Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kvantifiering av förgreningsdensitet i råtta Mammary Gland Whole-mounts med hjälp av Sholl analysmetoden

Published: July 12, 2017 doi: 10.3791/55789
Automatic Translation
1, 1
1National Toxicology Program Laboratory, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

Summary

Utveckling av mamma-körteln i gnagaren har typiskt utvärderats med hjälp av beskrivande bedömningar eller genom mätning av grundläggande fysiska egenskaper. Förgreningstäthet är en indikator på bröstutveckling som är svår att kvantifiera objektivt. Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för kvantitativ bedömning av förgreningsegenskaper hos bröstkörteln.

Abstract

Ett ökande antal studier använder sig av gnagarkörteln som en slutpunkt för att bedöma utvecklingstoxiciteten hos en kemisk exponering. Effekterna av dessa exponeringar har på utvecklingen av bröstkörteln utvärderas typiskt med antingen grundläggande dimensionella mätningar eller genom att poängtera morfologiska egenskaper. Det breda utbudet av metoder för tolkning av utvecklingsförändringar kan emellertid leda till inkonsekventa översättningar över laboratorier. En gemensam bedömningsmetod är nödvändig så att rätt tolkningar kan bildas av data som jämförs mellan studier. Den föreliggande studien beskriver tillämpningen av Sholl analysmetoden för att kvantifiera bröstkörtelförgreningsegenskaper. Sholl-metoden var ursprungligen utvecklad för användning vid kvantifiering av neuronala dendritiska mönster. Genom att använda ImageJ, ett mjukvarupaket med öppen källkodsanalys och ett plugin utvecklat för denna analys, bröstkörtelns förgreningstäthet och komplexiteten hosAmmary körtel från en peripubertal kvinnlig råtta bestämdes. Metoderna som beskrivs här gör det möjligt att använda Sholl-analysen som ett effektivt verktyg för att kvantifiera en viktig egenskap hos utvecklingen av bröstkörteln.

Introduction

Mammarförgrening är en egenskap som vanligtvis bedöms som en indikator på körtelutveckling, men det är svårt att objektivt kvantifiera. 1953 beskrev Sholl 1 en metod för att mäta neuronal dendritisk arborisering i kattens visuella och motoriska cortices och en plugin för denna teknik utvecklades av Ferriera et al. 2 . Eftersom båda neuronerna och bröstkörtlarna uppvisar en liknande trädliknande struktur användes plugin för att kvantifiera bröst-epithelialförgreningsdensiteter i 2D-bilder av peripubertal-råtta-bröstkörteln. Peripubertalstadiet valdes för analys, eftersom avvänjning är ett livsstadium som ofta utvärderas i akademiska laboratorier och provrincipstudier. Sholl-analysen är ett plugin som distribueras med FIJI, vilket är bildkällan ImageJ med öppen källkod, med ytterligare plugins inkluderade. Pluggen skapar en serie koncentriska ringar som omger en predefInent-centret (typiskt soma av en neuron eller ursprunget till den primära kanalen hos en muggkörtel) och sträcker sig ut till den distala delen av föremålet (den inneslutande radien). Det räknar sedan antalet korsningar (N) som uppstår på var och en av ringarna. Pluggen returnerar också en Sholl-regressionskoefficient ( k ), som är en mätning av graden av förfall av epithelialförgrening.

Med hjälp av ImageJ skapas en skelettiserad bild av ett bröstkörtel helmonterat och mageepitelområdet (MEA) mäts. Bilden analyseras med hjälp av Sholl analys plugin, och värden för N och k , bland andra värden som inte används här, returneras. Mammary epithelial branching density bestäms genom att beräkna N / MEA. I vilken utsträckning förgrening fortsätter i de yttre områdena av klyftepitelet är förgreningskomplexiteten och är en indikator på enhetlig distal epithelialväxt. Eftersom k är ett mått på den distala minskningen i epitElial branching, det är ett effektivt mått på förgreningskomplexiteten och en pålitlig indikator på bröstutveckling.

Detta protokoll beskriver en datorassisterad metod för att skapa skelettbildade bilder av bröstkorgs helmounts och kvantitativt utvärderande bröstförgreningsegenskaper hos peripubertal han- och honrotter. Denna metod är relativt snabb och kräver inte användning av specialiserad mikroskopiutrustning. Utveckling och validering av denna metod beskrivs i Stanko et al. (2015) 3 . I denna rapport beskrivs också beredning av råttkörtelkirtlet hela = fästen. Liknande förfaranden för fullständig montering av bröst har beskrivits i de Assis et al. (2010) 4 och Plante et al. (2011) 5 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All djuranvändning och förfaranden för denna studie godkändes av NIEHS Laboratory Animal Care and Use Committee och genomfördes i en Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care-ackrediterade anläggningar.

1. Excise Mammary Glands

  1. Förmarkera alla diabilder med hjälp av en xylentäker metod (penna fungerar bäst). Täck dem med monteringslösning i slutet för att bevara etiketten.
  2. Euthanize djuret genom en godkänd metod för institutionell djurvård och användningskommitté.
  3. Efter eutanasi, placera djuret på ryggen på ett dissektionsbord ( Figur 1 ). Stryk och stift ner alla fyra extremiteterna, med bakre benen som bildar en inverterad V (hållspinnar eller småmått nålar fungerar bra).
  4. Spruta buken liberalt med 70% etanol för att hålla håret ur bröstprovet.
  5. Använd pincett, dra upp bukhudet i mittlinjen och gör ett litet snitt medDissekera sax, var försiktig med att inte punktera bukhinnan.
    1. Börja vid snittet, skär huden upp till nackområdet och sedan distalt till frambenet. Klipp ner till inguinalområdet och sedan distalt till den första delen av bakbenet på samma sida; Detta snitt skiljer vanligtvis bröstkörtlarna 5 och 6. Undvik att skära bukhinnan.
    2. Dra tillbaka huden med den bifogade bröstfettkudden med hjälp av tångar, försiktigt separera den från bukhinnan med hjälp av den sneda änden av dissekerande sax. Separera så långt dorsalt som möjligt för att fullt ut exponera den 4: e och 5: e ingående bröstkörtlarna på undersidan av huden; Peka huden på dissektavlan ( figur 2 ).
    3. Ta försiktigt bröstvätskan i 5: e körteln med den avrundade sidan av krökta tångar och sakta klippa körteln bort från huden, var försiktig så att du inte nickar körteln eller huden.
    4. Fortsätt att trimma,Flyttar dorsalt tills den fjärde och femte körtlarna har lyfts fullständigt från huden. Se till att nippelregionen avlägsnas med resten av körteln, eftersom detta är utgångspunkten för Sholl-analysen. Skär bröstvävnaden bort från kroppen där den är fäst vid körteln 4.
  6. När körteln har tagits bort från djuret sprids den jämnt på en elektrostatiskt laddad 25 mm x 75 mm x 1 mm mikroskopisk glid, med sidan som var intill huden vänd nedåt.
    OBS: För körtlar från äldre eller ammande djur kan en 51 x 75 x 1 mm glid bli nödvändig.
  7. Medan du bär handskar, tryck försiktigt ut några luftbubblor. Täck körteln med en plastparaffinfilm och ett annat mikroskopglas och komprimera körteln för att klistra fast den på bilden.
    OBS! Ett 50 ml koniskt rör fyllt med vatten tjänar som en lämplig vikt. Mängden tid som krävs för att hålla fast vid glidbanan beror på käftens tjocklek. Tunn, postnaTal dag (PND) 4 körtlar bör komprimeras i minst 30 min, medan tjockare vuxna körtlar kan kräva så mycket som 2-5 h.

2. Förbered Mammary Whole-Mounts

  1. Förbered karmin alunlösningen minst 24 timmar i förväg, eftersom det kräver kokning och kylning.
    1. Lös 1 g karmin alun och 2,5 g aluminium kaliumsulfat (AlK (SO 4 ) 2 · 12H 2 O) i 500 ml destillerat vatten och koka i 20 minuter i en 1-L kolv. Ta slutvolymen till 500 ml med destillerat vatten.
    2. Filtrera lösningen genom filterpapper under vakuum och kyl till förvaring.
      OBS: Carmine alum-lösningen kan återanvändas men bör kasseras när färgen börjar blekna.
  2. Före fixering, avlägsna paraffinfilmen från körteln, var försiktig så att du inte tar bort körteln från gliden. Placera diabilden / glaserna i en glasdjursburk och fördjupa i fixativ (100% etanOl, kloroform och isättika i ett förhållande 6: 3: 1) i 12-48 h beroende på tjockleken på körtlarna.
  3. Häll av fixativet och blöt körtlarna i 70% etanol i 15 minuter. Rehydrera körtlarna gradvis genom att hälla ut 1/3 av etanollösningen och ersätta den med destillerat vatten. Blötlägg i 5 min. Upprepa denna process tre gånger.
  4. Efter slutsköljningen, häll av all etanol / vattenlösning och byt ut det med 100% destillerat vatten. Blöt körtlarna i 5 min.
  5. Häll av det destillerade vattnet och fördjupa körtlarna i karmin alunlösningen. Stänk körtlarna i 12-24 h, beroende på tjockleken.
    OBS: Körtlarna kan inte vara överfärgade, men färgningstiden för flera satser bör vara densamma, så att färgningsintensiteten är densamma.
  6. Häll av kokain alunlösningen och skölj körtlarna i 100% destillerat vatten i 30 s. Gradvis dehydrera körtlarna genom att suga dem i 70% etanol under 15 minuter, 95% etanol i 15 minuter, aNd 100% etanol i 20 min.
  7. Rensa körtlarna av fett genom att blötlägga dem i xylen i 12-72 timmar beroende på tjockleken.
    OBS: Körtlarna ska vara genomskinliga (klara). Om några ogenomträngliga (vita) områden kvarstår fortsätt blötläggning i xylen tills det är genomskinligt. Om mjölkande eller på annat sätt mycket tjocka körtlar färgas och rensas, kan xylen behöva bytas ut en gång för att fullständigt rensa körtlarna.
  8. Montera glidbanorna med ett xylenbaserat monteringsmedium genom att pipettera tillräckligt med medium för att bara täcka körteln. Lägg till en täckglas, så att inga luftbubblor bildas.
  9. Låt bilderna torka. När monteringsmediet torkar, kommer det att träffas under täckglaset, och det kan bli nödvändigt att lägga till ytterligare monteringsmedium. När det inte behövs något extra medium, låt glidarna torka helt. Det kan ta 2-3 veckor.
  10. När glidarna är helt torra kan eventuellt kvarvarande monteringsmedium avlägsnas med en bomullspinne och en liten mängd xylen. Var försiktig så att du inte använderFör mycket xylen, eftersom detta kan lösa upp monteringsmediet och lossa täckglaset. Om detta händer och luftbubblor samlas in under täckglaset, ska täckglaset tas bort i xylen och monteringsprocessen bör upprepas.

3. Förbered hela bilder för analys

  1. Fånga bilder på helmonteringar ( Figur 3 ) med hjälp av ett makroskop eller dissekeringsmikroskop och en digitalkamera med lämplig programvara.
    OBS! Medan en förstoring som tar upp hela glandularepitelet kan väljas är det absolut nödvändigt att fånga alla helmonterade bilder som kommer att jämföras med varandra vid samma förstoring.
  2. Hämta ImageJ-programvara (eller FIJI-programvara) 6 .
  3. Öppna bildskärmen för bröstmjölk i ImageJ genom att klicka på "File" → "Open." Välj Freehand-verktyget och spåra runt glandulärt epitel. Välj "Redigera" & #8594; "Rensa utanför."
    1. Ta bort lymfkörtlarna genom att spåra runt noden och använda Freehand-verktyget och "Edit" → "Cut."
  4. Separera färgkanalerna genom att välja "Bild" → "Färg" → "Dela kanaler". Välj kanalen med den bästa kontrasten, vanligtvis den blå kanalen.
    OBS! En RGB-bild består av en stapel av de röda, gröna och blåa komponenterna i den bilden. Denna åtgärd separerar dessa komponenter i tre 8-bitars gråskalebilder.
  5. Subtrahera bakgrunden genom att välja "Process" → "Subtrahera bakgrund." Välj önskade parametrar och klicka sedan på "Förhandsgranska" för att förhandsgranska ändringarna.
    OBS: "Subtrahera bakgrund" tar bort smidiga, kontinuerliga bakgrunder. Dessutom kan "Process" → "Filters" → "Unsharp Mask" användas för att skapa kontrast.
  6. Välj en av th E Följande metoder för att automatiskt ta bort ljud: despeckle eller ta bort avvikare.
    OBS! ImageJ erbjuder en tredje metod för automatisk brusavlägsnande: ta bort NaNs. Kommandot Ta bort NaNs är dock inte tillämpligt eftersom det använder 32-bitars bilder, och den nuvarande metoden använder 8-bitars bilder.
    1. Ta bort ljud med kommandot despeckle genom att välja "Process" → "Noise" → "Despeckle."
      OBS! Detta motsvarar att du lägger till ett medianfilter, som ersätter varje pixel med medianvärdet i dess 3 × 3 grannskap.
    2. Ta bort ljud genom att ta bort kommandot avlägsnas bort genom att välja "Process" → "Buller" → "Ta bort utmatare".
      OBS! Denna process ersätter en pixel med medianen av pixlarna i omedelbar omgivning om den avviker från medianen med mer än ett visst värde (tröskeln).
  7. Ta bort eventuellt kvarvarande ljud manuellt (Lass = "xfig"> Figur 4).
    1. Öppna en kopia av originalbilden och använd den här som en guide för vad som är och vad som inte är ljud. Klicka på den dubbla röda pilknappen längst till höger om verktygsfältet. Välj teckningsverktygen; Teckensnittsverktygen visas nu i verktygsfältet.
    2. Klicka på Eraser-verktyget. Justera raderdiametern genom att högerklicka på verktygsknappen Eraser. Håll vänster musknapp för att radera brus.
      OBS! Endast en sessionsperiod kan raderas. När den vänstra musknappen släppts och klickas igen kan det tidigare raderingen inte ångras.
  8. Justera tröskeln genom att välja "Bild" → "Justera" → "Tröskel." Flytta reglagen för att justera tröskelvärdena för minsta (övre glider) och maximala tröskelvärden (lägre glider) tills en lämplig bild av körteln uppnås.
    OBS! Ställ in gränsvärdessegmenten gråskala bilder i funktioner av intresse och bakgrund.
    1. Klicka på Apply. Vid behov, ta bort ytterligare ljud vid denna punkt genom att följa steg 3.6.1 och 3.6.2.
  9. Rekonstruera de delar av glandulärt epitel som avlägsnades genom tröskel och ljudavlägsnande ( Figur 5 ).
    1. Genomför noggrann och noggrann bildrekonstruktion för att upprätthålla integriteten hos originalbilden. Se originalbilden för en referens om vad som är och vad som inte är epitel.
    2. Klicka på verktyget Spray Can (på verktygsfältet med ritverktygen). Justera sprutdiametern och hastigheten genom att högerklicka på verktygsknappen Spray Can. Var noga med att fylla i saknade delar av körteln genom att klicka eller håll ner den vänstra musknappen.
  10. Skapa en skelettiserad bild av körteln för att utföra Sholl-analysen. Se till att den trösklade bilden är binär genom att välja "Process" → "Binär" → "Gör B inary."
    1. Om bilden är vit på en svart bakgrund, välj "Process" → "Binär" → "Alternativ" och avmarkera "Svart bakgrund". Skeletonera bilden genom att välja "Process" → "Binär" → "Skeletonize."
      OBS! Detta tar upprepade gånger pixlar från kanterna på den binära bilden tills den reduceras till en enkel pixelformad form.
    2. Fördjupa bilden en gång genom att välja "Process" → "Binary" → "Dilate."
      OBS! Detta fyller i luckor skapade genom tröskelvärde och skelettisering genom att lägga till pixlar i kanterna på binärbilden.
  11. Spara bilden genom att välja "Arkiv" → "Spara som". Välj en bildtyp (typiskt jpeg), skriv in filnamnet och klicka på "OK".
  12. Kontrollera noggrannheten hos den skelettiserade bilden genom att lägga den skelettiserade bilden över på originalbilden (Röv = "xfig"> Figur 6).
    1. Skapa ett överlägg genom att öppna både originalbilden och den skelettiserade bilden. Välj "Bild" → "Överlagring" → "Lägg till bild". I dialogrutan "Lägg till bild" väljer du skelettbilden från rullgardinsmenyn "Bild till tillägg" och ställer opaciteten på 30%.
    2. Spara bilden av skelettbilden överlagrad på originalet genom att välja "Arkiv" → "Spara som". Välj en bildtyp, skriv in filnamnet och klicka på "OK".

4. Utför Sholl-analysen

  1. Öppna en skelettbild och gör bilden binär genom att välja "Process" → "Binär" → "Gör binär".
    1. Innan du ställer in förstoringsskalan mäter du antalet pixlar / mm med en mikrometer för förstoringen där bilderna tagits.
    2. Ställ in den uppmätta förstoringen sCale genom att välja "Analysera" → "Set Scale." Ange antal pixlar / mm. Ställ in "Känd distans" och "Pixel-bildförhållande", båda till 1. Ange "mm" för "Enhetens längd" och kontrollera "Global" (bibehåller samma skala för varje bild).
  2. Bestäm slutänden (inneslutande radien) för Sholl-analysen genom att dra en linje från början av den primära kanalen (analyscentrum) till den mest distala punkten i glandularepitelet ( Figur 7 ).
    1. Använd linjebildningsverktyget i verktygsfältet för att rita en linje mellan de intressanta punkterna. Tryck på "M" -knappen för att göra en mätning och notera att ett resultatfönster öppnas.
      OBS! Värdet i kolumnen "Längd" är längden på linjen i mm. Detta värde kommer automatiskt att anges som slutgiltigt rad när du ställer in Sholl-parametrarna. Sholl-plugin använder startpunktenAv linjen som centrum för de centriska ringarna.
  3. Körning av Sholl-analysen.
    1. Kör analysen genom att välja "Plugins" "Advanced Sholl Analysis;" Ett parametervindu visas.
    2. Ställ in startradien i "I. Definition av skal" till 0,00 mm; Längden på linjen mätt i steg 4.2 kommer automatiskt att anges som "slutgiltig rad".
    3. Ställ in "Radius Step Size" till 0,1 mm.
      OBS: Radstegstorleken bestämmer antalet ringar (effektivt antalet iterationer); En mindre stegstorlek ökar antalet ringar, medan en större stegstorlek minskar antalet ringar. Radien kan inte ställas in för liten, men en alltför liten radie kommer att leda till ett onödigt stort antal ringar. Det kan dock ställas in för stort, vilket kommer att skapa färre ringar och därefter underskatta det sanna antalet korsningar. Se Stanko et al.(2015) för ytterligare information om bestämning av stegstorleken.
    4. Ange "# Prov" till 1 och "Integration" till "Mean" i "II. Multiple Samples per Radius."
    5. Ställ in "Enclosing Radius Cutoff" på 1 och kontrollera "Infer från startradien" för "# Primary Branches" i "III. Descriptors and Curve Fitting."
      OBS: "Anpassa profil och beräkningsbeskrivare" och "Visa monteringsdetaljer" kan kontrolleras som önskat.
    6. Kontrollera "Linjär" och välj "Bästa passande grad" i "Profiler utan normalisering". Kolla "Mest informativa." Välj "Område för normaliserade profiler" i "IV. Sholl-metoder".
    7. Markera "Create Intersections Mask" i "V. Output Options" för att skapa en värmekarta över korsningarna (valfritt).
    8. Klicka på "Se avsnitt" för att skapa ett förhandsgranskningsfönster på bilden med ringar för att bekräfta områdetAv analysen.
  4. Klicka på "OK" för att köra analysen.

5. Mätning av MEA

  1. Mäta MEA genom att spåra det kortaste avståndet runt epithelialdet ( Figur 8 ).
    1. I ImageJ med skelettbilden på körteln öppen, klicka på Polygon-verktyget. Klicka på en punkt på epithelialträdets omkrets för att börja polygonen, flytta runt käftens omkrets och klicka för att lägga till ett linjesegment.
    2. När hela epitelområdet har kringgåtts, dubbelklicka för att stänga polygonen. Tryck på "M" -knappen för att öppna ett resultatfönster; Värdet i kolumnen "Area" är MEA.
  2. I fall där körtelepitelet har förlängt bortom lymfkörteln, subtrahera lymfkörtelområdet (LNA) från MEA vid beräkning av förgreningstätheten.
    1. Mät LNA genom att spåra lymfkörten i samma manEr som epithelialdet och trycka på "M."
      OBS: LNA måste subtraheras från MEA i dessa fall eftersom lymfkörningen förhindrar analysen från att räkna korsningar inom LNA. När epitelet inte har nått lymfkörteln är LNA noll.

6. Rapportering av data

  1. Rapportera värden för omslutningsradie, MEA, N, k och förgreningstäthet.
    OBS: Omslutningsradien bestäms i steg 4.2 och MEA bestäms i steg 5.1.
    1. Kör analysen för att skapa ett Sholl-resultatfönster.
      OBS: Den rapporterade N är värdet för summaintervallet. Den rapporterade k är värdet för Sholl-regressionskoefficienten (halvlogg). Sholl-analysen kommer att returnera ett värde för k över varje uppmätt region i glandularepiteln. För att erhålla ett exakt värde för k över hela epitelet måste duksändarna vara närvarande.
    2. Ändra thE Sholl analys för bröstkörteln genom att använda utgångsvärdet för N för att beräkna förgreningstätheten (den grundläggande ändpunkten för denna metod). Beräkna förgreningstätheten med formeln N / (MEA-LNA) och rapportera värdet som N / mm 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Värdena för den uppmätta slutna radien, MEA, N, k och beräknad förgreningstäthet för bröstkörteln analyserad i detta protokoll rapporteras i Tabell 1 . Sholl-analysen genererar linjära och semi-loggbilder av antalet korsningar vid varje radie ( Figur 9 ) och, om vald, en värmekarta över korsningarna ( Figur 10 ). Mindre utvecklade körtlar uppvisar färre korsningar inom samma MEA och har därför en lägre förgreningstäthet. En välutvecklad körtel fortsätter att grena jämnt över hela glandularepitelet, särskilt i de distala regionerna. Omfattningen av vilken förgrening fortsätter i dessa regioner kan beskrivas som förgreningskomplexitet och minskningar i komplexitet förmedlas som en sönderfallshastighet (eller Sholl-regressionskoefficient, k ). Avfallshastigheten återspeglar förändringen i distal epithelialbhNsning och mäts som lutningen av linjen av antalet korsningar som ritats mot den inneslutande radien ( dvs epitelens longitudinella tillväxt). Sålunda beräknas Sholl-regressionskoefficienten genom att ta lutningen av linjens linje i loggen (N / S) mot det radiella avståndet (r), där logg (N / S) = - k r + m, varvid N är Antalet korsningar för varje ring av radie r och område S (πr 2 ) och m är avlyssningen. Eftersom lutningen - k beskriver avklingningen av korsningarna, ett värde på - skulle k = 0 indikerar noll sönderfall och likformig förgrening från centrum av analysen till kanten av epitelet. I glesutvecklade körtlar ökar förgreningsförfallet; Det finns färre korsningar i epitelialdet distala regionen; Och lutningen, k , ökas. Därför är värdena för k som närmar sig 0 indikativa för större distalförgrening ( dvs förgreningskomplexitet) och en brunn-utvecklad bröstkörtel.

Figur 1
Figur 1: Ventral View. Bild av den ventrala delen av en vuxen kvinnlig Sprague Dawley-råtta, som illustrerar hur man skyddar råttan på dissekteringsytan och placeringen av de 12 bröstkörtlarna, med nipplarna cirklade. * Nipplarna på körtlarna 6 och 7 är inte synliga. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: Kvinnlig råtta mamma. Illustration av exponerade bröstkörtlar 4 (MG4) och 5 (MG5), med huden fast på dissekteringsytan ovanför MG4 och strax under MG5. Körtlarna ska tas bort från sk I början med MG5 och fortsätter upp och dorsalt tills MG5 och 4 är helt borttagna. Bröstvårtan ligger i distansområdet av körteln 4, och försiktighet bör utövas för att samla detta område. Lymfkörteln är angiven som referens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Mammary Gland Whole-mount. En helmonterad bild av en bröstkörtel uppsamlad från en postnatal dag 25 kvinnlig Sprague Dawley råtta. Skala bar = 1 mm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

.jpg "/>
Figur 4: Avlägsnande av brus. Den blå färgkanalen av en helbredd bild med bröst, med bakgrunden subtraherad. ( A ) demonstrerar exempel med brus. Pilarna indikerar ljud som skapats av blodkärl, och den mer skuggade regionen som omger duktändarna är ett exempel på brus som skapas genom att subtrahera bakgrunden. ( B ) illustrerar bilden efter att bruset har tagits bort. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5
Figur 5: Bildåteruppbyggnad. Rekonstruktion av de raderade delarna av den trösklade bilden. ( A ) De röda pilarna indikerar områden där delar av bilden förlorades på grund av tröskelvärdet. Image reconstBrytning bör utföras i dessa regioner. ( B ) Mammarbild efter rekonstruktion av de raderade regionerna. Bildrekonstruktion bör genomföras noggrant och minimalt för att upprätthålla integriteten hos originalbilden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6
Figur 6: Överlagring av en skelettiserad bild. Överlagringsbild som visar en skelettiserad bild överlagrad på den ursprungliga helmonterade bilden. Den här bilden visar att den skelettiserade körteln speglar förgreningen av själva körteln med en hög grad av noggrannhet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.


Figur 7: Inloppsradie. Skelettiserad bild av ett helbrott i bröstet som visar var den omgivande radien mäts (gul). Linjen bör börja vid epithelialträdet (analyscentrum) och sträcka sig till epithelets mest distala punkt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 8
Figur 8: Mammary Epithelial Area. Skelettiserad bild som visar en polygon som spåras runt epithelialdet för att bestämma MEA. Vänligen klicka här för att se en större verSion av denna figur.

Figur 9
Figur 9: Sholl Plot Output. Sholl-utmatning av linjära ( A ) och semi-log ( B ) diagram av antalet korsningar vid varje radiellt inkrement. Den röda pricken i panelen (A) är abscissen av centroid (geometrisk centrum). I panelen (B) är den blå linjen den linjära regressionen över hela spektret av data, medan den röda linjen är den linjära regressionen över den 10: a -90: e procentilen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 10
Figur 10: Intersections Mask. När "Create InterAvsnittet Mask "är valt (steg 4.3.7) kommer analysen att mata ut en värmekarta över antalet korsningar över bildens omslutande radie. Denna värmekarta reflekterar densiteten av förgreningsskärningar genom epitelet (rött = hett = Hög densitet, blå = kall = låg densitet). Hela epitelet skulle ha samma färg i en värmekarta på en bild där k = 0. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

</ Table>

Tabell 1: Shollanalysparametrar. Värdena är de rapporterade data för Sholl-analysen. Omslutningsradien (steg 4.2) och MEA (steg 5.1) är uppmätta värden, N och k är Sholl analysresultat och returneras i fönstret Sholl analysresultat (steg 6.1.) Och grenningsdensitet beräknas med hjälp av formeln N / ( MEA-LNA) (steg 6.1.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Från födsel till puberteten är bröstkörtel tillväxt allometrisk. Efter puberteten utvecklas bröstkörteln genom omfattande duktalförgrening och förlängning, som fortsätter tills bröstpiteln upptar hela fettkudden. Förgreningsegenskaper är en viktig aspekt av utvecklingen av bröstkörteln, och förmågan att objektivt kvantifiera dessa egenskaper kan vara mycket användbar för att bedöma normal bröstutveckling och för att identifiera onormal utveckling efter tidiga livsutsikter för toxiska toxicanter.

Att poängtera morfologiska egenskaper, kvantifiera basdimensionella mätningar och räkna bröstkonstruktioner är typiska metoder för att utvärdera utveckling av bröstkörteln. Emellertid är dessa metoder inte särskilt känsliga på grund av den avsevärda variationen i storlek och form hos gnagarkörtlar och utvecklingstolkning kan vara svårt för en oerfaren utvärderare. Dessutom är potentialen förBias finns i studier som inte är blinda ordentligt. Sholl analysmetoden tillhandahåller ett effektivt protokoll för exakt kvantifiering av bröst-epithelialförgreningstäthet och förgreningskomplexitet, diskreta morfologiska egenskaper hos bröstkörtelutveckling, som lätt kan jämföras över studier och laboratorier.

Det finns kritiska steg inom flera delar av detta protokoll. Den första och viktigaste avser tillståndet hos bröstkörteln helmonterad. Noggrannheten i denna metod är beroende av en bröstkörtel som samlas helt intakt, monterad utan defekter, ordentligt fixerad och färgad och visar ingen oxidation av körteln eller signifikant missfärgning av monteringsmediet. Om körteln rivs eller viks, kan inte en noggrann mått på förgreningstätheten erhållas. Om duktala ändarna inte är närvarande, kommer värdet för k inte att vara representativt för hela körteln. Tröskelvärdet är svårt i körtlarnaSom inte är fullständigt fixade på grund av brist på färgkontrast i ductalepitelet. Och slutligen, om oxidation eller missfärgning är närvarande, kan dessa fläckar förhindra att analysen mäter korsningar i det drabbade området.

När lämpliga helmounts har upprättats, tar nästa kritiska steg bilderna i samma förstoring. Det är vanligt att fånga digitala bilder med högsta möjliga upplösning. Men för Sholl-analysen är det viktigare att alla bilder tas i samma förstoring. Såsom beskrivs i Stanko et al. (2015) 3 upptäcktes en tillbakagång där bilder av mindre körtlar fångade vid hög förstoring uppvisade större förgreningsdensiteter än bilder av större körtlar fångade vid en lägre förstoring, även om de visuellt visade sig vara mindre utvecklade. Vi förutsåg att den högre förstoringen resulterade i mer detalj, som överfördes till tHan skelettiserade bilden och resulterade i en högre N, som överrepresenterade förgreningstätheten hos de mindre körtlarna. Problemet lindras genom att fånga alla bilder med samma förstoring.

Medan grunden för en exakt analys ligger inom helmonteringen ligger den största potentialen för användarinflytande förändringar i skärningsdata inom stegen för bulleravlägsnande. Alla bilder innehåller brus, till viss del, på grund av färgningsintensitet, icke relevanta fysiologiska enheter (t ex blodkärl) och artefakter av tröskelvärden. Varje bild måste adresseras oberoende på grund av variationer i ljudmängden mellan bilderna. Försiktighet måste vidtas för att inte ta bort för lite eller för mycket buller, eftersom detta kan skäva antalet korsningar och följaktligen förgreningstätheten. Huruvida buller påverkar tolkningen har emellertid inte undersökts. Användaren bör bestämma hur noggrann att vara med ljudavlägsnande och bör också utöva consisTålighet att upprätthålla bildernas integritet. Det rekommenderas starkt att användaren blindas för behandling vid störning av buller, eftersom detta minimerar potentialen för förspänning. Bulleravlägsnande beskrivs i detalj i ImageJ användarhandbok 7 . Vid denna procedur avlägsnas ljudet huvudsakligen från den bakgrundsdragen bilden. Dessutom kan tröskelprocessen i sig avlägsna segment av körtelen. Delar av körteln där endast några pixlar har tagits bort kommer att rekonstrueras automatiskt när den skelettiserade bilden utvidgas. Dock kan expansiva luckor kräva manuell återuppbyggnad. Användaren ska bestämma om och i vilken utsträckning att rekonstruera dessa segment, återigen upprätthålla integriteten hos de ursprungliga bilderna.

Även om detta inte är kritiskt är det viktigt att behålla mjukvaruuppdateringar, eftersom ImageJ-programvaran uppdateras ofta. De metoder som beskrivs här är baserade på version 1.48v. FIJI och Sholl aNalysis plugin uppdateras också regelbundet, och protokollet som beskrivs här är baserat på v3.4.1. Ändringar som gjorts i senare versioner av både ImageJ och Sholl Analysis-plugin kan påverka dessa metoder. ImageJ checkar automatiskt efter uppdateringar, men uppdateringar för FIJI bör utföras regelbundet, och ändringar mellan nuvarande versioner och de som används här bör åtgärdas vid behov. Alla parametrar definieras i underrubriker på Sholl Analys webbsida 6 . Parameterinställningarna inom denna procedur är baserade på bilder som tagits från bröstkorgshjälmar som är skapade i vårt laboratorium och är inte absoluta. Helmonterad beredning varierar från laboratorium till lab, och dessa parametrar kan justeras i enlighet därmed för att optimera bilder och utdata.

Bröstkörteln helmonterad som användes i denna studie var från en kvinnlig Sprague Dawley-råtta vid PND 25 och metoden applicerades på lämpligt sätt och utan begränsningar. Vid råttor inkorporeras bröstpitelets densitetReagerar med ålder till en punkt där det förhindrar att bilden skärs med tillräckligt hög upplösning för att skapa en noggrann skelettiserad bild av körteln. Därför rekommenderar vi för närvarande inte att använda denna metod på körtlar från råttor som är äldre än PND40. Även om råttestammen har angivits här är det irrelevant, eftersom författarna för närvarande inte är medvetna om några stamspecifika bröstegenskaper som skulle förhindra användningen av denna metod. Vidare, även om metoden som beskrivits inom utfördes med användning av en honrotta, kunde den också appliceras på bröstkörtlarna hos hanrotter. Denna applikation har också använts effektivt med helmusning av möss (Deirdre Tucker, personlig kommunikation) och bör vara lämplig för mus av vilken ålder som helst, eftersom bröstkörtlar hos möss inte växer så täta som hos råttor. Det finns emellertid två begränsningar med användningen av denna applikation hos möss: 1) det kan finnas för få förgreningskorsningar hos yngre möss för att upptäcka signifikanta skillnader och 2) denna metod kan inteT appliceras på manliga möss, eftersom de inte uppvisar bröstpitel. Oavsett, den här automatiserade metoden är snabbare, objektiv och mycket mindre arbetskrävande än att räkna korsningskorsningar manuellt.

Det är möjligt att utredare kan önska att utnyttja bröstkörteln för andra experimentella tekniker, såsom uttag av onormala strukturer eller immunohistokemi (IHC). Även om Tucker et al. (2016) har beskrivit ett förfarande för att framställa en hematoxylin-eosinfärgad sektion från en fullständig montering av muskörtelkirtlet 8, anser vi typiskt att skapa en helmontering för att vara en terminal process och inte känner till metoder för att använda en hel- Monterad bröstkörtel för ytterligare känsliga analyser, såsom IHC- eller TUNEL-analyser. När känsliga analyser som använder bröstkörtelvävnad krävs i samband med helmounts, rekommenderas att de kontralaterala bröstkörtlarna används.

Bröstkörteln fortsätter tO vara fokus i ett ökande antal studier, men skillnader mellan laboratorier finns både i helmonteringsberedning 9 , 10 , 11 , 12 och utvecklingsbedömningar 13 , 14 , 15 . Modifieringen av Sholl-analysen som beskrivs här tillhandahåller en standardiserad metod för målkvantifiering av förgreningstäthet, en viktig egenskap hos utveckling av bröstkörteln, i gnagarkörteln. Denna metod kan tillämpas på bröstmjölk i hela människa eller manliga gnagare. Även om den för närvarande rekommenderas för användning i enbart tidig-postnatal till peripubertal körtlar från råttor, kan den appliceras på bröstkörtlar från mus i alla åldrar. Applikationen är särskilt lämplig för bröstkörtlar uppsamlade från peripubertal gnagare, eftersom denna period är en rekommenderadSlutpunkt för fullständig beredning av bröst i beredningsstudier. Optimering av denna metod för användning i de tätare bröstkörtlarna hos vuxna råttor betraktas för närvarande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Författarna skulle vilja bekräfta Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) för hans hjälp med valideringen av denna metod och Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Kanada) för hans kontinuerliga Hjälp med Sholl-ansökan.

Materials

Omslutningsradie (mm) MEA (mm2) N k Förgreningsdensitet (N / mm2)
7,4 71,7 2381 0,73 33,2
Name Company Catalog Number Comments
Dissecting board NA NA A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins Daigger EF7419A
Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors Fine Science Tools 14569-09
Straight dissecing scissors Fine Science Tools 14568-09
Curved forceps Fine Science Tools 11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001 Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm Fisher scientific 12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher scientific 13-374-12
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)  Sigma-Aldrich 24102
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Carmine alum  Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate  Sigma-Aldrich A6435
Permount mounting media Fisher Scientific SP15
Macroscope Leica Z16 APO  This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera Leica DFC295
Camera software Leica Leica Application Suite v3.1 
ImageJ software Open source http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis  Open source http://imagej.net/Sholl_Analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
  2. Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
  3. Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
  4. Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
  5. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
  6. Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from: http://imagej.net/Sholl_Analysis (2012).
  7. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012).
  8. Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
  9. Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
  10. Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
  11. Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
  12. Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
  13. Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
  14. Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
  15. Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 125 mammakörtel Sholl analys reproduktiv helmonterad toxikologi råttmodell
Kvantifiering av förgreningsdensitet i råtta Mammary Gland Whole-mounts med hjälp av Sholl analysmetoden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stanko, J. P., Fenton, S. E.… More

Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter