterede mere i detaljer, som blev overført til tHan skeletoniserede billede og resulterede i en højere N, som overrepræsenterede forgreningsdensiteten af ​​de mindre kirtler. Dette problem lindres ved at fange alle billeder med samme forstørrelse.

Mens grundlaget for en nøjagtig analyse ligger inden for hele mounten, ligger det største potentiale for brugerpåvirkede ændringer i skæringsdata inden for trinene for støjfjernelse. Alle billeder indeholder støj, til en vis grad på grund af farvningsintensitet, ikke-relevante fysiologiske enheder ( fx blodkar) og artefakter af tærskelværdier. Hvert billede skal adresseres uafhængigt på grund af variationer i mængden af ​​støj mellem billeder. Der skal udvises forsigtighed for ikke at fjerne for lidt eller for meget støj, da dette kan skæve antallet af kryds og dermed forgreningsdensiteten. Hvorvidt støj påvirker fortolkningen er imidlertid ikke undersøgt. Brugeren bør bestemme, hvor omhyggeligt det er at fjerne støj og også udøve konsistensTålmodighed for at opretholde billedernes integritet. Det anbefales stærkt, at brugeren blindes til behandling, når der udføres støjfejl, da dette minimerer potentialet for bias. Støjfjernelse er beskrevet detaljeret i ImageJ Brugervejledning 7 . I denne procedure fjernes støj primært fra det baggrundsfortrukne billede. Endvidere kan tærskelprocessen selv fjerne segmenter af kirtlen. Portioner af kirtlen, hvor kun få punkter er fjernet, rekonstrueres automatisk, når det skeletformede billede er dilateret. Dog kan ekspansive huller kræve manuel genopbygning. Brugeren skal beslutte om og i hvilket omfang at rekonstruere disse segmenter igen og opretholde integriteten af ​​de originale billeder.

Selv om dette ikke er kritisk, er det vigtigt at opretholde softwareopdateringer, da ImageJ-software opdateres ofte. De her beskrevne metoder er baseret på version 1.48v. FIJI og Sholl aNalysis plugin opdateres også regelmæssigt, og protokollen beskrevet her er baseret på v3.4.1. Ændringer foretaget i senere versioner af både ImageJ og Sholl Analysis plugin kan påvirke disse metoder. ImageJ kontrollerer automatisk opdateringer, men opdateringer til FIJI skal udføres regelmæssigt, og ændringer mellem de nuværende versioner og dem, der benyttes her, skal behandles efter behov. Alle parametre er defineret i underpositioner på Sholl Analysis websiden 6 . Parameterindstillingerne i denne procedure er baseret på billeder taget fra brystkirtler i hele laboratoriet og er ikke absolutte. Hele-mount forberedelse varierer fra lab til lab, og disse parametre kan justeres tilsvarende for at optimere billeder og output.

Den fulde brystkirtler anvendt i denne undersøgelse var fra en kvindelig Sprague Dawley-rotte ved PND 25, og metoden blev anvendt hensigtsmæssigt og uden begrænsninger. Hos rotter er brystepiteldensiteten inkReagerer med alderen til et punkt, hvor det forhindrer at tærskle billedet med høj nok opløsning til at skabe et nøjagtigt skelettet billede af kirtlen. Derfor anbefaler vi i øjeblikket ikke at bruge denne metode på kirtler fra rotter ældre end PND40. Skønt rottestammen er angivet her, er det irrelevant, da forfatterne ikke i øjeblikket er opmærksomme på nogen stamme-specifikke brysttræk, der ville forhindre brugen af ​​denne metode. Desuden kan den anvendte fremgangsmåde også anvendes til brystkirtlerne hos hanrotter, medens den ovenfor beskrevne fremgangsmåde blev udført under anvendelse af en hunrotter. Denne ansøgning er også blevet anvendt effektivt med fuldmuder af mus (Deirdre Tucker, personlig kommunikation) og bør være egnet til mus af enhver alder, da brystkirtler hos mus ikke vokser så tætte som hos rotter. Der er dog to begrænsninger med brugen af ​​denne applikation i mus: 1) der kan være for få forgreninger i yngre mus for at opdage signifikante forskelle og 2) denne metode kan ikkeT anvendes på hanmus, da de ikke udviser brystepitel. Uanset hvad er denne automatiserede metode hurtigere, upartisk og meget mindre arbejdskrævende end at tælle forgreningskryds manuelt.

Det er muligt, at efterforskere måtte ønske at udnytte brystkirtlen til andre eksperimentelle teknikker, såsom udskillelse af unormale strukturer eller immunhistokemi (IHC). Selvom Tucker et al. (2016) har beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af en hæmatoxylin-eosin-farvet sektion fra en muse-brystkirtel helmontering, 8 vi overvejer typisk at skabe en helmontering som en terminal proces og kender ikke metoder til anvendelse af en hel- Monteret brystkirtlen til yderligere følsomme analyser, såsom IHC- eller TUNEL-assays. Hvor følsomme analyser, der anvender brystkirtlevæv, kræves i forbindelse med helmounts, anbefales det at anvende de kontralaterale brystkirtler.

Brystkirtlen fortsætter tO være omdrejningspunktet i et stigende antal undersøgelser, men forskelle på tværs af laboratorier findes i både fuldmonteret forberedelse 9 , 10 , 11 , 12 og udviklingsvurderinger 13 , 14 , 15 . Modifikationen af ​​Sholl-analysen beskrevet her tilvejebringer en standardiseret fremgangsmåde til objektiv kvantificering af forgreningsdensitet, et vigtigt kendetegn ved udvikling af brystkirtler i gnaverkirtlen. Denne metode kan anvendes på brysthuler af enten mandlige eller kvindelige gnavere, og selvom det for øjeblikket anbefales til anvendelse i kun tidlige postnatale til peripubertalkirtler fra rotter, kan den anvendes på brystkirtler fra mus i alle aldre. Ansøgningen er særlig egnet til brystkirtler indsamlet fra peripubertal gnavere, da denne periode er en anbefaletEndepunkt for brystmontering i beredskabsstudier. Optimering af denne metode til brug i de tættere brystkirtler hos voksne rotter vurderes for øjeblikket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) for hans hjælp til validering af denne metode og Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canada) for hans løbende Hjælp til Sholl ansøgningen.

Materials

Indkapslingsradius (mm) MEA (mm2) N k Forgreningsdensitet (N / mm2)
7.4 71,7 2381 0,73 33,2
Name Company Catalog Number Comments
Dissecting board NA NA A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins Daigger EF7419A
Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors Fine Science Tools 14569-09
Straight dissecing scissors Fine Science Tools 14568-09
Curved forceps Fine Science Tools 11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001 Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm Fisher scientific 12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher scientific 13-374-12
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)  Sigma-Aldrich 24102
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Carmine alum  Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate  Sigma-Aldrich A6435
Permount mounting media Fisher Scientific SP15
Macroscope Leica Z16 APO  This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera Leica DFC295
Camera software Leica Leica Application Suite v3.1 
ImageJ software Open source http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis  Open source http://imagej.net/Sholl_Analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
  2. Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
  3. Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
  4. Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
  5. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
  6. Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from: http://imagej.net/Sholl_Analysis (2012).
  7. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012).
  8. Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
  9. Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
  10. Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
  11. Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
  12. Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
  13. Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
  14. Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
  15. Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 125 mammakirtel Sholl analyse reproduktiv helmontering toksikologi rotte model
Kvantificering af forgreningsdensitet i rotte mammary Gland Whole-mounts ved hjælp af Sholl analysemetoden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stanko, J. P., Fenton, S. E.… More

Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter