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Developmental Biology

शूल विश्लेषण पद्धति का उपयोग करते हुए चूहा स्तन ग्रंथक पूरे माउंट में शाखाओं की घनत्व को बढ़ाते हुए

Published: July 12, 2017 doi: 10.3791/55789
Automatic Translation
1, 1
1National Toxicology Program Laboratory, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

Summary

कृन्तक में स्तन ग्रंथि का विकास आम तौर पर वर्णनात्मक मूल्यांकनों का उपयोग करके या बुनियादी भौतिक विशेषताओं को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया है। शाखा घनत्व स्तन विकास के एक संकेतक है जो निष्पक्ष रूप से मापने के लिए मुश्किल है। यह प्रोटोकॉल स्तन ग्रंथि शाखाओं की विशेषताओं के मात्रात्मक आकलन के लिए एक विश्वसनीय पद्धति का वर्णन करता है।

Abstract

एक रासायनिक विस्तार की विकासशील विषाक्तता का आकलन करने के लिए एक बढ़ती हुई संख्या में कृत्रिम स्तन ग्रंथि का समापन बिंदु के रूप में उपयोग किया जा रहा है। स्तन के ग्रंथि विकास पर इन एक्सपोज़र्स के प्रभावों को आम तौर पर बुनियादी आयामी मापन या रूपात्मक विशेषताओं को स्कोरिंग करके मूल्यांकन किया जाता है। हालांकि, विकासात्मक परिवर्तनों की व्याख्या के लिए व्यापक तरीकों से प्रयोगशालाओं में असंगत अनुवाद हो सकते हैं। आकलन की एक सामान्य विधि की जरूरत है ताकि अध्ययनों में तुलना किए जा रहे आंकड़ों से उचित व्याख्याएं बनाई जा सकें। वर्तमान अध्ययन स्तन ग्रंथि शाखाओं की विशेषताओं को मापने के लिए शोल विश्लेषण विधि के आवेदन का वर्णन करता है। शोल पद्धति मूल रूप से न्यूरोनल वृक्ष के समान पैटर्न को मापने में उपयोग के लिए विकसित की गई थी। ImageJ, एक खुला स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके, और इस विश्लेषण के लिए विकसित एक प्लगइन, स्तन ग्रंथि शाखाओं घनत्व और की जटिलता हूँएक पेरिपुबर्टल मादा चूची से एमीरी ग्रंथि निर्धारित की गई थी। यहाँ वर्णित विधियां स्तन ग्रंथि विकास के एक महत्वपूर्ण लक्षण को मापने के लिए प्रभावी उपकरण के रूप में शोल विश्लेषण का उपयोग करने में सक्षम होगी।

Introduction

स्तन ग्रंथि शाखाएं एक विशेषता है जिसे सामान्यतः ग्रंथि के विकास के एक संकेतक के रूप में मूल्यांकन किया जाता है, लेकिन निष्पक्ष मात्रा में मापना मुश्किल है। 1 9 53 में, शोल 1 ने बिल्ली के दृश्य और मोटर कॉरटेस में न्यूरोनल वृक्ष के समान आकृति को मापने के लिए एक विधि का वर्णन किया और इस तकनीक का एक प्लगरी फेरिएरा एट अल 2 द्वारा विकसित किया गया था। क्योंकि दोनों न्यूरॉन्स और स्तन ग्रंथियां एक समान वृक्ष की तरह की संरचना को प्रदर्शित करते हैं, प्लगइन पेरीपाउबरल चूहे स्तन ग्रंथि के 2 डी छवियों में स्तन उपकला शाखाओं में घनत्व को मापने के लिए नियोजित किया गया था। पेरिप्यूबरल अवस्था का विश्लेषण करने के लिए चुना गया था क्योंकि दूध पिलाने का एक जीवन स्तर है जिसे अक्सर अकादमिक प्रयोगशालाओं में मूल्यांकन किया जाता है और परीक्षण दिशानिर्देशों का अध्ययन किया जाता है। शोल विश्लेषण फ़ेजी के साथ वितरित एक प्लगइन है, जो ओपन-सोर्स इमेज प्रोसेसिंग पैकेज इमेजजे है, जिसमें अतिरिक्त प्लगइन्स शामिल हैं। प्लग-इन एक प्रीफेफ के घेरे में घूमने वाले घने रिंगों की एक श्रृंखला बनाता हैIned केंद्र (आमतौर पर एक न्यूरॉन के सोम या एक स्तन ग्रंथि की प्राथमिक नलिका की उत्पत्ति) और ऑब्जेक्ट के बाहरी हिस्से (विस्तारित त्रिज्या) तक फैली हुई है। यह तब चौराहों की संख्या (एन) की गणना करता है जो प्रत्येक अंगूठी पर होते हैं। प्लगइन एक शोल प्रतिगमन गुणांक ( के ) भी देता है, जो उपकला शाखाओं के क्षय की दर का माप है।

ImageJ का उपयोग करते हुए, एक स्तन ग्रंथि पूर्ण-माउंट की एक कंकाल वाली छवि बनाई जाती है और स्तन उपकला क्षेत्र (MEA) मापा जाता है। शोल विश्लेषण प्लगइन का उपयोग करके छवि का विश्लेषण किया गया है, और एन और कश्मीर के मूल्यों, यहां उपयोग किए जाने वाले अन्य मूल्यों के साथ, लौटाए गए हैं। स्तन उपकला शाखाओं का घनत्व एन / एमईए की गणना के द्वारा निर्धारित किया जाता है। ग्रंथियों के उपकला के बाहरी क्षेत्रों में जो शाखाएं जारी रहती हैं वह शाखाएं शाखाओं की जटिलता है और वर्दी के बाहर का उपकला वृद्धि का एक संकेत है। के रूप में कश्मीर epith में बाहर की कमी का एक उपाय हैएली ब्रांचिंग, यह शाखाओं की जटिलता का एक प्रभावी उपाय है और स्तन विकास के एक विश्वसनीय संकेतक है।

इस प्रोटोकॉल में स्तन ग्रंथि पूरे माउंट के कंकालयुक्त चित्र बनाने और पेरिपुबर्टल नर और मादा की चूहों में स्तन शाखाओं की विशेषताओं का मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए कंप्यूटर-सहायता पद्धति का वर्णन किया गया है। यह विधि अपेक्षाकृत तेजी से है और विशेष माइक्रोस्कोपी उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है। स्टैंको एट अल में इस विधि का विकास और सत्यापन किया गया है (2015) 3 यह रिपोर्ट भी चूहा स्तन ग्रंथि की तैयारी = पूरे mounts एसेसिस एट अल में इसी तरह के स्तन-समरूप माउंट प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है । (2010) 4 और प्लान्ट एट अल (2011) 5

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Protocol

इस अध्ययन के लिए सभी जानवरों के उपयोग और प्रक्रियाएं एनआईईएचएस प्रयोगशाला पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित की गईं और प्रयोगशाला की पशु देखभाल-मान्यता प्राप्त सुविधा के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन में आयोजित किया गया।

1. एक्साइज़ स्तन ग्रंथियां

  1. एक xylene-proof विधि (पेंसिल सबसे अच्छा काम करता है) का उपयोग करके सभी स्लाईडों को प्री-लेबल करें लेबल को संरक्षित करने के लिए अंत में बढ़ते समाधान के साथ उन्हें कवर करें
  2. एक संस्थागत पशु देखभाल और प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित विधि द्वारा पशुओं को कुचलाते हैं।
  3. इच्छामृत्यु के बाद, एक विदारक बोर्ड ( चित्रा 1 ) पर अपनी पीठ पर जानवर को जगह। पीछे के अंगों के साथ एक उल्टे वी (पकड़े पिन या छोटे-गेज सुई अच्छी तरह से काम करते हैं) के साथ सभी चार अंगों को खींचो और पिन करें।
  4. पेट की स्तनमय नमूने से बालों को रखने के लिए 70% इथेनॉल के साथ उदारतापूर्वक स्प्रे करें।
  5. संदंश का उपयोग करना, पेट की त्वचा को मिडलाइन पर खींचें और एक छोटी सी चीज के साथकैंची विदारक, सावधान रहना peritoneum पंचर नहीं
    1. चीरा से शुरू होकर, त्वचा को गर्दन क्षेत्र तक काट कर और उसके बाद के अंग को आगे के अंग में। एक तरफ पीछे के अंग के पहले संयुक्त तक संघीय क्षेत्र में कट जाता है; यह चीरा आमतौर पर स्तन ग्रंथियों 5 और 6 को अलग करती है। पेरिटोनियम काटने से बचें।
    2. त्वचा को संदंश का उपयोग करते हुए संलग्न स्तनपायी वसा वाले पैड के साथ खींचें, कैंची को विदारक बनाने के कुंद अंत का उपयोग करके पेरिटोनियम से धीरे से अलग करें। त्वचा के नीचे पर 4 वें और 5 वें इंंजिनल स्तन ग्रंथियों को पूरी तरह से उजागर करना संभव के रूप में दूर तक अलग; विच्छेदन बोर्ड ( चित्रा 2 ) के लिए त्वचा को पिन।
    3. धीरे से घुमावदार संदंश के गोल पक्ष के साथ 5 वें ग्रंथि के स्तन ऊतक को समझें और धीरे-धीरे त्वचा से दूर ग्रंथि को छाँटें, इस ग्रंथि या त्वचा को न निकलना सावधान रहना।
    4. ट्रिम करने के लिए जारी रखें,4 वें और 5 वें ग्रंथियों को पूरी तरह से त्वचा से उठा लिया गया है जब तक dorsally घूम रहा है। सुनिश्चित करें कि निप्पल क्षेत्र को बाकी ग्रंथियों से हटा दिया गया है, क्योंकि यह शोल विश्लेषण के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में कार्य करता है। स्तन ऊतक को शरीर से दूर काटें, जहां यह ग्रंथि 4 पर जुड़ा हुआ है।
  6. एक बार जब ग्रंथि को जानवर से हटा दिया जाता है, तो एक इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से चार्ज किए गए 25 मिमी x 75 मिमी x 1 मिमी सूक्ष्मदर्शी स्लाइड पर समान रूप से फैलता है, जो कि नीचे की ओर स्थित त्वचा के निकट होती है।
    नोट: पुराने या स्तनपान कराने वाले पशुओं से ग्रंथियों के लिए, 51 x 75 x 1 मिमी की स्लाइड की आवश्यकता हो सकती है।
  7. दस्ताने पहने हुए, धीरे से किसी भी हवाई बुलबुले बाहर निचोड़ एक प्लास्टिक पैराफिन फिल्म और एक अन्य सूक्ष्मदर्शी स्लाइड के साथ ग्रंथि को कवर करें और स्लाइड पर इसका पालन करने के लिए ग्रंथि को संपीड़ित करें।
    नोट: पानी से भरा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब एक उपयुक्त वजन के रूप में कार्य करता है। स्लाइड का पालन करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा ग्रंथि की मोटाई पर निर्भर करती है। पतला, पोस्टकाताल दिवस (पीएनडी) 4 ग्रंथियों को कम से कम 30 मिनट के लिए संकुचित किया जाना चाहिए, जबकि मोटा, वयस्क ग्रंथियों को 2-5 घंटे जितना हो सकता है।

2. स्तन संपूर्ण-माउंट तैयार करें

  1. कम से कम 24 घंटे अग्रिम में कार्मेन अल्म समाधान तैयार करें, क्योंकि इसे उबलते और प्रशीतन की आवश्यकता होती है।
    1. 1 ली एल फ्लास्क में 20 मिनट के लिए डिस्टिल्ड वॉटर में 500 मिली लीटर और एल्यूमीनियम पोटेशियम सल्फेट के 2.5 ग्राम (एएलके (एसओ 4 ) 2 · 12 एच 2 ओ) को 1 ग्राम भंग करें। डिस्टिल्ड वॉटर का उपयोग करके अंतिम मात्रा 500 एमएल तक लाओ।
    2. वैक्यूम के तहत फिल्टर पेपर के माध्यम से समाधान फिल्टर करें और भंडारण के लिए सर्द।
      नोट: सीमानी अल्मोल्यूशन का पुन: उपयोग किया जा सकता है, लेकिन रंग को फीका होने पर छोड़ा जाना चाहिए।
  2. निर्धारण से पहले, ग्रंथि को पैराफिन फिल्म छीलकर, सावधान रहना, स्लाइड से ग्रंथि को खींचने के लिए नहीं। एक गिलास स्लाइड-स्लेजिंग जार में स्लाइड (एस) को रखें और लगानेवाला में विसर्जित करें (100% एथानग्रंथियों की मोटाई के आधार पर, 12-48 घंटे के लिए ओल, क्लोरोफॉर्म और हिमनदों एसिटिक एसिड: 6: 3: 1 अनुपात में)।
  3. लगानेवाला बंद करें और 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में ग्रंथियों को भिगो दें धीरे-धीरे 1/3 इथेनॉल समाधान डालने और आसुत जल के साथ इसे बदलकर ग्रंथियों को फिर से फैलाया। 5 मिनट के लिए भिगोएँ इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं
  4. अंतिम कुल्ला के बाद, सभी इथेनॉल / पानी समाधान डालें और इसे 100% आसुत जल के साथ बदलें। 5 मिनट के लिए ग्रंथियों को भिगोएँ
  5. डिस्टिल्ड वॉटर को बंद करें और कार्मेन एलम सॉल्यूशन में ग्रंथियों को विसर्जित करें। मोटाई के आधार पर, 12-24 घंटे के लिए ग्रंथियां दागें।
    नोट: ग्रंथियों को अधिक-दाग नहीं किया जा सकता है, लेकिन कई बैचों के लिए धुंधला समय समान होना चाहिए, ताकि धुंधला तीव्रता समान हो।
  6. कार्माइन अल्म के समाधान को दबाएं और 30 एस के लिए 100% आसुत जल में ग्रंथियों को कुल्ला। धीरे-धीरे 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में उन्हें 15 मिनट के लिए भिगोने, 15 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, और20 मिनट के लिए 100% इथेनॉल एन डी
  7. मोटाई के आधार पर, 12-72 घंटे के लिए एक्सलीन में उन्हें भिगोकर वसा के ग्रंथियां साफ़ करें।
    नोट: ग्रंथियों को पारभासी होना चाहिए (स्पष्ट)। अगर किसी भी अपारदर्शी (सफेद) इलाके रहते हैं, तो पारदर्शी तक xylene में भिगोने जारी रखें। यदि लैक्टेटिंग या अन्यथा बहुत मोटी ग्रंथियों को दाग और साफ किया जा रहा है, तो एक बार जीनस को पूरी तरह से साफ़ करने के लिए एक बार xylene की आवश्यकता हो सकती है।
  8. एक ग्रंथि को कवर करने के लिए पर्याप्त माध्यम pipetting द्वारा एक xylene- आधारित बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड्स माउंट। एक कवरलाप जोड़ें, यह सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले न हो।
  9. स्लाइड्स को सूखा करने की अनुमति दें बढ़ते हुए मध्यम सूख के रूप में, यह कवरलिप के तहत अनुबंध करेगा, और अतिरिक्त बढ़ते माध्यम को जोड़ना आवश्यक हो सकता है। एक बार कोई अतिरिक्त माध्यम की आवश्यकता नहीं है, स्लाइड्स पूरी तरह से सूखने की अनुमति दें; इसमें 2-3 सप्ताह लग सकते हैं
  10. एक बार स्लाइड पूरी तरह से सूखने पर, किसी भी अवशिष्ट बढ़ते माध्यम को कपास झाड़ू के साथ हटाया जा सकता है और थोड़ी सी xylene के साथ। उपयोग करने के लिए सावधान रहेंबहुत अधिक xylene, क्योंकि यह बढ़ते माध्यम को भंग कर सकता है और कंसलिप को ढीला कर सकता है। यदि ऐसा होता है और एयर बुलबुले कंडोलीप के तहत एकत्र किए जाते हैं, तो कवरलाप को xylene में हटा दिया जाना चाहिए और बढ़ते प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए।

3. विश्लेषण के लिए पूरे माउंट चित्र तैयार करें

  1. मैक्रोस्कोप या विदारक माइक्रोस्कोप और उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ एक डिजिटल कैमरा का उपयोग करके संपूर्ण-माउंट की चित्रों को चित्रित करें ( चित्रा 3 )।
    नोट: जबकि पूरे ग्रंथ्युलर एपिथेलियम को कैप्चर करने वाले किसी भी बढ़ाई का चयन किया जा सकता है, लेकिन सभी बड़े-बड़े चित्रों को कैप्चर करना जरूरी है, जो एक दूसरे की तुलना में एक ही बढ़ाई पर होगा।
  2. ImageJ सॉफ्टवेयर (या FIJI सॉफ्टवेयर) डाउनलोड 6
  3. "फ़ाइल" → "ओपन" पर क्लिक करके ImageJ में स्तन संपूर्ण-माउंट चित्र खोलें। मुक्त हाथ उपकरण का चयन करें और ग्रंथियों के उपकला के आसपास का पता लगाएं। "संपादित करें" & # चुनें8594; "बाहर साफ़ करें।"
    1. नोड के चारों ओर ट्रेसिंग और फ्रीहैंड टूल और "संपादित करें" → "कट" का उपयोग करके लिम्फ नोड्स निकालें।
  4. "छवि" → "रंग" → "स्प्लिट चैनल" चुनकर रंग चैनल अलग करें। सर्वश्रेष्ठ कंट्रास्ट के साथ चैनल का चयन करें, आमतौर पर नीले चैनल
    नोट: एक आरजीबी छवि उस छवि के लाल, हरे, और नीले रंग के ढेर के होते हैं। यह क्रिया इन घटकों को तीन 8-बिट ग्रेस्केल चित्रों में अलग करती है
  5. "प्रक्रिया" → "पृष्ठभूमि घटाएं" का चयन करके पृष्ठभूमि घटाएं। इच्छित पैरामीटर चुनें और फिर परिवर्तन का पूर्वावलोकन करने के लिए "पूर्वावलोकन" पर क्लिक करें।
    नोट: "घटाएँ पृष्ठभूमि" चिकनी, निरंतर पृष्ठभूमि को हटाता है इसके अतिरिक्त, इसके विपरीत, "प्रक्रिया" → "फिल्टर" → "असार मुखौटा" का उपयोग किया जा सकता है
  6. वें में से एक को चुनें ई स्वचालित रूप से शोर हटाने के लिए निम्नलिखित विधियों: despeckle या outliers निकालें
    नोट: ImageJ स्वचालित शोर हटाने के लिए एक तीसरा तरीका प्रदान करता है: NaNs को हटा दें हालाँकि, निकालें NaNs आदेश लागू नहीं है क्योंकि यह 32-बिट छवियों का उपयोग करता है, और वर्तमान विधि 8-बिट छवियों का उपयोग करता है।
    1. "प्रक्रिया" → "शोर" → "डेस्पेक्लेल" का चयन करके despeckle आदेश का उपयोग कर शोर निकालें।
      नोट: यह एक औसत फिल्टर जोड़ने के बराबर है, जो प्रत्येक पिक्सेल को अपने 3 × 3 पड़ोस में औसत मूल्य के साथ बदल देता है।
    2. "प्रक्रिया" → "शोर" → "निकालें निकालें" का चयन करके निकास आउटलेरों कमांड का उपयोग करके शोर निकालें।
      नोट: यह प्रक्रिया एक पिक्सेल को तत्काल परिवेश में पिक्सल के मध्य के साथ बदल देती है, अगर यह एक निश्चित मूल्य (थ्रेसहोल्ड) से अधिक के मध्य से विचलित हो जाती है।
  7. मैन्युअल रूप से शेष शोर निकालें (Lass = "xfig"> चित्रा 4)।
    1. मूल छवि की प्रतिलिपि खोलें और इसे किस प्रकार है और क्या शोर नहीं है के लिए एक मार्गदर्शिका के रूप में उपयोग करें। टूलबार के दाईं ओर स्थित डबल-लाल-एरो बटन पर क्लिक करें। ड्राइंग टूल्स का चयन करें; आरेखण उपकरण बटन अब टूलबार में दिखाई देंगे।
    2. इरेज़र टूल पर क्लिक करें। इरेज़र टूल बटन पर राइट-क्लिक करके इरेज़र व्यास समायोजित करें। शोर को मिटाने के लिए बाएं माउस बटन दबाए रखें।
      नोट: मिटा के केवल एक सत्र को पूर्ववत किया जा सकता है। एक बार बाएं माउस बटन को रिलीज़ किया जाता है और फिर क्लिक किया जाता है, तो पिछला मिटाना पूर्ववत नहीं किया जा सकता।
  8. "छवि" → "समायोजित करें" → "थ्रेसहोल्ड" चुनकर सीमा को समायोजित करें। जब तक कि ग्रंथि का पर्याप्त चित्रण प्राप्त नहीं हो जाता तब तक न्यूनतम (ऊपरी स्लाइडर) और अधिकतम (कम स्लाइडर) थ्रेसहोल्ड मान समायोजित करने के लिए स्लाइडर्स को ले जाएं।
    नोट: थ्रेसहोल्ड वैल्यू सेगमेंट सेटिंग छवियों को ब्याज और पृष्ठभूमि की सुविधाओं में स्केल करती है।
    1. लागू करें क्लिक करें यदि आवश्यक हो, तो निम्नलिखित चरणों 3.6.1 और 3.6.2 द्वारा अतिरिक्त शोर निकाल दें।
  9. ग्रंथियों के उपकला के कुछ हिस्सों को पुनर्निर्माण करना जो थ्रेसहोल्डिंग और शोर हटाने ( चित्रा 5 ) द्वारा हटाए गए थे।
    1. मूल छवि की अखंडता को बनाए रखने के लिए छवि पुनर्निर्माण को ध्यान से और न्यूनतम आधार पर व्यवस्थित करें। उपशीर्षक क्या है और क्या नहीं है के संदर्भ के लिए मूल छवि का संदर्भ लें
    2. स्प्रे कैन टूल (ड्रॉइंग टूल के साथ टूलबार पर) पर क्लिक करें। स्प्रे कैन टूल बटन पर राइट-क्लिक करके स्प्रे व्यास और दर समायोजित करें। बाईं माउस बटन पर क्लिक करके या नीचे पकड़कर ग्रंथि के गायब वर्गों को सावधानी से भरें।
  10. शॉल विश्लेषण आयोजित करने के लिए ग्रंथि की एक कंकाल वाली छवि बनाएं। यह सुनिश्चित करें कि थ्रेसहोल्ड छवि "प्रक्रिया" → "बाइनरी" → "बी बनाकर द्विआधारी है inary। "
    1. यदि काली पृष्ठभूमि पर छवि सफेद है, तो "प्रक्रिया" → "बाइनरी" → "विकल्प" चुनें और "काली पृष्ठभूमि" को अनचेक करें। "प्रक्रिया" → "बाइनरी" → "कंकाल हटाना" चुनकर छवि को कंकाल करना।
      नोट: यह बार-बार पिक्सेल को बाइनरी छवि के किनारों से निकालता है, जब तक कि यह एकल-पिक्सेल-चौड़ा आकृति तक कम नहीं हो जाता।
    2. "प्रक्रिया" → "बाइनरी" → चुनकर "छवि को एक बार व्याप्त करें"।
      नोट: यह बाइनरी छवि के किनारों पर पिक्सल जोड़कर थ्रेसहोल्डिंग और कंकालटिंग द्वारा बनाई गई अंतराल को भरता है।
  11. "फ़ाइल" → "इस रूप में सहेजें" चुनकर छवि को सहेजें। एक छवि प्रकार (आमतौर पर जेपीईजी) का चयन करें, फ़ाइल नाम दर्ज करें, और "ठीक है" पर क्लिक करें।
  12. कंकाल वाली छवि को मूल छवि पर ओवरले करने के द्वारा कंकाल की गई छवि की सटीकता की जांच करें (Ass = "xfig"> चित्रा 6)।
    1. मूल छवि और कंकाल की गई छवि दोनों को खोलकर ओवरले बनाएं "छवि" → "ओवरले" → "छवि जोड़ें" चुनें। "छवि जोड़ें" संवाद बॉक्स में, "छवि को जोड़ने के लिए" ड्रॉपडाउन मेनू से कंकाल की छवि का चयन करें और अपारदर्शिता 30% पर सेट करें।
    2. "फ़ाइल" → "इस रूप में सहेजें" का चयन करके कंकाल छवि की छवि को मूल पर ओवरलेक्ड करें। एक छवि प्रकार चुनें, फ़ाइल नाम दर्ज करें, और "ठीक है" पर क्लिक करें।

4. शॉल विश्लेषण का संचालन करें

  1. एक कंकाल छवि खोलें और "प्रक्रिया" → "बाइनरी" → "बाइनरी बनाएं" का चयन करके छवि बाइनरी बनाएं।
    1. आवर्धक पैमाने सेट करने से पहले, चित्रणों को कैप्चर किए जाने वाले आवर्धन के लिए एक सूक्ष्ममीटर का उपयोग करके पिक्सल / मिमी की संख्या को मापें।
    2. मापित आवर्धन सेट करें"विश्लेषण करें" → "सेट स्केल" का चयन करके कॉल करें। पिक्सेल / मिमी की संख्या दर्ज करें "ज्ञात दूरी" और "पिक्सेल पहलू अनुपात," दोनों के लिए 1 सेट करें। "लंबाई की इकाई" के लिए "मिमी" दर्ज करें और "ग्लोबल" चेक करें (प्रत्येक छवि के लिए समान स्केल बनाए रखता है)
  2. ग्रंथियों के उपकला ( चित्रा 7 ) के सबसे बाहरी बिंदु तक प्राथमिक वाहिनी (विश्लेषण के केंद्र) की शुरुआत से एक रेखा खींचकर शोल विश्लेषण के लिए समाप्त त्रिज्या (परिधि को घुमाव) निर्धारित करें।
    1. ब्याज के अंक के बीच एक रेखा खींचने के लिए उपकरण पट्टी में रेखा आरेखण उपकरण का उपयोग करें। मापन लेने के लिए "M" कुंजी दबाएं और नोट करें कि परिणाम विंडो खुल जाएगी।
      नोट: "लंबाई" कॉलम में मान की लंबाई मिमी में है शोल पैरामीटर सेट करते समय यह मान स्वचालित रूप से समापन त्रिज्या के रूप में दर्ज किया जाएगा। शोल प्लगइन प्रारंभिक बिंदु का उपयोग करेगारेखा के रूप में केंद्रित रिंगों के केंद्र के रूप में
  3. शॉल विश्लेषण चलाना
    1. "प्लगइन्स" का चयन करके विश्लेषण चलाएं "उन्नत शॉल विश्लेषण"; एक पैरामीटर विंडो दिखाई देगी।
    2. प्रारंभिक त्रिज्या को "गोले की परिभाषा" से 0.00 मिमी तक सेट करें; चरण 4.2 में मापा रेखा की लंबाई स्वचालित रूप से "अंत में त्रिज्या" के रूप में दर्ज की जाएगी।
    3. 0.1 मिमी के लिए "त्रिज्या चरण आकार" सेट करें
      नोट: त्रिज्या चरण आकार रिंगों की संख्या निर्धारित करता है (प्रभावी रूप से पुनरावृत्तियों की संख्या); एक छोटा कदम आकार की अंगूठी की संख्या में वृद्धि होगी, जबकि एक बड़ा कदम आकार रिंगों की संख्या कम हो जाएगा त्रिज्या को बहुत छोटा नहीं सेट किया जा सकता है, हालांकि अधिक से अधिक छोटा त्रिज्या के परिणामस्वरूप अनावश्यक रूप से बड़ी मात्रा में छल्ले होंगे। हालांकि, इसे बहुत बड़ा सेट किया जा सकता है, जिससे कम रिंग बनेगी और बाद में वास्तविक संख्या चौराहों को कम नज़रअंदाज़ कर देगा। Stanko एट अल को देखें(2015) चरण आकार निर्धारित करने के बारे में अधिक जानकारी के लिए।
    4. "# नमूनों" को 1 और "एकता" को "मीन" में "द्वितीय। अनेक नमूने प्रति त्रिज्या" में सेट करें।
    5. "समापन त्रिज्या कटऑफ" को 1 में सेट करें और "III प्रारंभिक शाखाओं" में "III। डिस्क्रिप्टर और कर्व फिटिंग" के लिए "शुरुआती त्रिज्या से अनुमान लगाएं" चुनें।
      नोट: वांछित के रूप में "फ़िट प्रोफ़ाइल और डिटेक्टरों की गणना करें" और "फिटिंग विवरण दिखाएं" चेक किया जा सकता है
    6. "रैखिक" की जांच करें और "बिना सामान्यीकृत प्रोफाइल" में "सर्वश्रेष्ठ फिटिंग डिग्री" का चयन करें; "अधिक जानकारीपूर्ण" की जांच करें। "चतुर्थ शोल पद्धतियों" में "सामान्यीकृत प्रोफ़ाइल का क्षेत्र" चुनें।
    7. चौराहों (वैकल्पिक) का एक गर्मी का नक्शा बनाने के लिए "वी। आउटपुट विकल्पों" में "इंटरसेक्शन मास्क बनाएं" चेक करें।
    8. क्षेत्र की पुष्टि करने के लिए रिंग के साथ चित्र की एक पूर्वावलोकन विंडो तैयार करने के लिए "सीएफ। सेगमेंटेशन" पर क्लिक करेंविश्लेषण का
  4. विश्लेषण चलाने के लिए "ओके" पर क्लिक करें

5. विदेश मंत्रालय की माप

  1. उपकला पेड़ ( चित्रा 8 ) के चारों ओर सबसे कम दूरी का पता लगाकर विदेश मंत्रालय को मापें।
    1. ग्रंथि के कंकाल की छवि के साथ ImageJ में खुला, बहुभुज उपकरण पर क्लिक करें। बहुभुज को शुरू करने के लिए उपकला के पेड़ की परिधि पर एक बिंदु पर क्लिक करें, ग्रंथि की परिधि के चारों ओर घूमो, और एक रेखा खंड जोड़ने के लिए क्लिक करें
    2. जब पूरे उपकला क्षेत्र को बाधित किया गया है, बहुभुज को बंद करने के लिए डबल क्लिक करें परिणाम विंडो खोलने के लिए "M" कुंजी दबाएं; "क्षेत्र" कॉलम में मान विदेश मंत्रालय है।
  2. ऐसे मामलों में जहां ग्रंथियों के उपकला लिम्फ नोड से अधिक विस्तारित हो गई है, शाखाओं की घनत्व की गणना करते समय एमईए से लसीका नोड क्षेत्र (एलएनए) को घटाना।
    1. उसी मनुष में लिम्फ नोड को अनुरेखण करके एलएनए को मापेंएरी उपकला पेड़ के रूप में और दबाकर "एम।"
      नोट: एलएनए को इन मामलों में विदेश मंत्रालय से घटाया जाना चाहिए क्योंकि लिम्फ नोड एलएनए के भीतर अंतरों की गिनती से विश्लेषण को रोकता है। जब एपिथेलियम लिम्फ नोड तक नहीं पहुंचा, तो एलएनए शून्य है।

6. रिपोर्टिंग डेटा

  1. संलग्न परिधि, विदेश मंत्रालय, एन, के , और शाखाओं के घनत्व के लिए मूल्यों की रिपोर्ट करें।
    नोट: संलग्न परिधि चरण 4.2 में निर्धारित किया गया है और विदेश मंत्रालय को चरण 5.1 में निर्धारित किया गया है।
    1. शॉल परिणाम विंडो बनाने के लिए विश्लेषण चलाएं।
      नोट: रिपोर्ट एन राशि के लिए मूल्य है inters। रिपोर्ट किया गया कश्मीर शोल प्रतिगमन गुणांक (अर्द्ध-लॉग) के लिए मूल्य है। शोल विश्लेषण ग्रंथियों के उपकला के किसी भी मापा क्षेत्र पर कश्मीर के लिए एक मूल्य वापस करेगा। पूर्ण एपिथेलियम पर कश्मीर के लिए एक सटीक मूल्य प्राप्त करने के लिए, डक्टल सिरों मौजूद होना चाहिए।
    2. संशोधित करें वेंशाखा के घनत्व (इस पद्धति का मूल समापन बिंदु) की गणना करने के लिए एन के आउटपुट मूल्य का उपयोग करके स्तन ग्रंथि के लिए ई शोल विश्लेषण। फार्मूला एन / (विदेश मंत्रालय-एलएनए) का उपयोग करके शाखाओं की घनत्व की गणना करें और एन / एमएम 2 के रूप में मूल्य की रिपोर्ट करें।

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Representative Results

मापा प्रोटोकॉल में विश्लेषण किए गए स्तन ग्रंथि के लिए मापा घिरे त्रिज्या, विदेश मंत्रालय, एन, कश्मीर , और गणना शाखाओं के घनत्व के लिए मूल्य तालिका 1 में सूचित किया गया है। शोल विश्लेषण प्रत्येक त्रिज्या ( चित्रा 9 ) पर चौराहों की संख्या के रैखिक और अर्द्ध-लॉग भूखंडों को तैयार करता है और यदि चयनित होता है, तो चौराहों का एक हिट मैप ( चित्रा 10 )। कम विकसित ग्रंथियां एक ही विदेश मंत्रालय में कम अंतरार्पण को दर्शाती हैं और इसलिए कम शाखाएं घनत्व है। एक अच्छी तरह से विकसित ग्रंथि संपूर्ण ग्रंथियों के उपकला में एक समान रूप से शाखाएं जारी रखेगा, विशेष रूप से बाहर के क्षेत्रों में। इन क्षेत्रों में जो शाखाएं जारी रहती हैं, उन्हें शाखा की जटिलता के रूप में वर्णित किया जा सकता है और जटिलता में कमी को क्षय (या शोल प्रतिगमन गुणांक, कश्मीर ) की दर के रूप में बताया जाता है। क्षय की दर बाह्य उपकला ब्रा में परिवर्तन को दर्शाती हैNching और संलग्न चौखटे ( यानी, उपकला का अनुदैर्ध्य विकास) के खिलाफ लगाए गए चौराहों की संख्या की रेखा के ढलान के रूप में मापा जाता है। इस प्रकार, शोल प्रतिगमन गुणांक रेडियल दूरी (आर) बनाम लॉग (एन / एस) की साजिश की रेखा के ढलान को ले कर गणना की जाती है, जहां लॉग (एन / एस) = - कश्मीर आर + एम, एन के साथ त्रिज्या आर और क्षेत्र एस (πr 2 ) के प्रत्येक अंगूठी के लिए चौराहों की संख्या, और मी अवरोधक होने के लिए। चूंकि ढलान - कश्मीर चौराहों के क्षय का वर्णन करता है, - k = 0 का मूल्य, क्षय के संकेत और उपकला के किनारे तक विश्लेषण के केंद्र से समान शाखाओं को दर्शाता है। कम विकसित ग्रंथियों में, क्षय की शाखा बढ़ जाती है; उपकला पेड़ के बाहर के क्षेत्र में कम अंतर हैं; और ढलान, कश्मीर , वृद्धि हुई है। इसलिए, कश्मीर के करीब आने वाले 0 मूल्य अधिक से अधिक दूरदराज के शाखाओं ( यानी, जटिलता की शाखाएं) और एक अच्छी तरह का संकेत है- विकसित स्तन ग्रंथि

आकृति 1
चित्रा 1: वेंट्रल व्यू एक वयस्क महिला स्प्रैग डावेली चूहे के उदर भाग की छवि, जिसमें विदारक सतह पर चूहे को सुरक्षित करने और निपल्स के साथ 12 स्तन ग्रंथियों के स्थान पर चक्कर लगाने के लिए वर्णन किया गया था। * ग्रंथियों 6 और 7 के निपल्स दिखाई नहीं दे रहे हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: महिला चूहा स्तन ग्रंथि त्वचा के साथ उजागर स्तनमय ग्रंथियों 4 (एमजी 4) और 5 (एमजी 5) का चित्र, एमजी 4 से ऊपर विच्छेदन की सतह पर टिकी और एमजी 5 से नीचे। ग्रंथियों को एसएपी से हटा दिया जाना चाहिए एमजी 5 के साथ शुरुआत में और एमजी 5 और 4 पूरी तरह से हटा दिए जाने तक लगातार जारी रहेगा। निप्पल ग्रंथि 4 के बाहर के क्षेत्र में है, और इस क्षेत्र को एकत्र करने के लिए देखभाल का प्रयोग किया जाना चाहिए। लिम्फ नोड संदर्भ के लिए संकेत दिया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: स्तन ग्रैंड पूरे माउंट। प्रसव के बाद से 25 महिला स्प्रेग दावेली चूहे से एकत्रित एक स्तन ग्रंथि की एक पूरी माउंट छवि। स्केल बार = 1 मिमी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

.jpg "/>
चित्रा 4: शोर हटाने एक स्तन पूरे माउंट छवि का नीला रंग चैनल, पृष्ठभूमि के साथ घटाया। ( ए ) शोर के साथ उदाहरण दर्शाता है। तीर रक्त वाहिकाओं द्वारा बनाई गई शोर को इंगित करते हैं, और डक्टल सिरों के आसपास के और अधिक बड़े आकार का क्षेत्र पृष्ठभूमि से घटाकर बनाये गये शोर का एक उदाहरण है। ( बी ) शोर हटाने के बाद छवि को दिखाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: छवि पुनर्निर्माण। थ्रेसहोल्ड छवि के मिटाए गए भागों के पुनर्निर्माण। ( ए ) लाल तीर क्षेत्रों को इंगित करते हैं जहां थ्रेशोल्डिंग के कारण छवि का भाग खो गया था। छवि पुनर्निर्माणइन क्षेत्रों में रद्दीकरण किया जाना चाहिए ( बी ) हटाए गए क्षेत्रों के पुनर्निर्माण के बाद स्तन प्रतिमा। छवि पुनर्निर्माण को ध्यान से और न्यूनतम आधार पर व्यवस्थित किया जाना चाहिए ताकि मूल छवि की अखंडता को बनाए रखने के लिए कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्र 6: एक कंकालयुक्त छवि का ओवरले। उपरिशायी छवि, एक कंकाल वाली छवि को मूल पूरे-माउंट चित्र पर ढंक कर दिखाती है। यह छवि दर्शाती है कि कंकाल वाली ग्रंथि वास्तविक ग्रंथि की शाखाओं को उच्चतम सटीकता के साथ दर्शाती है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 7: त्रिज्या को जोड़ना एक मार्मिक पूरे माउंट की कंकाल की गई छवि जहां दिखाए जाने वाले त्रिज्या मापा जाता है (पीला)। लाइन उपकला पेड़ (विश्लेषण केंद्र) के आधार पर शुरू होनी चाहिए और एपिथेलियम के सबसे बाहरी बिंदु तक बढ़नी चाहिए। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

आंकड़ा 8
8 चित्रा: स्तन उपकला क्षेत्र विदेश मंत्रालय की स्थापना के लिए एपिथेलियल ट्री के चारों ओर एक बहुभुज का पता लगाकर चित्रित चित्र। कृपया एक बड़ा देखें देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के सायन

9 चित्र
9 चित्र: शोल प्लाट आउटपुट प्रत्येक रेडियल वृद्धि पर चौराहों की संख्या के रैखिक ( ए ) और अर्ध-लॉग ( बी ) भूखंडों का शोल आउटपुट। पैनल में लाल डॉट (ए) केन्द्रक (ज्यामितीय केंद्र) का अफसर है पैनल (बी) में, नीली रेखा पूरी तरह से डेटा के ऊपर रैखिक प्रतिगमन है, जबकि लाल रेखा 10 वीं -90 वें प्रतिशतक पर रैखिक प्रतिगमन है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 10
10 चित्रा: चौराहों मास्क जब "बनाएँ इंटरअनुभाग मास्क "विकल्प का चयन किया गया है (चरण 4.3.7), विश्लेषण छवि के घिरे त्रिज्या भर में चौराहों की संख्या का एक गर्मी का नक्शा देगा.इस गर्मी का नक्शा उपकला भर में चौराहों की शाखाओं के घनत्व को दर्शाता है (लाल = गर्म = उच्च घनत्व, नीले = ठंड = कम घनत्व)। पूरे एपिथेलियम एक छवि के गर्मी के नक्शे में एक ही रंग होगा जहां k = 0। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

</ तालिका>

तालिका 1: शॉल विश्लेषण पैरामीटर मूल्य शोल विश्लेषण के लिए रिपोर्ट किए गए डेटा हैं। एनक्लोजिंग त्रिज्या (चरण 4.2) और विदेश मंत्रालय (चरण 5.1) मूल्यों को मापा जाता है, एन और कश्मीर शोल विश्लेषण के परिणाम होते हैं और शोल विश्लेषण परिणाम विंडो (चरण 6.1) में वापस आते हैं, और शाखाओं की घनत्व को सूत्र के आधार पर गणना की जाती है N / ( विदेश मंत्रालय-एलएनए) (चरण 6.1.2)।

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Discussion

जन्म से यौवन तक, स्तन ग्रंथि वृद्धि सभीोमेट्रिक है यौवन के बाद, स्तन ग्रंथि व्यापक नलिकात्मक शाखाओं और बढ़ाव के माध्यम से विकसित होती है, जब तक कि स्तन उपकला पूरी वसा वाले पैड पर नहीं रह जाती। शाखाओं की विशेषताओं स्तन ग्रंथि के विकास का एक महत्वपूर्ण पहलू है, और इन विशेषताओं को निष्पादित करने की क्षमता सामान्य स्तन वृद्धि के मूल्यांकन के लिए और स्तन कैंसरों के प्रारंभिक जीवन एक्सपोजर के बाद असामान्य विकास की पहचान करने के लिए अत्यधिक उपयोगी हो सकती है।

स्तन संबंधी विशेषताओं को बढ़ाते हुए, बुनियादी आयामी माप की मात्रा निर्धारित करना, और स्तन संरचनाओं की गणना करना स्तन ग्रंथि विकास के मूल्यांकन के लिए विशिष्ट तरीके हैं। हालांकि, इन विधियां विशेष रूप से संवेदनशील नहीं हैं क्योंकि आकार में काफी भिन्नता और कृंतक स्तन ग्रंथियों के आकार और विकासात्मक व्याख्या एक अनुभवहीन मूल्यांकनकर्ता के लिए मुश्किल हो सकती है। इसके अलावा, के लिए संभावितपूर्वाग्रह पढ़ाई में मौजूद है जो ठीक से अंधा नहीं कर रहे हैं। शोल्ल विश्लेषण पद्धति स्तन पूरक उपकला घनत्व और शाखाओं की जटिलता, स्तन ग्रंथि विकास की असतत आकृति विज्ञान विशेषताओं की सही मात्रा निर्धारित करने के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल प्रदान करती है, जिसे आसानी से अध्ययन और प्रयोगशालाओं के बीच तुलना की जा सकती है।

इस प्रोटोकॉल के कई खंडों के भीतर महत्वपूर्ण कदम हैं। पहला और सबसे महत्वपूर्ण स्तन ग्रंथि की स्थिति से संबंधित है पूरे माउंट। इस पद्धति की सटीकता एक स्तन ग्रंथि पर निर्भर करती है जो पूरी तरह से अक्षुण्ण एकत्रित होती है, कोई दोष नहीं, ठीक से तय और दाग के साथ घुड़सवार, और ग्रंथि का कोई ऑक्सीकरण या बढ़ते माध्यम के महत्वपूर्ण मलिनकिरण को दर्शाता है। अगर ग्रंथि फाड़ या जोड़ कर जाती है, तो शाखाएं घनत्व का एक सटीक उपाय नहीं प्राप्त किया जा सकता है। यदि डक्टल सिरे मौजूद नहीं हैं, तो कश्मीर का मान पूरे ग्रंथि का प्रतिनिधि नहीं होगा। ग्रंथियों में थ्रेसहोल्ड करना मुश्किल होगाजो डक्टिकल एपिथेलियम में धुंधलापन की कमी के कारण पूरी तरह से तय नहीं हुआ है। और अंत में, यदि ऑक्सीकरण या मलिनकलन मौजूद है, तो ये दोष इन क्षेत्रों से संबंधित क्षेत्र में अंतर को मापने से विश्लेषण को रोक सकता है।

जब उपयुक्त पूर्ण-माउंट तैयार किए गए हैं, तो अगले महत्वपूर्ण चरण छवियों को उसी आवर्धन पर कैप्चर कर रहे हैं। संभवतः उच्चतम संकल्प पर डिजिटल चित्रों को कैप्चर करने के लिए यह आम बात है हालांकि, शोल विश्लेषण के लिए, यह अधिक महत्वपूर्ण है कि सभी छवियों को एक ही बढ़ाई पर कब्जा कर लिया जाए। जैसा कि Stanko एट अल में वर्णित (2015) 3 , एक चेतावनी की खोज की गई जहां उच्च वृहदी पर कब्जा कर लिया गया छोटे ग्रंथियों की छवियों में कम बढ़ाई हुई बड़ी ग्रंथियों की छवियों की तुलना में अधिक शाखाओं की घनत्व दिखाई गई, भले ही वे दृष्टिहीन रूप से कम विकसित हो गए। हमने अनुमान लगाया कि उच्च बढ़ाई के परिणामस्वरूप अधिक से अधिक विस्तार हुआ, जो कि टी में अधिक हो गयाउन्होंने छवि को कंकालित किया और एक उच्च एन में हुई, जो छोटे ग्रंथियों की शाखाओं की घनत्व का प्रतिनिधित्व करते थे। यह समस्या एक ही आवर्धन पर सभी छवियों को कैप्चर करके कम कर दी गई है।

हालांकि सटीक विश्लेषण का आधार संपूर्ण-माउंट के भीतर है, शोर को हटाने के लिए कदमों के भीतर अंतर-स्थान डेटा में उपयोगकर्ता-प्रभावित परिवर्तनों की सबसे बड़ी संभावना है। सभी छवियां धुंधला तीव्रता, गैर-प्रासंगिक शारीरिक संस्थाओं ( जैसे, रक्त वाहिकाओं) और थ्रेशोल्डिंग के कलाकृतियों के कारण कुछ हद तक, शोर शामिल हैं। छवियों के बीच शोर की मात्रा में भिन्नता के कारण प्रत्येक छवि को स्वतंत्र रूप से संबोधित किया जाना चाहिए देखभाल को बहुत कम या ज्यादा शोर नहीं निकालना चाहिए, क्योंकि यह चौराहों की संख्या को तिरछा कर सकता है और इसके परिणामस्वरूप, शाखाओं की घनत्व हालांकि, जो शोर व्याख्या को प्रभावित करता है वह सीमा उस की जांच नहीं की गई है। उपयोगकर्ता को यह तय करना चाहिए कि शोर को हटाने के साथ कैसे सूक्ष्म होना चाहिए और कंसिस का इस्तेमाल करना चाहिएछवियों की अखंडता बनाए रखने के लिए तनाव यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता शोर हटाने का आयोजन करते समय उपचार के लिए अंध हो जाए, क्योंकि इससे पूर्वाग्रह की संभावना कम हो जाएगी। शोर हटाने को विस्तार से वर्णित किया गया है ImageJ उपयोगकर्ता की मार्गदर्शिका 7 । इस प्रक्रिया में, शोर मुख्यतः पृष्ठभूमि-घटाई गई छवि से निकाल दी जाती है। इसके अतिरिक्त, थ्रेशोल्डिंग प्रक्रिया ही ग्रंथि के सेगमेंट को निकाल सकती है। ग्रंथि के अंश जिनमें कुछ पिक्सल हटा दिए गए हैं, जब कंकालयुक्त छवि को फैली हुई है, तब स्वचालित रूप से पुनर्निर्माण किया जाएगा। हालांकि, विशाल अंतराल के लिए मैनुअल पुनर्निर्माण की आवश्यकता हो सकती है उपयोगकर्ता को यह तय करना चाहिए कि इन हिस्सों को किस हद तक पुनर्निर्माण करना चाहिए, फिर मूल छवियों की अखंडता को बनाए रखना चाहिए।

यद्यपि यह महत्वपूर्ण नहीं है, सॉफ्टवेयर अपडेट को बनाए रखना महत्वपूर्ण है, चूंकि ImageJ सॉफ़्टवेयर को अक्सर अपडेट किया जाता है। यहां वर्णित विधियां संस्करण 1.48v पर आधारित हैं। FIJI और शॉल एNalysis प्लगइन को नियमित रूप से अद्यतन किया जाता है, और यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल v3.4.1 पर आधारित है। ImageJ और शॉल विश्लेषण प्लगइन दोनों के बाद के संस्करणों में किए गए परिवर्तन इन विधियों को प्रभावित कर सकते हैं। ImageJ स्वचालित रूप से अपडेट के लिए जांच करता है, लेकिन FIJI के लिए अद्यतन नियमित रूप से आयोजित किया जाना चाहिए, और मौजूदा संस्करणों और यहां उपयोग किए गए विकल्पों के बीच परिवर्तनों को आवश्यकतानुसार संबोधित किया जाना चाहिए। सभी मापदंडों शॉल विश्लेषण वेबपेज 6 पर उपशीर्षक में परिभाषित किए गए हैं। इस प्रक्रिया के भीतर पैरामीटर सेटिंग्स हमारी प्रयोगशाला में बनाई गई स्तन ग्रंथि पूर्ण-माउंट से ली गई छवियों पर आधारित होती हैं और पूर्ण नहीं हैं। पूरे माउंट की तैयारी प्रयोगशाला से प्रयोगशाला तक होती है, और इन पैरामीटर को तदनुसार समायोजित किया जा सकता है ताकि छवियों और आउटपुट को अनुकूलित किया जा सके।

इस अध्ययन में उपयोग किया गया स्तन ग्रंथि पूर्ण पर्वत पीएनडी 25 में एक महिला स्प्रेग दावेली चूहे से था, और विधि उचित रूप से लागू की गई और बिना सीमाओं के। चूहों में, स्तन उपकला घनत्व इंकउम्र के साथ एक बिंदु पर चलता है जहां यह ग्रंथि की एक सटीक कंकाल वाली छवि बनाने के लिए उच्च पर्याप्त संकल्प के साथ छवि को थ्रेसहोल्ड करने से रोकता है। इसलिए, हम वर्तमान में PND40 से पुराने चूहों से ग्रंथियों पर इस पद्धति का उपयोग करने की अनुशंसा नहीं करते हैं यद्यपि चूहे के तनाव का संकेत यहां दिया गया है, यह अप्रासंगिक है, क्योंकि लेखकों को वर्तमान में किसी तनाव-विशिष्ट स्तनधारी लक्षण से अवगत नहीं है जो इस पद्धति के उपयोग को रोकेंगे। इसके अलावा, जबकि एक मादा चूहे का उपयोग करते हुए भीतर वर्णित पद्धति का वर्णन किया गया था, यह भी पुरुष चूहों के स्तन ग्रंथियों पर लागू किया जा सकता है। इस आवेदन को पूरी तरह से चूहों (डेडर्रे टकर, व्यक्तिगत संचार) के साथ प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया गया है और किसी भी उम्र के चूहों के लिए उपयुक्त होना चाहिए, चूंकि चूहों में स्तन ग्रंथियां चूहों में घने के रूप में घने नहीं होती हैं। हालांकि, चूहों में इस एप्लिकेशन का उपयोग करने के साथ दो सीमाएं हैं: 1) छोटे चूहों में महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए बहुत कुछ शाखाएं चौराहें हो सकती हैं और 2) यह विधि कैननोटी चूहों के लिए लागू किया जाना चाहिए, क्योंकि वे स्तन उपकला प्रदर्शित नहीं करते हैं भले ही, यह स्वचालित पद्धति तेजी से, निष्पक्ष, और मैन्युअल रूप से शाखाओं की शाखाओं की गिनती की तुलना में बहुत कम श्रम-गहन है।

यह संभव है कि जांचकर्ता अन्य प्रयोगात्मक तकनीकों जैसे कि असामान्य ढांचे का निर्माण या इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) के लिए स्तन ग्रंथि का उपयोग करना चाहें। हालांकि टकर एट अल (2016) ने एक माउस स्तन ग्रंथि पूर्ण-माउंट से हेमटॉक्साइलिन-ईओसिन-स्टेन्ड अनुभाग तैयार करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है, 8 हम आम तौर पर एक संपूर्ण-माउंट को एक टर्मिनल प्रक्रिया बनाने के लिए मानते हैं और पूरी तरह से उपयोग करने के तरीकों के बारे में नहीं जानते हैं- अतिरिक्त संवेदनशील assays के लिए घुड़सवार स्तन ग्रंथि, जैसे कि आईएचसी या ट्यूनेल assays जहां स्तन ग्रंथि ऊतक का उपयोग कर संवेदनशील अभिलेख पूरे माउंट के साथ संयोजन के लिए आवश्यक हैं, वहां इसे अनुवांशिक स्तन ग्रंथियों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

स्तन ग्रंथि टी जारी हैओ अध्ययनों की बढ़ती संख्या में फोकल बिंदु है, फिर भी पूरे प्रयोगशाला 9 , 10 , 11 , 12 और विकास आकलन 13 , 14 , 15 दोनों में प्रयोगशालाओं में अंतर मौजूद है। यहां वर्णित शोल विश्लेषण के संशोधन में स्तनधारी ग्रंथि में, स्तन ग्रंथि विकास के एक महत्वपूर्ण लक्षण, शाखाओं के घनत्व के उद्देश्य मात्रा का ठहराव के लिए एक मानकीकृत विधि उपलब्ध कराता है। इस पद्धति को पुरुष या महिला कृन्तकों के स्तन-पूरे माउंट पर लागू किया जा सकता है, और यद्यपि वर्तमान में केवल शुरुआती अवस्था में चूहों से ग्रंथियों के पेरिब्रार्टलेट में उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, यह सभी उम्र के चूहों से स्तन ग्रंथियों पर लागू किया जा सकता है। आवेदन विशेष रूप से उपयुक्त ग्रंथियों के लिए उपयुक्त है जो कि पेरिब्यूबरल कण्टियों से एकत्रित होते हैं क्योंकि यह अवधि एक अनुशंसित हैटेस्ट दिशानिर्देश के अध्ययन में स्तन पूरे माउंट तैयार करने के लिए समापन बिंदु। वयस्क चूहों के घनीभूत स्तन ग्रंथियों में उपयोग के लिए इस पद्धति का अनुकूलन वर्तमान में विचार किया जा रहा है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस पद्धति और डॉ। टियागो फेरेरा (मैकगिल विश्वविद्यालय, मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कनाडा) की मान्यता के साथ अपनी सहायता के लिए लेखक डॉ। माइकल ईस्टरलिंग (सोशल एंड साइंटिफिक सिस्टम, इंक। डरहम, एनसी) को स्वीकार करना चाहते हैं। शोल आवेदन के साथ सहायता

Materials

त्रिज्या संलग्न करना (मिमी) विदेश मंत्रालय (एमएम 2) एन कश्मीर शाखाओं की घनत्व (एन / एमएम 2)
7.4 71.7 2381 0.73 33.2
Name Company Catalog Number Comments
Dissecting board NA NA A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins Daigger EF7419A
Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors Fine Science Tools 14569-09
Straight dissecing scissors Fine Science Tools 14568-09
Curved forceps Fine Science Tools 11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001 Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm Fisher scientific 12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher scientific 13-374-12
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)  Sigma-Aldrich 24102
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Carmine alum  Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate  Sigma-Aldrich A6435
Permount mounting media Fisher Scientific SP15
Macroscope Leica Z16 APO  This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera Leica DFC295
Camera software Leica Leica Application Suite v3.1 
ImageJ software Open source http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis  Open source http://imagej.net/Sholl_Analysis

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References

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
  2. Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
  3. Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
  4. Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
  5. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
  6. Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from: http://imagej.net/Sholl_Analysis (2012).
  7. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012).
  8. Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
  9. Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
  10. Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
  11. Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
  12. Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
  13. Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
  14. Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
  15. Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).

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विकास जीवविज्ञान अंक 125 स्तन ग्रंथि शॉल विश्लेषण प्रजनन पूरे माउंट विष विज्ञान चूहा मॉडल
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Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).

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