当初、スライド上に固定されていた乳腺組織を、全体のマウントとして、組織病理学的評価のために首尾よく除去、加工、切片化および染色する方法を開発した。この方法は、生殖および発育試験ガイドライン研究における乳腺全体マウントの採取および評価を促進し得る。
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この記事について
サマリー
要約
正常な乳腺発達は、環境毒素および医薬品への暴露、ホルモンへの過剰な暴露、および遺伝子改変によって変更される可能性がある。乳腺マウント全体は、暴露後に起こる形態変化の進行を捕捉するための安価な方法である。しかし、後の人生では、異常がより発生しやすい場合、この1つの方法に依存するだけでは、異常の適切な診断を行うのに十分な情報を提供できない場合があります。歴史的に、化学的試験ガイドライン研究では、単一の乳腺が剖検時に除去され、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色セクションとして調製される。反対側の乳房全身収集および分析の導入は、偽陰性評価の可能性を減少させる。マウント全体の評価は、スライド上の1つまたは2つの乳腺全体の存在によって制限され、ある場合には、マウント全体で観察される異常は、H＆Eセクションで一様に表現されています。この研究の目的は、カバーされていない乳腺全体マウントをH＆E染色された切片に変換するためのプロトコールを開発し、そうしなければ欠落していたかまたは診断困難な病変を同定できるようにすることであった。ここでは、最初に全体のマウントとして準備された乳腺から、高品質でパラフィン包埋されたH＆Eセクションを生成する方法を詳述します。 H＆E切片化のために意図的に調製された組織と比較して、全体のマウントは、組織の除去および処理のためのさらなる準備を必要とする。しかしながら、この方法は、一般的なラボ試薬および追加の時間をほとんど必要としないので、安価であると考えられている。結果として、この方法は、化学的および環境的曝露がどのようにして正常な哺乳類の発達を変化させるか、ならびに遺伝子改変のために生じる変化の表示に関する貴重な情報を提供することができる。
概要
乳房全体のマウントは、正常および化学的に誘発された異常な発達の両方を理解するために、多くのラットおよびマウスの研究で実施される有用で安価な方法である。一般に、げっ歯類発達中の様々な段階（ すなわち、青年期、思春期、中期〜後期妊娠期、および退縮段階）で収集された乳腺は、パラクリン、内分泌およびオートクリン因子によって影響される組織および細胞構造の形態変化を示す1 。老化ラットでは、腺の上皮および間質部分がますます稠密になり、全体的に形態学的パラメーターを測定することが困難になる。したがって、顕微鏡レベルでの変化を同定するために組織学的評価のために腺を採取することが一般的なプラクティスである。両方のプロセスは、化学暴露（ すなわち、環境または薬学的）を伴う研究、または遺伝子改変を伴う形態学的変化を調べる研究において特に有用であるations。
リスク評価において乳腺を使用するための技術および能力は進化し続けている。全マウント準備ルーチンと標準化されながら、切片の変更は2、3を続けます。いくつかの研究室が依然として皮膚4を介してクロスカット部を使用しながら、様々なバックグラウンド（ すなわち、学界、政府、産業界）から多....
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プロトコル
この研究のための全ての動物の使用および処置は、NIEHS実験動物
ケア・ユース委員会を設置し、
実験動物保護認定施設。
1.乳腺ホールマウント調製2、3、6、7
- 参考文献3に記載されているように、妊娠していないCD-1雌マウスの片側から鼠径乳腺を取り出し、それらを静電気帯電したスライド上に置く。
- グランドを覆っていない紙やフィルムで覆い、別のスライドを上に置きます。滑り止めのためにグランドがスライドにくっつくように、グランドを平らに広げるためにスライドに圧力（ すなわち水の重量）を加えます。
- スライドを固定液（ 例えば、エタノール、クロロホルム、氷酢酸を6：3：1の比で 100％）に浸し、室温で一晩インキュベートする。
- 固定液から腺を取り出し、エタノールで15〜30分間洗浄する。 30分の洗浄後、エタノールの1/3を注ぎ水を加えて徐々に水に変えます。毎回約5分間洗っておき、水を3回加えることを繰り返す。
- 12〜24時間、染色（....
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結果
この方法は、乳房パッドの最初の反対側のH＆Eセクションが組織学的変化を示さなかった場合に欠けていたかもしれない診断を支援するのに有効である。しかし、組織学的評価のための組織の調製の間だけでなく、最初の全マウント調製中に注意を払う場合には、結果は有用である。パラフィン包埋は保護を提供し、将来の断裂のために組織を保存するのに役立つであろう。
乳房組織の理想的な厚さを決定するために、4μmおよび6μm切片を調製した。我々は、ミクロトーム上の±1μmの誤差のマージンよりも大きい深さを試験した。厚さ6μmのセクション（ 図1A ）は、コンパクトなセルで非常に密集していました。全体として、スライドには明確な細胞の詳細が欠けていたため、適切な識別情報ication。最適な厚さは4μmであった（ 図1B ）。これらの組織は、上皮および間質領域および対応する細胞型が容易に区別される最良の結果を提供した。.......
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ディスカッション
乳腺全体マウントは、内分泌かく乱物質を含む化学物質への暴露後に生じる可能性のある正常な乳腺発達および形態変化を説明するのに使用できる強力なツールである。同じ動物の全体のマウントとH＆Eセクションが一緒に評価されると、早期の変化の正確な視覚的スナップショットを提供することができ、より病的な状態に進化することができる。
この有用な情報を得る能力は、組織を除去するときに腺形態を保存し、妥協しないように注意することにある。げっ歯類は、背壁に沿って両側にあるいくつかの乳腺サイトを持っていますが、筋肉組織の回復を最小限にするために4 番目と5 番目の腺を収集することをお勧めします。有用な形態学的ランドマークとして役立つので、乳頭付着領域およびリンパ節も存在するはずである。腺も広げて伸ばすべきですインサイチュでの組織の自然な構造を密接に模倣するために、平らな表面（ すなわちスライドガラス、カードストック、または布）を横切って配置される。乳腺内の異常は、通常、腺がキシレンで脱脂されるか、またはカルミン染色されるまで見え.......
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開示事項
著者は、この記事の研究、著者、および/または出版に関して、矛盾する利益を宣言することはない。
謝辞
著者は、このプロジェクトの技術的な専門知識とサポートのために、Pam Ovwigho、Tenette Jones、NIEHSのNatasha Claytonに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| キシレン | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| パーマウント | サーモフィッシャーサイエンティフィック | SP15-100 | マウント剤 (全体のマウントおよび H&Eセクション |
| ライカ 自動プロセッサ | ライカ バイオシステム | モデル # ST5020 | |
| HM 355S 自動ミクロトーム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 905200 | |
| パラフィン | ライカ バイオシステムズ | EM-400 | |
| スーパーフロスト プラス 顕微鏡スライド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 4951PLUS-001 | 静電充電 |
| フィッシャー ファイネスト 24x60x1 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12-548-5P | カバースリップ |
| バリステインジェミニ ES 自動スライドステイナー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | 液体接着剤; 切片化時に水浴で使用 |
| 改質ハリス ヘマトキシリン 72711 | Richard-Allan Scientific (Thermo Scientific の一部) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid Thermo | フィッシャーサイエンティフィック | A38-500 | ノイの固定剤 |
| クロロホルム | マクロンファインケミカル | 4440-04 | ノイの固定剤 |
| に必要な100%エタノール | ワーナーグラハムカンパニー | 6505001050000 | ノイの固定剤と洗浄スライド95 |
| %エタノール | ナーグラハムカンパニー | 6505011137320190 | |
| カーマインミョウバン | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| アルミニウム硫酸カリウム十二水和物、Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| オートメーション洗浄バッファー、20X | Biocare Medical | TWB945 |
参考文献
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M.
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