Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kvantifiserende forgreningstetthet i rotte Mammary Gland Whole-mounts ved hjelp av Sholl analysemetoden

Published: July 12, 2017 doi: 10.3791/55789
Automatic Translation
1, 1
1National Toxicology Program Laboratory, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

Summary

Utvikling av mamma kjertel i gnageren er typisk blitt evaluert ved hjelp av beskrivende vurderinger eller ved å måle grunnleggende fysiske egenskaper. Forgreningsdensitet er en indikator på brystutvikling som er vanskelig å kvantifisere objektivt. Denne protokollen beskriver en pålitelig metode for den kvantitative vurderingen av forgreningsegenskaper for brystkjertelen.

Abstract

Et økende antall studier benytter gnagekjertelen som et sluttpunkt for å vurdere utviklingsmessig toksisitet av en kjemisk eksponering. Effektene disse eksponeringene har på utvikling av brystkjertelen, blir typisk vurdert ved hjelp av enten grunnleggende dimensjonale målinger eller ved å score morfologiske egenskaper. Det brede spekteret av metoder for tolking av utviklingsendringer kan imidlertid føre til inkonsekvente oversettelser på tvers av laboratorier. En felles metode for vurdering er nødvendig, slik at det kan dannes skikkelige tolkninger fra data som sammenlignes på tvers av studier. Den foreliggende studien beskriver anvendelsen av Sholl analysemetoden for å kvantifisere brystkjertelen forgreningsegenskaper. Sholl-metoden ble opprinnelig utviklet for bruk i kvantifisering av neuronale dendritiske mønstre. Ved hjelp av ImageJ, en programvarepakke med åpen kildekodeanalyse, og et plugin utviklet for denne analysen, er kjernekjertelen forgreningstettheten og kompleksiteten avAmmerkjertelen fra en peripubertal kvinnelig rotte ble bestemt. Metodene beskrevet her vil muliggjøre bruk av Sholl-analysen som et effektivt verktøy for å kvantifisere et viktig kjennetegn ved utvikling av brystkirtler.

Introduction

Mammekjertyrforgrening er en egenskap som vanligvis vurderes som en indikator på kjertelutvikling, men det er vanskelig å objektivt kvantifisere. I 1953 beskrev Sholl 1 en metode for å måle nevronisk dendritisk arborisering i kattens visuelle og motoriske cortices, og en plugin for denne teknikken ble utviklet av Ferriera et al. 2 . Fordi både nevroner og brystkjertler utviser en lignende trelignende struktur, ble pluggen benyttet for å kvantifisere bryst epithelial forgreningsdensiteter i 2D-bilder av peripubertal-rotte-brystkjertelen. Peripubertal-scenen ble valgt for analyse fordi avvenning er et livsstadium som ofte blir vurdert i akademiske laboratorier og testretningslinjer. Sholl-analysen er et plugin distribuert med FIJI, som er åpen kildekodebehandlingspakke ImageJ, med flere plugins inkludert. Pluggen skaper en serie konsentriske ringer som omkranser en predefMidtpunkt (vanligvis soma av en nevron eller opprinnelsen til den primære kanalen i en brystkjertel) og strekker seg ut til den fjerneste delen av objektet (den innelukkende radius). Det teller deretter antall kryssinger (N) som forekommer på hver av ringene. Pluggen returnerer også en Sholl-regresjonskoeffisient ( k ), som er en måling av graden av forfall av epithelialforgrening.

Ved hjelp av ImageJ, opprettes et skjelettbildet av en brystkjertel-helfest, og mageepitelområdet (MEA) måles. Bildet analyseres ved hjelp av Sholl analyse plugin, og verdier for N og k , blant andre verdier som ikke benyttes her, returneres. Mammary epithelial branching density bestemmes ved å beregne N / MEA. Omfanget av forgrening fortsetter i de ytre områdene av kjertelepitelet er forgrenings-kompleksiteten og er en indikator for uniform distal epitel vekst. Som k er et mål for den distale nedgangen i epithElial branching, er det et effektivt mål for forgreningskompleksiteten og en pålitelig indikator for brystutvikling.

Denne protokollen beskriver en datamaskinassistert metode for å lage skeletoniserte bilder av brystkjertel-helmounts og kvantitativt evaluerende brystforgreningsegenskaper hos peripubertal han- og hunrotter. Denne metoden er relativt rask og krever ikke bruk av spesialisert mikroskopi utstyr. Utvikling og validering av denne metoden er beskrevet i Stanko et al. (2015) 3 . Denne rapporten beskriver også fremstilling av rotte brystkjertel hele = mounts. Lignende helbrede prosedyrer for mamma er beskrevet i de Assis et al. (2010) 4 og Plante et al. (2011) 5 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All dyrebruk og prosedyrer for denne studien ble godkjent av NIEHS Laboratory Animal Care and Use Committee og utført i en forening for vurdering og akkreditering av laboratoriepleiepleie akkreditert anlegg.

1. Excise Mammary Glands

  1. Formerke alle lysbilder ved hjelp av en xylen-sikker metode (blyant fungerer best). Dekk dem med monteringsløsning på enden for å bevare etiketten.
  2. Euthanize dyret ved en institusjonell dyrepleie og brukskomité godkjent metode.
  3. Etter eutanasi, plasser dyret på ryggen på et dissekasjonsbord ( figur 1 ). Strekk og pin ned alle fire lemmer, med de bakre lemmer som danner en omvendt V (holdepinner eller småmåler nåler fungerer godt).
  4. Spray abdomen liberalt med 70% etanol for å holde håret ut av mammeprøven.
  5. Bruk tau, trekk opp magesekken på midtlinjen og gjør et lite snitt medDissekere saks, vær forsiktig så du ikke punkterer brystbenet.
    1. Begynn ved snittet, kutt huden opp til nakkeområdet og deretter distalt til forsiden. Kutt ned til inngangsregionen og deretter distalt til den første skjøten av den bakre lemmen på samme side; Dette snittet skiller vanligvis brystkjertlene 5 og 6. Unngå å kutte bukhinnen.
    2. Trekk tilbake huden med den vedlagte brystfettpuden ved hjelp av pincet, forsiktig å skille den fra brystbenet ved hjelp av den stumpe enden av dissekerende saks. Separat så langt dorsalt som mulig for å fullt ut avsløre den fjerde og femte inngangsmuskulaturen på undersiden av huden; Fest huden til dissekasjonsplaten ( figur 2 ).
    3. Ta forsiktig mammevævet i den femte kjertelen med den avrundede siden av buede tang og sakte trim kjertelen vekk fra huden, vær forsiktig så du ikke nikker kjertelen eller huden.
    4. Fortsett å trimme,Flytter dorsalt til den fjerde og femte kjertelen har blitt helt løftet fra huden. Sørg for at brystvorten er fjernet med resten av kjertelen, da dette tjener som utgangspunkt for Sholl-analysen. Skjær brystvevet vekk fra kroppen der det er festet til kjertelen 4.
  6. Når kjertelen er fjernet fra dyret, spred den jevnt på et elektrostatisk ladet, 25 mm x 75 mm x 1 mm mikroskopisk lysbilde, med siden som var tilstøtende til huden vendt nedover.
    MERK: For kjertler fra eldre eller ammende dyr kan det være nødvendig med en glidelåse på 51 x 75 x 1 mm.
  7. Mens du bruker hansker, press forsiktig ut noen luftbobler. Dekk kjertelen med en plastparafinfilm og et annet glideskive og komprimer kjertelen for å feste den til lysbildet.
    MERK: Et 50 ml konisk rør fylt med vann tjener som en egnet vekt. Mengden tid som kreves for å holde seg til lysbildet, avhenger av tykkelsen på kjertelen. Tynn, postnaTaledag (PND) 4 kjertler skal komprimeres i minst 30 minutter, mens tykkere voksenkjertler kan kreve så mye som 2-5 timer.

2. Forbered Mammary Whole-Mounts

  1. Tilbered karminatalløsningen minst 24 timer i forveien, da det krever koking og kjøling.
    1. Oppløs 1 g karmin alun og 2,5 g aluminium kaliumsulfat (AlK (SO 4 ) 2 · 12H 2 O) i 500 ml destillert vann og koker i 20 minutter i en 1-L-kolbe. Ta det endelige volumet til 500 ml ved å bruke destillert vann.
    2. Filtrer oppløsningen gjennom filterpapir under vakuum og kjøleskap for oppbevaring.
      MERK: Carmine alum-løsningen kan gjenbrukes, men bør kastes når fargen begynner å falme.
  2. Før fiksering, skyll parafinfilmen av kjertelen, vær forsiktig så du ikke trekker kjertelen ut av lysbildet. Plasser lysbildet (ene) i en glassfargekanne og dypp ned i fikseringsmiddel (100% etanOl, kloroform og iseddik i forholdet 6: 3: 1) i 12-48 timer, avhengig av tykkelsen av kjertlene.
  3. Hell av fikseringsmiddelet og suge kjertlene i 70% etanol i 15 minutter. Rehydrer kjertene gradvis ved å helle ut 1/3 av etanoloppløsningen og erstatte den med destillert vann. Soak i 5 min. Gjenta denne prosessen tre ganger.
  4. Etter den siste skyllingen, hell av all etanol / vannoppløsningen og erstatt den med 100% destillert vann. Soak kjertlene i 5 min.
  5. Hell det destillerte vannet og fordyp kjertlene i karmintalløsningen. Farg kjertlene i 12-24 timer, avhengig av tykkelsen.
    MERK: Kjertlene kan ikke overfarges, men flekketiden for flere satser bør være den samme, slik at fargestyrken er den samme.
  6. Hell karmin alunopløsningen og skyll kjertlene i 100% destillert vann i 30 s. Gradvis dehydrere kjertlene ved å suge dem i 70% etanol i 15 minutter, 95% etanol i 15 minutter, aNd 100% etanol i 20 minutter.
  7. Tøm kjertlene av fett ved å suge dem i xylen i 12-72 timer, avhengig av tykkelsen.
    MERK: Kjertlene skal være gjennomsiktige (klare). Hvis noen ugjennomsiktige (hvite) områder forblir, fortsett å suge i xylen til gjennomskinnelig. Hvis lakterende eller ellers veldig tykke kjertler blir flekket og ryddet, kan xylenet kanskje byttes ut en gang for å fullstendig fjerne kjertlene.
  8. Monter lysbildene med et xylenbasert monteringsmedium ved å pipettere nok medium for å bare dekke kjertelen. Legg til et deksel, slik at det ikke dannes luftbobler.
  9. Tillat lysbildene å tørke. Når monteringsmediet tørker, vil det bli kontrakt under dekslet, og det kan være nødvendig å legge til ekstra monteringsmedium. Når ikke noe ekstra medium er nødvendig, la lysbildene tørke helt. Dette kan ta 2-3 uker.
  10. Når lysbildene er helt tørre, kan alt gjenværende monteringsmedium fjernes med en bomullspinne og en liten mengde xylen. Vær forsiktig så du ikke brukerFor mye xylen, da dette kan oppløse monteringsmediet og løsne dekslet. Hvis dette skjer og luftbobler samler seg under dekslet, bør dekselet fjernes i xylen og monteringsprosessen bør gjentas.

3. Klargjør hele bilder for analyse

  1. Ta bilder av helmounts ( figur 3 ) ved hjelp av et makroskop eller dissekeringsmikroskop og et digitalkamera med riktig programvare.
    MERK: Mens en forstørrelse som fanger hele glandularepitelet kan velges, er det avgjørende å fange alle helmonterte bilder som vil bli sammenlignet med hverandre ved samme forstørrelse.
  2. Last ned ImageJ-programvare (eller FIJI-programvare) 6 .
  3. Åpne brønds helfestet bilde i ImageJ ved å klikke på "File" → "Open." Velg Freehand verktøyet og spore rundt kjertelepitelet. Velg "Rediger" & #8594; "Clear Outside."
    1. Fjern lymfeknuter ved å spore rundt noden og bruke Freehand-verktøyet og "Rediger" → "Klipp ut".
  4. Separat fargekanaler ved å velge "Image" → "Color" → "Split Channels." Velg kanalen med den beste kontrast, vanligvis den blå kanalen.
    MERK: Et RGB-bilde består av en stabel med de røde, grønne og blå komponentene i bildet. Denne handlingen skiller disse komponentene i tre 8-biters gråtonebilder.
  5. Trekk bakgrunnen ved å velge "Prosess" → "Trekk bakgrunnen." Velg de ønskede parameterne og klikk deretter "Forhåndsvis" for å forhåndsvise endringene.
    MERK: "Trekk bakgrunn" fjerner jevne, kontinuerlige bakgrunner. I tillegg kan "Process" → "Filters" → "Unsharp Mask" brukes til å skape kontrast.
  6. Velg en av th E Følgende metoder for automatisk fjerning av støy: despeckle eller fjern avvikere.
    MERK: ImageJ tilbyr en tredje metode for automatisk støyfjerning: fjern NaNs. Kommandoen Ta bort NaNs er imidlertid ikke anvendelig siden den bruker 32-biters bilder, og den gjeldende metoden bruker 8-biters bilder.
    1. Fjern støy ved hjelp av despeckle-kommandoen ved å velge "Process" → "Støy" → "Despeckle."
      MERK: Dette tilsvarer å legge til et medianfilter, som erstatter hver piksel med medianverdien i sin 3 × 3 nabolag.
    2. Fjern støy ved å fjerne kommandoen Remove Outliers ved å velge "Process" → "Noise" → "Remove Outliers."
      MERK: Denne prosessen erstatter en piksel med medianen av pikslene i umiddelbar nærhet dersom den avviker fra medianen med mer enn en viss verdi (terskelen).
  7. Fjern eventuell gjenværende lyd manuelt (Lass = "xfig"> Figur 4).
    1. Åpne en kopi av det opprinnelige bildet og bruk dette som en veiledning for hva som er og hva som ikke er støy. Klikk på den dobbeltrøde pilknappen helt til høyre på verktøylinjen. Velg tegneverktøyene; Tegneverktøy-knappene vises nå i verktøylinjen.
    2. Klikk på Eraser-verktøyet. Juster viskelærdiameteren ved å høyreklikke på verktøylinjen Eraser. Hold venstre museknapp for å slette støy.
      MERK: Bare en økt sletting kan fortrykkes. Når den venstre museknappen er slått ut og klikket på nytt, kan den forrige sletningen ikke fortrykkes.
  8. Juster terskelen ved å velge "Image" → "Adjust" → "Threshold." Flytt glidebryterne for å justere minimumsgrensen (øvre glidebryter) og maksimumsgrense (nedre glidebryter) til en tilstrekkelig skildring av kjertelen er oppnådd.
    MERK: Angi grenseverdisegmentene gråtonebilder til funksjoner av interesse og bakgrunn.
    1. Klikk på Bruk. Fjern eventuelt ekstra støy på dette punktet ved å følge trinn 3.6.1 og 3.6.2.
  9. Rekonstruere delene av kjertelepitelet som ble fjernet ved terskel og støyfjerning ( figur 5 ).
    1. Gjør bildrekonstruksjon nøye og på minimal måte for å opprettholde integriteten til det opprinnelige bildet. Se det opprinnelige bildet for en referanse om hva som er og hva som ikke er epitel.
    2. Klikk på Spray Can-verktøyet (på verktøylinjen med Tegneverktøy). Juster spraydiameteren og hastigheten ved å høyreklikke på Spray Can-verktøyknappen. Forsiktig fyll inn manglende deler av kjertelen ved å klikke eller holde nede på venstre museknapp.
  10. Lag et skjelettet bilde av kjertelen for å gjennomføre Sholl Analysis. Kontroller at det terskelte bildet er binært ved å velge "Process" → "Binært" → "Lag B inary."
    1. Hvis bildet er hvitt på en svart bakgrunn, velg "Prosess" → "Binær" → "Valg" og fjern merket "Svart bakgrunn". Skeletoniser bildet ved å velge "Process" → "Binært" → "Skeletonize."
      MERK: Dette fjerner gjentatte ganger piksler fra kantene til det binære bildet til det reduseres til en enkeltpiksel-bred form.
    2. Fortynn bildet en gang ved å velge "Process" → "Binært" → "Dilat".
      MERK: Dette fyller inn hull som er opprettet ved terskel og skeletonisering ved å legge til piksler i kantene på det binære bildet.
  11. Lagre bildet ved å velge "File" → "Save As". Velg en bildetype (vanligvis jpeg), skriv inn filnavnet, og klikk "OK".
  12. Kontroller nøyaktigheten av det skjelettede bildet ved å legge over det skjelettede bildet på det opprinnelige bildet (Ass = "xfig"> Figur 6).
    1. Lag et overlegg ved å åpne både det opprinnelige bildet og det skjelettede bildet. Velg "Bilde" → "Overlegg" → "Legg til bilde". I dialogboksen "Legg til bilde" velger du skjelettbildet fra rullegardinmenyen "Bilde til å legge til" og angir opaciteten på 30%.
    2. Lagre bildet av skjelettbildet som er lagt på originalen ved å velge "File" → "Save As". Velg en bildetype, skriv inn filnavnet, og klikk "OK".

4. Gjennomfør Sholl-analysen

  1. Åpne et skjelettbilde og gjør bildet binært ved å velge "Process" → "Binært" → "Gjør binært."
    1. Før du angir forstørrelsesskalaen, må du måle antall piksler / mm ved hjelp av en mikrometer for forstørrelsen der bildene ble tatt.
    2. Sett den målte forstørrelsen sCale ved å velge "Analyze" → "Set Scale." Skriv inn antall piksler / mm. Angi "Kjent Avstand" og "Pixel Aspect Ratio", begge til 1. Skriv inn "mm" for "Unit of Length" og sjekk "Global" (opprettholder samme skala for hvert bilde).
  2. Bestem sluttradiusen (inneslutende radius) for Sholl-analysen ved å tegne en linje fra begynnelsen av primærkanalen (sentrum for analyse) til det mest distale punktet i kjertelepitelet ( Figur 7 ).
    1. Bruk linjetegnverktøyet i verktøylinjen for å tegne en linje mellom interessepunktene. Trykk på "M" -tasten for å ta en måling og merk at et resultatvindu vil åpne.
      MERK: Verdien i kolonnen "Lengde" er lengden på linjen i mm. Denne verdien blir automatisk angitt som Ending Radius når du angir Sholl-parametrene. Sholl-pluginet bruker startpunktetAv linjen som sentrum av de sentriske ringene.
  3. Kjører Sholl-analysen.
    1. Kjør analysen ved å velge "Plugins" "Advanced Sholl Analysis;" Et parametervindu vil vises.
    2. Sett startruten i "I. Definisjon av skall" til 0,00 mm; Lengden på linjen målt i trinn 4.2 blir automatisk angitt som "Ending Radius".
    3. Sett "Radius Step Size" til 0,1 mm.
      MERK: Radiostørrelsen bestemmer antall ringer (effektivt antall iterasjoner); En mindre trinnstørrelse vil øke antall ringer, mens en større trinnstørrelse vil redusere antall ringer. Radien kan ikke settes for liten, selv om en for liten radius vil resultere i et unødvendig stort antall ringer. Det kan imidlertid settes for stort, noe som vil skape færre ringer og deretter undervurdere det sanne antallet kryss. Se Stanko et al.(2015) for ytterligere informasjon om å bestemme trinnstørrelsen.
    4. Sett "# Prøver" til 1 og "Integrasjon" til "Mean" i "II. Flere prøver per radius."
    5. Sett "Avsluttingsradius cutoff" til 1 og kontroller "Infer fra startradius" for "# Primary Branches" i "III. Descriptors and Curve Fitting."
      MERK: "Tilpass profil og beregningsbeskrivelser" og "Vis monteringsdetaljer" kan kontrolleres etter ønske.
    6. Sjekk "Lineær" og velg "Best passende grad" i "Profiler uten normalisering". Sjekk "Mest informativ." Velg "Område for normaliserte profiler" i "IV. Sholl-metoder".
    7. Sjekk "Opprett Intersections Mask" i "V. Output Options" for å lage et varmekart av kryssene (valgfritt).
    8. Klikk "Se segmentering" for å generere et forhåndsvisningsvindu av bildet med ringer for å bekrefte områdetAv analyse.
  4. Klikk "OK" for å kjøre analysen.

5. Måle MEA

  1. Mål MEA ved å finne den korteste avstanden rundt epithelentreet ( figur 8 ).
    1. I ImageJ med skjelettbildet av kjertelen åpent, klikker du på Polygon-verktøyet. Klikk på et punkt på epithelialtrekkets omkrets for å begynne polygonen, bevege seg rundt omkjørtets omkrets, og klikk for å legge til et linjesegment.
    2. Når hele epitelområdet er omgått, dobbeltklikker du for å lukke polygonen. Trykk på "M" -tasten for å åpne et resultatvindu; Verdien i kolonnen "Område" er MEA.
  2. I tilfeller der kjertelepitelet har forlenget seg utenfor lymfeknuten, trekker du lymfeknudeområdet (LNA) fra MEA når du beregner forgreningsdensiteten.
    1. Mål LNA ved å spore lymfeknudepunktet i samme mannEr som epithelialtreet og trykke på "M."
      MERK: LNA må trekkes fra MEA i disse tilfellene fordi lymfeknude hindrer analysen fra å telle kryss i LNA. Når epitelet ikke har nådd lymfeknudepunktet, er LNA null.

6. Rapporteringsdata

  1. Rapporter verdier for inneslutningsradius, MEA, N, k og forgreningsdensitet.
    MERK: Omslutningsradiusen bestemmes i trinn 4.2 og MEA bestemmes i trinn 5.1.
    1. Kjør analysen for å generere et Sholl-resultatvindu.
      MERK: Den rapporterte N er verdien for summen inters. Den rapporterte k er verdien for Sholl regresjonskoeffisienten (semi-log). Sholl-analysen vil returnere en verdi for k over alle målte områder av glandularepitelet. For å oppnå en nøyaktig verdi for k over hele epitelet, må duksenderne være til stede.
    2. Endre thE Sholl analyse for brystkjertelen ved å bruke utgangsverdien for N for å beregne forgreningsdensiteten (det grunnleggende sluttpunktet til denne metoden). Beregn forgreningsdensiteten ved hjelp av formelen N / (MEA-LNA) og rapporter verdien som N / mm 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Verdiene for den målte lukkede radius, MEA, N, k og beregnet forgreningstetthet for brystkjertelen analysert i denne protokollen er rapportert i tabell 1 . Sholl-analysen genererer lineære og semi-loggbilder av antall kryssinger i hver radius ( figur 9 ) og, hvis valgt, et varmekart av kryssene ( figur 10 ). Mindre utviklede kjertler har færre kryss i samme MEA og har derfor en lavere forgreningstetthet. En velutviklet kjertel vil fortsette å forgrenes jevnt gjennom hele kjertelepitelet, særlig i distale områder. Omfanget av forgrening fortsetter i disse områdene kan beskrives som forgreningskompleksitet og reduksjoner i kompleksitet blir formidlet som en hastighet for forfall (eller Sholl-regresjonskoeffisient, k ). Graden av forfall reflekterer endringen i distal epithelial braNese og måles som skråningen av linjen i antall kryssninger som er tegnet mot den innvendige radiusen ( dvs. den langsgående veksten av epitelet). Således beregnes Sholl-regresjonskoeffisienten ved å ta hellingen av linjene i logglisten (N / S) mot den radiale avstanden (r), hvor logg (N / S) = - k r + m, hvor N er Antall kryssinger for hver ring av radius r og område S (πr 2 ), og m er avskjæringen. På grunn av at skråningen - k beskriver nedbrytning av kryss, en verdi på - ville k = 0 indikere null forråtnelse og ensartet forgrening fra midten av analysen til kanten av epitelet. I tynt utviklede kjertler øker forgreningsforfallet; Det er færre kryss i det distale området av epithelialtreet; Og hellingen, k , økes. Derfor er verdier av k som nærmer seg 0 indikativ for større distal forgrening ( dvs. forgreningskompleksitet) og en brønn-utviklet brystkjertel.

Figur 1
Figur 1: Ventralvisning. Bilde av den ventrale delen av en voksen kvinnelig Sprague Dawley rotte, som illustrerer hvordan man sikrer rotten på disseksjonsflaten og plasseringen av de 12 brystkjertlene, med brystvorten sirklet. * Nippler av kjertlene 6 og 7 er ikke synlige. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Female Rat Mammary Gland. Illustrasjon av eksponerte brystkjertler 4 (MG4) og 5 (MG5), med huden festet til disseksjonsflaten over MG4 og like under MG5. Kjertlene skal fjernes fra sk I begynnelsen med MG5 og fortsetter opp og dorsalt til MG5 og 4 er helt fjernet. Brystvorten er i distalområdet av kjertel 4, og det bør utvises forsiktighet for å samle dette området. Lymfeknuten er indikert som referanse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Mammary Gland Whole-mount. Et helmontert bilde av en brystkjertel samlet fra en postnatal dag 25 kvinnelig Sprague Dawley rotte. Skalbjelke = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

.jpg "/>
Figur 4: Fjerning av støy. Den blå fargekanalen til et brystfotografi, med bakgrunnen subtraheres. ( A ) demonstrerer eksempler med støy. Pilene indikerer støy som er opprettet av blodkar, og den tyngre skyggede regionen som omgir duktene, er et eksempel på støy som oppstår ved å trekke bakgrunnen. ( B ) illustrerer bildet etter at støyen er fjernet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: Bildeoppbygging. Rekonstruksjon av de slettede delene av det terskelte bildet. ( A ) De røde pilene indikerer områder hvor deler av bildet mistet på grunn av terskelen. Image reconstForbindelse bør utføres på disse områdene. ( B ) Mammarbilde etter rekonstruksjon av slettede områder. Bildrekonstruksjon bør utføres nøye og på minimal måte for å opprettholde integriteten til det opprinnelige bildet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6
Figur 6: Overlegg av et skeletonisert bilde. Overleggsbilde som viser et skjelettet bilde overlaid på det opprinnelige helmonterte bildet. Dette bildet viser at den skjelettede kjertelen gjenspeiler forgreningen av selve kjertelen med høy grad av nøyaktighet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.


Figur 7: Innkapslingsradius. Skeletonisert bilde av en helbrede mamma som viser hvor inneslutningsradiusen måles (gul). Linjen skal begynne ved bunnen av epithelialtreet (sentrum for analyse) og strekke seg til epitelets mest distale punkt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8
Figur 8: Mammary Epithelial Area. Skeletonisert bilde som viser en polygon sporet rundt epithelialtreet for å bestemme MEA. Vennligst klikk her for å se en større verSion av denne figuren.

Figur 9
Figur 9: Sholl Plot Output. Sholl utgang av lineære ( A ) og semi-log ( B ) plott av antall kryssinger ved hvert radialt inkrement. Den røde prikken i panelet (A) er abscissen til centroid (geometrisk senter). I panel (B), er den blå linjen av lineær regresjon over hele området av data, mens den røde linje er den lineære regresjon over 10. -90 persentil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 10
Figur 10: Interseksjonsmaske. Når "Create InterMask-alternativet er valgt (trinn 4.3.7), vil analysen utgjøre et varmekart over antall kryss over tverrstikkets radius. Dette varmekartet gjenspeiler tettheten av forgreningsskjæringer gjennom epitelet (rød = het = Høy tetthet, blå = kald = lav tetthet). Hele epitelet ville være den samme fargen i et varmekart av et bilde der k = 0. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

</ Table>

Tabell 1: Shollanalyseparametre. Verdiene er de rapporterte dataene for Sholl-analysen. Vedleggsstrålen (trinn 4.2) og MEA (trinn 5.1) er målte verdier, N og k er Sholl analyseresultater og returneres i vinduet Sholl analyseresultater (trinn 6.1.), Og forgreningsdensiteten beregnes ved hjelp av formelen N / MEA-LNA) (trinn 6.1.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fra fødsel til puberteten er brystkjertelveksten allometrisk. Etter pubertet utvikler brystkjertelen gjennom omfattende duktal forgrening og forlengelse, som fortsetter til brystepitelet opptar hele fettputen. Forgreningsegenskaper er et viktig aspekt ved brystkjertelutvikling, og evnen til objektivt å kvantifisere disse egenskapene kan være svært nyttig for å vurdere normal brystutvikling og for å identifisere unormal utvikling etter tidlig livseksponering til brystgiftige stoffer.

Scoring av morfologiske egenskaper, kvantifiserende grunnleggende dimensjonale målinger og tellering av bryststrukturer er typiske metoder for å evaluere brystkirtelutvikling. Imidlertid er disse metodene ikke særlig følsomme på grunn av den betydelige variasjonen i størrelse og form av gnagekjertler og utviklingstolkning kan være vanskelig for en uerfaren evaluator. Videre potensialet forBias eksisterer i studier som ikke er blindet riktig. Sholl analysemetoden gir en effektiv protokoll for nøyaktig kvantifisering av bryst epithelial forgreningstetthet og forgreningskompleksitet, diskrete morfologiske egenskaper ved utvikling av brystkjertel, som lett kan sammenlignes på tvers av studier og laboratorier.

Det er kritiske trinn i flere deler av denne protokollen. Den første og viktigste relaterer seg til tilstanden til brystkjertelen hele fjellet. Nøyaktigheten av denne metoden er avhengig av en brystkjertel som er samlet helt intakt, montert uten mangler, riktig fast og farget, og viser ingen oksidasjon av kjertelen eller betydelig misfarging av monteringsmediet. Hvis kjertelen er revet eller brettet, kan det ikke oppnås en nøyaktig måling av forgreningsdensiteten. Hvis duktaleendene ikke er tilstede, vil verdien for k ikke være representativ for hele kjertelen. Terskelen vil være vanskelig i kjertleneSom ikke har blitt fullstendig på grunn av mangel på fargekontrast i ductalepitelet. Og til slutt, hvis oksidasjon eller misfarging er tilstede, kan disse flakene hindre at analysen måler kryss i det berørte området.

Når det er utarbeidet egnede helmounts, er det neste kritiske trinnet å fange bildene med samme forstørrelse. Det er vanlig å fange digitale bilder med høyest mulig oppløsning. For Sholl-analysen er det imidlertid viktigere at alle bilder fanges med samme forstørrelse. Som beskrevet i Stanko et al. (2015) 3 ble det oppdaget et forbehold hvor bilder av mindre kjertler fanget ved høy forstørrelse viste større forgreningsdensiteter enn bilder av større kjertler fanget ved lavere forstørrelse, selv om de visuelt syntes å være mindre utviklede. Vi antydet at den høyere forstørrelsen ga mer detaljert, som førte over til tHan skeletoniserte bildet og resulterte i en høyere N, som overrepresenterte forgreningsdensiteten til de mindre kjertlene. Dette problemet er lindret ved å fange alle bilder med samme forstørrelse.

Mens grunnlaget for en nøyaktig analyse ligger innenfor hele monteringen, ligger det største potensialet for brukerpåvirkede endringer i skjæringsdata innenfor trinnene for støyfjerning. Alle bilder inneholder støy, til en viss grad, på grunn av fargestyrke, ikke-relevante fysiologiske enheter ( f.eks. Blodårer) og gjenstander av terskel. Hvert bilde må adresseres selvstendig på grunn av variasjoner i mengden støy mellom bilder. Det må tas hensyn til ikke å fjerne for lite eller for mye støy, da dette kan skje antallet kryss og dermed forgreningsdensiteten. Imidlertid er omfanget av støy som påvirker tolkningen ikke undersøkt. Brukeren bør bestemme hvor nøyaktig å være med støyfjerning og bør også utøve konsisTency for å opprettholde integriteten til bildene. Det anbefales sterkt at brukeren blindes til behandling når det utføres støyfjerning, da dette vil minimere potensialet for bias. Støyfjerning er beskrevet i detalj i ImageJ Brukerhåndbok 7 . I denne prosedyren fjernes støy primært fra det bakgrunnstrekkede bildet. I tillegg kan terskelprosessen i seg selv fjerne segmenter av kjertelen. Deler av kjertelen hvor bare noen få piksler er fjernet, vil bli rekonstruert automatisk når det skjelettede bildet er utvidet. Ekspansive hull kan imidlertid kreve manuell gjenoppbygging. Brukeren skal avgjøre om og i hvilken grad å rekonstruere disse segmentene, igjen opprettholde integriteten til de opprinnelige bildene.

Selv om dette ikke er kritisk, er det viktig å vedlikeholde programvareoppdateringer, da ImageJ-programvaren oppdateres ofte. Metodene beskrevet her er basert på versjon 1.48v. FIJI og Sholl aNalysis plugin oppdateres også jevnlig, og protokollen som er beskrevet her er basert på v3.4.1. Endringer i senere versjoner av både ImageJ og Sholl Analysis-plugin kan påvirke disse metodene. ImageJ sjekker automatisk for oppdateringer, men oppdateringer for FIJI bør gjennomføres jevnlig, og endringer mellom gjeldende versjoner og de som benyttes her, bør adresseres etter behov. Alle parametere er definert i underposisjoner på Sholl Analyses nettside 6 . Parameterinnstillinger i denne prosedyren er basert på bilder tatt fra brystkirtler i hele laboratoriet og ikke absolutt. Hele fjellet forberedelse varierer fra lab til lab, og disse parametrene kan justeres tilsvarende for å optimalisere bilder og utdata.

Mammekirtlen i hele studien var brukt fra en kvinnelig Sprague Dawley-rotte ved PND 25, og metoden ble påført hensiktsmessig og uten begrensninger. Hos rotter, øker bronkitepiteldensitetenReagerer med alder til et punkt der det forhindrer terskelen av bildet med høy nok oppløsning for å skape et nøyaktig skjelettbildet av kjertelen. Derfor anbefaler vi for tiden ikke å bruke denne metoden på kjertler fra rotter eldre enn PND40. Selv om rottestammen er blitt indikert her, er det irrelevant, da forfatterne for øyeblikket ikke er klar over noen stamme-spesifiserte brysttrekk som ville forhindre bruken av denne metoden. Videre, mens metoden beskrevet i det ble utført ved bruk av en kvinnelig rotte, kunne den også påføres på brystkjertlene av hannrotter. Denne applikasjonen har også blitt brukt effektivt med hele muse av mus (Deirdre Tucker, personlig kommunikasjon) og bør være egnet for mus i alle aldre, da brystkjertler i mus ikke vokser så tette som hos rotter. Det er imidlertid to begrensninger ved bruk av denne applikasjonen i mus: 1) det kan være for få forgreningskryss i yngre mus for å oppdage signifikante forskjeller og 2) denne metoden kan ikkeT påføres hanmus, da de ikke viser brystepitel. Uansett er denne automatiserte metoden raskere, objektiv og mye mindre arbeidsintensiv enn å telle forgreningspunktskryssinger manuelt.

Det er mulig at etterforskere kan ønske å bruke brystkjertelen for andre eksperimentelle teknikker, som for eksempel unormale strukturer eller for immunhistokjemi (IHC). Selv om Tucker et al. (2016) har beskrevet en fremgangsmåte for å fremstille en hematoksylin-eosin-farget seksjon fra en mus-brystkjertel i helhet, 8 vi vurderer vanligvis å skape en helmontering som en terminalprosess, og vet ikke om metoder for bruk av en hel- Montert brystkirtel for ytterligere følsomme analyser, slik som IHC- eller TUNEL-analyser. Hvor følsomme analyser som bruker brystkjertelvev, kreves i forbindelse med helmounts, anbefales det å bruke de kontralaterale brystkjertlene.

Mammekirtlen fortsetter tO være fokuspunkt i et økende antall studier, men forskjeller på tvers av laboratorier finnes i både fullmontert forberedelse 9 , 10 , 11 , 12 og utviklingsvurderinger 13 , 14 , 15 . Modifikasjonen av Sholl-analysen som er beskrevet her, gir en standardisert metode for målkvantifisering av forgreningsdensitet, en viktig egenskap ved utvikling av brystkjertel, i gnagekjertelen. Denne metoden kan brukes på brystfyllinger av mannlige eller kvinnelige gnagere, og selv om det for tiden anbefales til bruk i bare tidlige postnatale til peripubertalkjertler fra rotter, kan den brukes på brystkjertler fra mus i alle aldre. Søknaden er spesielt egnet for brystkirtler samlet fra peripubertal gnagere, da denne perioden er anbefaltSluttpunkt for fullstendig preparering av brystkreft i test-retningslinjestudier. Optimalisering av denne metoden for bruk i tettere brystkirtler hos voksne rotter vurderes for tiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) for hans hjelp med validering av denne metoden og Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canada) for hans kontinuerlige Hjelp med Sholl-søknaden.

Materials

Innkapslingsradius (mm) MEA (mm2) N k Forgreningsdensitet (N / mm2)
7.4 71.7 2381 0,73 33.2
Name Company Catalog Number Comments
Dissecting board NA NA A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins Daigger EF7419A
Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors Fine Science Tools 14569-09
Straight dissecing scissors Fine Science Tools 14568-09
Curved forceps Fine Science Tools 11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001 Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm Fisher scientific 12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher scientific 13-374-12
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)  Sigma-Aldrich 24102
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Carmine alum  Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate  Sigma-Aldrich A6435
Permount mounting media Fisher Scientific SP15
Macroscope Leica Z16 APO  This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera Leica DFC295
Camera software Leica Leica Application Suite v3.1 
ImageJ software Open source http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis  Open source http://imagej.net/Sholl_Analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
  2. Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
  3. Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
  4. Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
  5. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
  6. Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from: http://imagej.net/Sholl_Analysis (2012).
  7. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012).
  8. Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
  9. Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
  10. Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
  11. Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
  12. Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
  13. Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
  14. Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
  15. Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 125 mammakjertel Sholl analyse reproduktiv helmontering toksikologi rotte modell
Kvantifiserende forgreningstetthet i rotte Mammary Gland Whole-mounts ved hjelp av Sholl analysemetoden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stanko, J. P., Fenton, S. E.… More

Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter