Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

병변 식별을위한 유선 절개 전체 장착

doi: 10.3791/55796 Published: July 24, 2017

Summary

우리는 성공적으로 슬라이드를 전체 마운트로 고정시킨 유방 조직을 조직 병리학 적 평가를 위해 성공적으로 제거, 가공, 절단 및 착색하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 생식 및 발달 테스트 지침 연구에서 유선 전체 마운트의 수집 및 평가를 촉진 할 수 있습니다.

Abstract

정상적인 유선 분비는 환경 독성 물질 및 의약품에 노출되거나 호르몬에 과도하게 노출되거나 유전 적 변형이 일어날 수 있습니다. 유선 전체 마운트는 노출 후에 발생할 수있는 형태 학적 변화의 진행을 포착하기위한 저렴한 방법입니다. 그러나 비정상 성이 더 많이 발생하기 시작하는 나중의 삶에서,이 한 가지 방법에 대한 단독 신뢰가 항상 이상의 적절한 진단을 내리기에 충분한 정보를 제공하지 못할 수도 있습니다. 역사적으로, 화학 테스트 가이드 라인 연구에서 단일 유선이 부검시 제거되고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)으로 염색 된 섹션으로 준비됩니다. 반대쪽 유방 전체 수집 및 분석의 통합은 위음성 평가의 가능성을 줄입니다. 전체 마운트의 평가는 슬라이드에 하나 또는 두 개의 전체 유선이 존재하는 경우에 제한적이며 경우에 따라 전체 마운트에서 관찰 된 이상은 없습니다.t는 H & E 섹션에서 균일하게 표현됩니다. 이 연구의 목표는 달리 덮어 버렸거나 진단하기 어려운 병변을 식별 할 수 있도록 coverslpped mammary 전체 마운트를 H & E로 염색 된 절편으로 변환하기위한 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다. 여기서는 처음에 전체 마운트로 준비된 유선으로부터 고품질의 파라핀이 포함 된 H & E 섹션을 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. H & E 절단을 위해 의도적으로 준비된 조직과 비교하여, 전체 마운트는 조직 제거 및 처리를위한 추가 준비를 필요로합니다. 그러나이 방법은 일반적인 실험용 시약과 약간의 추가 시간이 필요하기 때문에 값이 싸다. 결과적으로,이 방법은 화학적 및 환경 적 노출로 인해 정상적인 유방 발달을 어떻게 변화시키고 유전 적 변형으로 인해 발생하는 변화를 디스플레이하는지에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

mammary whole mountis는 정상적이고 화학적으로 유도 된 비정상적인 발달을 이해하기 위해 많은 쥐와 마우스 연구에서 구현 된 유용하고 저렴한 방법입니다. 일반적으로 설치류 개발 단계 ( 예 : 사춘기, 사춘기, 중기 - 후기 및 출생기)에 여러 단계로 수집 된 유선은 우상, 내분비 및자가 분비 인자에 의해 영향을받는 조직 및 세포 구조의 형태 학적 변화를 보여줍니다 1 . 노화 된 쥐에서, 선의 상피 및 간질 부분이 점차적으로 밀도가 높아져서 전체적인 형태로 형태 학적 매개 변수를 측정하는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 미시적 수준의 변화를 확인하기 위해 조직 학적 평가를 위해 림프를 수집하는 것이 일반적입니다. 두 공정 모두 화학적 노출 ( 즉, 환경 적 또는 약학 적)과 관련된 연구 또는 유전 적 변화에 따른 형태 학적 변화를 조사하는 데 특히 유용합니다ations.

위험 평가에서 유선을 사용하기위한 기술과 기능은 계속 진화하고 있습니다. 전체 장착 준비가 일상적이고 표준화되어있는 반면, 절편 수정은 2 , 3 단계로 이어 집니다. 일부 실험실은 아직 피부 사를 통해 크로스 컷 섹션을 사용하는 동안 다양한 배경 (즉, 학계, 정부 및 업계)에서 많은 연구 그룹은, 바람직한 방법으로 유방 조직의 종 방향 / 코로나 섹션을 채택했다. 후자의 방법은 관심있는 조직 (유선 상피 2 )보다는 표피 (피부)를 과도하게 표현합니다. 코로나 또는 종단면 인해 증가 된 표면적 및 본 구조물의 개수 이상 병변의 검출을 향상 크게 정상 조직 5 특징과 더 유용하다. 전반적으로 이것은 전체 mo를 만듭니다.유선의 비교 조직 병리학 적 평가를위한 적절한 방법 1 , 2 . 사타구니 동맥 번째 마우스 또는 래트, 검색하고, 4 번째 및 5의 보존을 사용하는 것은 매우 전체 비교 추천 여부 반대측 H & E 부분에 장착.

H & E 섹션과 전체 마운트는 환경 노출로 인한 세포 및 형태 학적 변화에 대한 정확한 설명을 제공합니다. 이는 모델이 종양 형성에 대한 감수성이 낮거나 종양이 현저하게 보이지 않는 특정 설치류 계통에서 특히 그러하다. 경우에 따라 두 가지 기술 ( 즉, 부족한 조직의 양, 자원 또는 예기치 않은 실험 결과)을 사용하여 필요한 조직을 얻는 것이 항상 가능하지 않을 수도 있습니다. 우리의 경우, 유방 전체에서 이상이 관찰되었지만, 조직 병증대 측성 H & E 글 랜드의 논리적 발견은 대체로 정상적이었다. 반대쪽 샘 사이의 압도적 인 불일치로 인해 우리는 전체 산에서 이상을 확인하는 경제적이며 효율적인 절차를 개발하게되었습니다. 변형 된 가공 및 삽입 절차를 사용하여 고품질의 H & E로 염색 된 섹션을 파라핀 내장형 마운트에서 준비했습니다. 우리는이 프로토콜이 화학 물질 노출 효과를위한 강력한 탐지 도구가되어 실험실 간 비교를 향상시킬 수 있다고 생각합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

이 연구를위한 모든 동물의 사용과 절차는 NIEHS 실험 동물

보살핌 및 사용위원회와 협회의 평가 및 인정 협회에서

실험 동물 관리 인증 시설.

1. 유방 전체 마운트 준비 2 , 3 , 6 , 7

  1. 참조 3에 설명 된대로 임신하지 않은 CD - 1 암컷 마우스의 한쪽에서 사타구니의 유선을 제거하고 정전기가있는 슬라이드에 올려 놓습니다.
  2. 글 랜드를 붙지 않는 종이 또는 필름으로 덮고 다른 슬라이드를 맨 위에 놓습니다. 글 랜드가 슬라이드에 고정되어 고정되도록 글 랜드를 평평하게 펼치기 위해 슬라이드에 압력 ( 예 : 물 무게)을가하십시오.
  3. 슬라이드를 고정액 ( 예 : 100 % 에탄올, 클로로포름, 빙초산 6 : 3 : 1 비율)에 담근다.실온에서 하룻밤.
  4. 정착액에서 땀샘을 제거하고 에탄올에서 15-30 분 동안 씻으십시오. 30 분 세척 후에 에탄올 1/3을 붓고 물을 가하여 서서히 물로 변합니다. 매번 약 5 분 동안 씻으십시오. 그리고 물을 3 번 더 가하여 반복하십시오.
  5. 12-24 시간 동안 얼룩 ( 예 : 카민 연금 용액).
    참고 : 두꺼운 조직은 더 긴 염색 시간을 필요로합니다. 자세한 염색 방법은 참고 문헌 3 을 참조하십시오.
  6. 할당 된 시간 후에 얼룩을 털어 내고 슬라이드를 30 초 동안 물에 헹구십시오. 95 % 에탄올에서 15 분 씻고 20 분 동안 100 % 에탄올에서 최종 씻음을 수행하여 15 분 동안 70 % 에탄올에서 슬라이드를 세척하여 조직을 탈수.
  7. 조직을 두껍게하면 최소 24 시간 이상 자일 렌에 넣고 조직에서 지방을 제거하여 불투명 한 부분이나 흰색 부분을 제거합니다.
  8. 자일 렌에서 티슈를 제거하고 신속하게 m조직 탈수증을 피하기 위해 슬라이드에 매체를 ounting; 상단에 coverslip을 놓으십시오. 적어도 48 시간 동안 슬라이드를 건조시킵니다.
  9. 2 에서 설명한대로 전체 장착 된 조직을 비정상 상태로 평가하십시오.
    참고 : 병변이 전체 마운트에서 감지되고 신원 확인을 위해 절편이 필요한 경우 다음 단계를 따라야합니다.

2. 유리 슬라이드에서 유방 전체 마운트 제거

  1. 유성 전체 마운트 슬라이드를 자일 렌으로 가득 찬 유리 얼룩 항아리에 담그고 coverslip 및 장착 매체를 제거하십시오.
    참고 : 과도한 장착 솔루션으로 두꺼운 조직과 슬라이드는 커버 슬립 제거에 추가 시간이 필요할 수 있습니다.
  2. 초기 밤새 담가 준 다음, 슬라이드를 신선한 크실렌에 넣고 6 시간 동안 담그십시오. 신선한 크실렌에 마지막으로 한 번 담근다.
    참고 : 커버 슬립은 마지막 담금 후 슬라이드에서 쉽게 떨어집니다.
  3. ag손을 사랑, 슬라이드를 잡고 조심스럽게 한 조각에 제거되도록 포셉 한 쌍의 coverslip을 제거하십시오.
    참고 : coverslip 여전히 유리 슬라이드에 첨부 된 경우, 약간의 노력으로 제거 할 수있을 때까지 몸을 담그기를 계속하십시오.
  4. coverslip가 제거되면, 자일 렌을 포함 유리 페트리 접시에 수직으로 슬라이드를 잡고 신중하게 날카로운, 일회용 면도날을 가지고 슬라이드 아래로 단일 운동에 블레이드를 슬라이드.
  5. 일단 조직이 제거되면, 유분 패드를 크실렌이 채워진 유리 페트리 접시에 신속히 잠기 게하여 조직이 공기 건조하지 않도록하십시오.
    참고 :이 단계에주의하십시오. 전체 마운트는 얇고 (≤ 1 mm) 크실렌 가공으로 인해 깨지기 쉽습니다. 모든 인상이나 눈물이 조직의 형태를 변화시키고 나중의 평가를 복잡하게 만들 수 있습니다.

3. 조직 처리

  1. 일단 조직이 페트리 접시에 있으면 신중하게 그것을 전송표지 된 조직 학 카세트에. 뭉툭한 코 모양의 톱니 모양의 집게로 지방 패드의 가장자리를 잡고 조직 손상을 최소화하십시오.
    1. 면도칼을 사용하여 더 큰 조직 (특히 쥐의 경우)을 반으로 잘라내어 조직 크기를 수용 할 수있는 두 개의 별개의 분류 된 카세트에 두십시오. 조직을 오른쪽면을 위로 향하게합니다 (참조로 림프절을 사용하십시오). 림프절이없는 조직을 카세트로 옮길 때 똑바로 세우십시오.
  2. 카세인을 키 실렌 용기에 넣고 최대 2 시간 동안 티슈 프로세서에 넣습니다.
    참고 : 샘플을 카세트에 넣은 당일에 샘플을 처리하는 것이 좋습니다. 크실렌에 장시간 담그는 것은 테스트되지 않았습니다.
  3. 최대 수의 카세트를 손으로 티슈 프로세서에 넣으십시오.
  4. 시작하기 전에이 프로세스에 사용될 모든 시약을 프로세서의 시약 목록에 프로그래밍하십시오. 이동을 자동화하려면한 스테이션에서 다른 스테이션으로 이동하려면 메뉴 옵션을 사용하여 새 프로그램을 작성하십시오. 모든 단계가 완료되면 '확인'을 선택하여 계속 진행하십시오.
    참고 : 프로세서는 시작하기 전에 모든 스테이션 세부 정보를 검토 할 수 있습니다.
    1. 37 ℃에서 30 분 동안 크실렌에 카세트를 담그도록 프로세서를 자동화 한 다음 동일한 조건에서 새 크실렌에 두 번째 담그십시오. 프로세서를 자동화하여 자일 렌 용액에서 카세트를 제거하고 조직을 60 ° C에서 30 분 동안 1 : 1 크실렌 : 용융 파라핀 혼합물이 들어있는 다음 스테이션으로 옮깁니다.
      참고 : 프로세서는 용융 된 파라핀이 들어있는 새 챔버에 카세트를 1 시간 동안 옮깁니다. 1 시간 후 시료는 새로운 용융 파라핀의 새로운 챔버로 자동 이송되어 2 시간 더 처리됩니다. 두 단계 모두 60 ° C에서 수행됩니다.
    2. 프로세서는 용융 된 파라를 포함하는 스테이션으로 카세트를 이송합니다1 시간 동안 ffin. 그런 다음 샘플을 자동으로 새로운 용융 파라핀 최종 스테이션으로 옮기고 추가 2 시간 동안 가공합니다. 두 단계 모두 60 ° C에서 수행됩니다.

4. 가공 유방 조직 삽입

  1. 몰드에 조직을 삽입 할 준비가 될 때까지 삽입 스테이션의 58 ° C 파라핀 고정 탱크에 카세트를 놓습니다.
  2. 카세트 커버를 제거하여 조직의 최적 금형 크기를 결정하십시오. 곰팡이가 조직을 수용하기에 충분히 큰 지 확인하고 조직이없는 경계선 주위에 파라핀이없는 충분한 공간을 남겨 둡니다.
  3. 용융 된 파라핀 3 ~ 4mm를 금형에 넣고 유리 슬라이드의 하단과 카세트의 바닥에 인접한 유성체 전체 표면을 금형에서 위로 향하게합니다.
  4. 금형을 냉각 판에 옮기고 필요에 따라 금형과 평행이되도록 조직을 신속하게 조정하십시오. b오트밀.
    참고 : 파라핀이 경화되면 조직이 제자리에 고정됩니다.
  5. 따뜻한 포셉을 사용하여 카세트의 아래쪽 절반을 금형 위에 놓습니다. 포셉을 사용하여 단단히 누르십시오.
  6. 연속 카세트 전체를 덮기 위해 추가로 용융 파라핀을 몰드에 추가하십시오. 몰드를 따뜻한 판에서 차가운 판으로 이동시켜 블록의 경화를 완료하십시오.
  7. 파라핀이 완전히 응고되어 균열이나 공기 방울이 생기지 않는 경우 금형에서 블록을 제거합니다.
    참고 : 파라핀 묻힌 조직을 준비가 될 때까지 실내 온도에 보관하십시오.

5. Microtome에 파라핀 묻힌 유방 조직 단면도

  1. sectioning하기 전에 -20 ° C에서 1 시간 파라핀 블록을 품어.
    참고 : 원래 덮개가 달린 전체 장착 티슈에서 블록에 잔여 장착 매체가 있습니다. 블록을 차게하면 블록 세분화 및 리핑이 향상됩니다.
  2. 마이크 준비하기신선한 증류수가 들어있는 수조를 켜고 42-45 ° C로 온도를 조절하여 로토메를 얻는다. 신선하고 얇은 날을 마이크로톰 위에 놓고 4 μm로 설정하십시오.
    참고 : 조직에 잔여 장착 매체가 있기 때문에 단면 품질이 4 μm보다 두꺼운 부분은 줄어 듭니다.
  3. 왁스가 블레이드를 마주하고 수직면과 정렬되도록 블록을 마이크로톰에 삽입하십시오. 그런 다음 차가운 물에 거즈 패드 부분을 적신 다음 몇 분 동안 블록 위에 놓습니다.
  4. 거친 고급 휠과 함께 시계 방향으로 커다란 바퀴를 돌리면서 블록의 전체면이나 대표 부분을 얻을 때까지 블록을 분할하십시오.
    참고 : 조직은 전체 장착 과정에서 크실렌 제거 때문에 얇습니다. 블록을 블레이드와 올바르게 정렬하여 대표 섹션을 얻는 데 필요한 절단 수를 최소화합니다.
  5. 리본을 선택하십시오.섹션을 손으로 조심스럽게 뜨고 (45 ° C) 따뜻한 물통 (사전 준비)에 리본을 조심스럽게 올려 놓고 조직 주름이 흩어 지도록 조심스럽게 섹션을 깨끗한 유리 슬라이드 위에 띄웁니다.
  6. 과도한 물을 제거하기 위해 슬라이드를 건조 랙에 똑바로 세웁니다. 37 ° C에서 약간 열린 슬라이드 상자에 슬라이드를 품어주십시오.

6. 단면 유방 조직의 자동 및 수동 H & E 염색

  1. 얼룩이지기 전에 슬라이드는 실온에서 보관됩니다.
  2. 자동 염색의 경우 기본 메뉴의 얼룩 옵션에서 H & E를 선택하십시오. 탈 파라핀 화, 염색 및 탈수는 모두 자동화 된 염색기에서 완료됩니다. 장착 매체와 coverslip을 사용하여 섹션을 마운트하십시오.
  3. 수동으로 슬라이드를 염색 경우, 5 분 동안 자일 렌에 슬라이드를 immersing하여 섹션을 deparaffinize. 신선한 크실렌으로 옮기고 5 분 동안 반복하십시오.
  4. thers immersing하여 슬라이드 rehydrateem 100 % 에탄올에서 2 분씩 3 분간 처리 한 후 95 % 에탄올에서 2 회 반복하고 5 분마다 1X 세척 완충액에서 2 회 세척한다.
  5. 슬라이드를 증류수로 헹구십시오.
  6. 1-2 분 동안 hematoxylin에 슬라이드를 추가합니다. 슬라이드를 꺼내 5 분 동안 흐르는 수돗물로 헹굽니다.
    참고 : 사용 전 헤 마톡 실린을 걸러냅니다.
  7. 슬라이드를 1 % 빙초산에 넣고 30 초간 분화를 촉진시킨 다음 1 분 동안 수돗물로 헹구십시오.
  8. 30 분 ~ 1 분 동안 1X PBS에 슬라이드를 추가하여 조직 절편을 파란색으로 한 다음 수돗물로 5 분간 헹구고 15 ~ 20 초 동안 95 % 알코올로 헹군다.
  9. 30 초에서 1 분간 에오신 용액으로 대조 염색하십시오. 다음에, 신선한 95 % 에탄올에서 두 번 탈수 해 100 % 에탄올에서 2 번 반복합니다. 각 세척을 5 분 동안 수행하십시오.
  10. xylene에있는 슬라이드를 각각 5 분 동안 두 번 변경하십시오.
  11. Coverslip장착 매체와 조직 섹션과 상온에서 하룻밤 건조 플랫.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

이 방법은 유방 패드의 원래 대 측성 H & E 섹션에 조직 학적 변화가 나타나지 않으면 놓치기 쉬운 진단을 돕는 데 효과적입니다. 그러나 결과는 조직 학적 평가를위한 조직 준비 과정뿐만 아니라 초기 전체 마운트 준비 과정에서주의를 기울이는 경우에만 유용합니다. 파라핀 삽입은 보호를 제공하고 장래의 절개를 위해 조직을 보존하는 데 도움이됩니다.

유방 조직의 이상적인 두께를 결정하기 위해 4 μm 및 6 μm 단면을 준비했습니다. 우리는 마이크로톰에서 ± 1μm의 오차 범위보다 큰 깊이를 시험했다. 6 μm 두께의 섹션 ( 그림 1A )은 컴팩트 한 셀로 매우 밀집되어있었습니다. 전반적으로, 슬라이드에는 적절한 식별 정보를 작성하는 데 필요한 개별적인 세포 세부 정보가 부족했습니다.ication. 최적의 두께는 4 μm ( 그림 1B )입니다. 이 조직은 상피와 간질 영역과 상응하는 세포 유형이 쉽게 구별되는 최상의 결과를 제공했습니다.

이 방법의 용이성과 유용성을 설명하기 위해 대규모의 진행중인 연구에서 나온 슬라이드를 사용했습니다. 여러 경우에서 14 개월 된 처녀 CD-1 자손의 원래 H & E 섹션은 동일한 동물의 반대쪽 유방 전체 마운트와 비교하여 상반되는 결과를 발견했습니다. 병변은 전체 산에서 분명 하였지만, 더 이상의 절편 화 및 염색 없이는 확인할 수 없었다. 2 개의 다른 동물의 샘플을 대표적인 경우로 선택했다. 두 경우 모두 염색에 단일 절편을 사용했지만 대표 절을 얻을 때까지 여러 번 절취했습니다. 이전의 전체 탑재 준비가 해제 된 이후 대표 섹션을 얻는 데 필요한 인력은 거의 없었습니다.st에서 뚱뚱한 패드로 둘러싸인 paraffin embedding을 위해 원래 준비된 mammary gland와 비교하여 매우 얇은 것을 남긴다. 2 및도 3a는 정상으로 평가 하였다 동맥의 조직 학적 단면을 도시한다. 두 땀 샘 모두 강력하고 균일 한 지방 세포가 풍부한 인구로 둘러싸인 도관 구조를 보여줍니다. 각 덕트는 단순한 입체 상피 세포의 단일 층에 의해 줄 지어 있으며 주로 myoepithelial 세포로 구성되는 기초 세포의 두 번째 층에 의해 유지되지만 줄기 세포와 전구 세포 집단을 포함합니다. 대표적인 반대측 전체 마운트 (도 2b 및도 3 B)은 덕트 증가 불투명도 기질을 보여 주었다. 그러나 불투명이 과형성, 염증성 또는 신 생물 변이의 결과인지 여부를 결정하는 것은 어려웠습니다.뚜렷한 세포 세부 사항을 제공 할 수있는 H & E 섹션을 가지고 있습니다.

동일한 동물의 반대쪽 전체 마운트는 여기에 설명 된 방법을 구현하는 데 사용되었으며 그림 2 C와 D그림 3 C와 D에서 볼 수 있습니다. 그림 2 C & D 의 샘플은 유선 섹션의 큰 혈관 주위에 있었던 림프구 수가 증가하여 혈관 주위 염증으로 진단되었습니다. 두 번째 경우에는 유선의 소엽 건축이 유지되었지만 정상 폐포와 덕트의 수와 크기가 증가하여 다발 적으로 확대되었다 (lobuloalveolar hyperplasia). 폐포 상피 세포는 분화가 잘되고 둥글며 종종 공포가 있었고 전형적으로 단백질 성 액체를 함유 한 내강 주위에 하나의 동심원 층을 형성했다. 둑ts는 원주 세포에 의해 줄 지어 있었고 하나의 동심 층을 형성하는 잘 분화 된 상피와 함께 폐포 세포와 유사했다. 이 표현형은 임신 중기의 생쥐와 쥐의 유선에서 가장 자주 관찰됩니다. 이것은 성인 남성 쥐의 유선에서 lobuloalveolar 구조와 혼동되어서는 안됩니다 8 . 성인 남성 유선에서 폐포가 두드러지며 덕트가 드물지만 폐포와 덕트는 층상의 상피 세포가 있으며 기저부는 짧은 기둥 모양의 상피 세포로 이루어져있다.

그림 1
그림 1 : H & E 섹션에 마우스 유선 전체 마운트 . A) 6 μm 및 B) 4 μm. 유선 구조의 해상도는 조직 병리학 적 평가에서 두꺼운 (6 - & #181; m) 단면이므로 4μm 단면을 권장합니다. 이 수치는 Tucker et al. 9 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 혈관 주위 염증의 H & E 섹션 전체 마운트. 이 이미지는 발정기에 수집 된 마우스 유선입니다. A) 조직 병리학 적 변화가없는 포르말린 고정 H & E 유선 섹션. B) 불투명도가 증가 된 영역 (박스 영역)이있는 반대쪽 전체 마운트 섹션. C) 유방 전체 마운트 (박스 영역)에서 H & E 섹션 20 배 확대. 단핵 세포의 클러스터는 혈관을 둘러싸고 주변의 지방 조직으로 확장됩니다. D) Th유방 전체 마운트 (박스 영역)에서 H & E 섹션의 40x 배율은 단핵구의 대부분이 림프구로 구성되어 있으며 혈관 주위 염증의 심각성을 강조 표시합니다. 이 수치는 Tucker et al. 9 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 소엽 폐포 증식증의 H & E 섹션 전체 마운트 . 이 이미지는 발정기에 수집 된 마우스 유선입니다. A) 조직 병리학 적 변화가없는 포르말린 고정 H & E 유선 섹션. B) 관과 간질 영역에서 증가 된 불투명도를 가진 반대측 전체 마운트 섹션 (박스는에이). C) 유방 전체 마운트 (박스 영역)에서 H & E 섹션 20 배 확대. 소엽 건축은 유지되었지만 정상 폐포와 덕트의 수와 크기가 증가함에 따라 다발성으로 확대되었다 (lobuloalveolar hyperplasia). D) 유방 전체 마운트 (박스 영역)에서 H & E 섹션의 40x 배율은 확대 lobules가 포함하는 루멘을 형성 잘 분화, 자주 공포 상피 세포에 의해 줄 지어 폐포와 덕트의 증가 수를 포함하고 계시를 나타냅니다 단백질 성 유체. 이 수치는 Tucker et al. 9 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

유선의 전체 마운트는 내분비 교란 물질을 포함한 화학 물질에 노출 된 후에도 발생할 수있는 정상적인 유방 발달 및 형태 학적 변화를 설명하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 동일한 동물의 전체 산과 H & E 섹션을 함께 평가하면 조기 변경에 대한 정확한 시각적 스냅 샷을 제공 할 수 있으며, 이는 더 병이있는 상태로 진행될 수 있습니다.

이 유용한 정보를 얻을 수있는 능력은 조직을 제거 할 때 선 형태를 보존하고 손상시키지 않도록주의를 기울이는 데 있습니다. 설치류가 등쪽 벽을 따라 양측에 위치하는 여러 유선 위치를 가지고 있지만 근육 조직 회복을 최소화하기 위해 4 th 및 5 th 땀샘을 수집하는 것이 좋습니다. 젖꼭지 부착 영역과 림프절도 유용한 형태 학적 지표로 사용되어야합니다. 글 랜드도 펼쳐져 있고 스트레칭되어야합니다.평평한 표면 ( 예 : 유리 슬라이드, 카드지 또는 천)을 가로 질러 붙어서 조직의 자연스러운 구조를 동일 하게 모방합니다. 유선 내 이상은 일반적으로 글 랜드가 크실렌으로 탈지되거나 카르 민 염색 될 때까지 보이지 않습니다. 원래 조직 절편을 위해 준비된 유방 조직과는 달리, 파라핀 삽입을 위해 유리에서 제거 된 전체 마운트는 극도로 얇고 깨지기 쉽습니다. 포셉의 인상과 조직의 찢김은 세포 형태를 변형시키고 완제품의 조직 병리학 적 평가를 어렵게하므로 피해야합니다.

일단 전체 마운트가 파라핀 묻혀 있다면, 절편하기 전에 블록을 -20 ° C에서 1 시간 동안 배양하는 것이 좋습니다. 이 단계는 리본에서 최적의 대표적인 조직 절편을 얻을 수있는 능력을 향상시킵니다. 6 μm에서의 조직 절단 ( 그림 1A ) 9 그림 1B ) 9 을 사용함으로써 상피 조직 및 주위 간질 침윤을 포함하여 모든 세포 특징을 쉽게 확인할 수있었습니다. 이 섹션들은 이전에 카민이 염색되었지만, 절편에 따라 얼룩이 보이지 않고 H & E 염색을 방해하지 않았 음을 유의해야합니다. 따라서, 탈 염색 단계는 프로토콜에서 필요하지 않았다. 조직 절편은 H & E로만 염색되었지만 절개가 완료되면 사소한 변형으로 다른 조직 화학 및 면역 조직 화학 염색이 적용될 수 있습니다. 그러나 그것은이 프로토콜의 범위를 벗어 났으며 이러한 얼룩의 최적 조건을 결정하기 위해 추가 조사가 필요할 것입니다.

이 절차는 우리가 일상적으로 수집 한 사람들 사이에 불일치 발견을 관찰했기 때문에 개발되었습니다르 마운트 및 대 측성 H & E 염색 된 유선 단면을 동일한 동물로부터 얻는다. 유사한 유방 프로토콜이 존재합니다 6 , 10 ; 그러나 절차가 상세하거나 쉽게 수행되지 않았습니다. 이러한 방법은 우리 프로토콜의 개발을위한 기반을 마련했습니다. 상보 전체 마운트 수많은 비정상적인 형태 적 특징 (도 2 (B) 및도 3 (B))를 9 밝혀 동안 정상 선 형태는 H & E 염색 된 조직 절편 (도 2 및도 3 A) 1에서 관찰되었다. 전체 마운트에 대해 조직학을 수행함으로써 비정상적인 기능을 분류 할 수 있습니다. 예를 들어, 혈관 주위 염증 및 소구 상 과형성 증식이 두 번째의 경우에서 확인되었는데,e 반대편에서 관찰 된 H & E 소견 ( 그림 2 C 및 D그림 3 C 및 D ) 9 .

저자의 지식에 따르면 현재 진행중인 연구에서 관찰 된 것과 유사한 유방 선미 불일치에 대한 알려진보고는 없습니다. 그러나 이는 유방 분비가 종종 RT-PCR이나 웨스턴 블롯과 같은 형태학을 포함하지 않는 단일 응용 또는 분석을 위해 단독으로 수집되기 때문에 발생의 결핍보다는 실험적 설계 문제로 인한 것일 수 있습니다. 그러나 많은 실험에는 각 종말점에 대해 적절한 양의 조직이 필요한 여러 응용 프로그램이 통합되어 있습니다. 사타구니 땀샘은 드물게 흉선과 같은 주변 조직 ( 즉, 근육 오염)을 오염 시키거나 사타구니의 유방 림프절이 가치를 제공하기 때문에 전체 마운트 및 다운 스트림 어플리케이션에 선호됩니다오리엔테이션 및 땀샘을 통한 비교가 가능한 랜드 마크입니다. 따라서 어떤 응용선에 어떤 글 랜드와 글 랜드의 양을 할당할지 결정하는 것은 검출 정밀도에 영향을 미칩니다. 유선의 우선 순위는 1) 전체 4 번째 및 5 번째 땀샘으로 구성된 전체 마운트, 2) 랜드 마크로 사용하기 위해 일부 림프절을 포함하는 반대쪽 4 번째 샘의 조직학, 3) 하류 애플리케이션 (NO 오염 림프절)와 반대측 5 번째(즉, RNA, DNA, 단백질). 검시시 이상이 보이면 조직 수집을 선호합니다.

다른 프로토콜과 마찬가지로 수반되는 제한이 있습니다. 예를 들어, 절개 중 전체 마운트를 영구적으로 파괴하고 대체 분석에 사용하기에 제한적인 조직을 가질 필요가 있습니다. 따라서 데스크탑 전체 마운트를 광범위하게 문서화 할 것을 권장합니다.향후 분석 및 참조를 위해 디지털 이미지를 생성 할 수 있습니다. 또한 한 달 안에 염색이 일어나지 않을 경우, 향후 분석을 위해 조직을 보존하기 위해 잘라낸 절편의 수를 제한하십시오. H & E 섹션 방법에 대한이 전체 마운트의 이점은 여러 분야, 특히 독성학을 포함한 유방 연구에 보편적으로 적용될 수있는 한계를 능가합니다. 내분비 계 효과가 알려진 화학 물질을 사용하는 여러 연구에서이 프로토콜의 변형 버전을 포함하여 적용 가능성 11 , 12 , 13을 입증했습니다. 이러한 연구 결과는 화학 시험에서 위음성의 가능성을 줄이는 데 도움이되지만 규정 및 위험 평가 결정에 사용될 수있는 새롭거나 추가 정보를 제공 할 수도 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는이 기사의 연구, 저자 및 / 또는 출판과 관련하여 선언 할 수있는 이해 관계가 없습니다.

Acknowledgments

저자는이 프로젝트에 대한 기술적 전문성과 지원으로 Pam Ovwigho, Tenette Jones 및 NIEHS의 Natasha Clayton을 인정하고자합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Permount Thermo Fisher Scientific SP15-100 mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections
Leica automated processor Leica Biosystems Model # ST5020
HM 355S Automatic Microtome Thermo Fisher Scientific  905200
Paraffin Leica Biosystems EM-400
Superfrost plus microscope slides Thermo Fisher Scientific 4951PLUS-001 electrostatically charged
Fisher Finest 24x60x1 Thermo Fisher Scientific 12-548-5P coverslips
Varistain Gemini ES Automatic slide stainer Thermo Fisher Scientific A78000014
Sta-On Leica Biosystems 3803107 liquid adhesive; used in water bath at sectioning
Modified Harris Hematoxylin 72711 Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) 72711
Eosin Leica Biosystems 3801600
Lithium Carbonate SkyTech Laboratories LCQ500
Glacial Acetic Acid Thermo Fisher Scientific A38-500 needed in Carnoy's fixative
Chloroform Macron Fine Chemicals 4440-04 needed in Carnoy's fixative
100% Ethanol The Warner Graham Company 6505001050000 needed in Carnoy's fixative and washing slides
95% Ethanol The Warner Graham Company 6505011137320190
Carmine Alum Sigma-Aldrich C1022-25G
Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra Sigma-Aldrich A7210-500G
Automation wash buffer, 20X Biocare Medical TWB945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119, (8), 1053-1061 (2011).
  2. Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41, (2), 190-209 (2013).
  3. Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. In press (2017).
  4. Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf (2011).
  5. Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf (2011).
  6. Mammary gland whole mount processing and staining. Available from: http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm (2016).
  7. Whole mount preparations. Available from: http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149 (2016).
  8. Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44, (7), 1034-1058 (2016).
  9. Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44, (7), 1059-1064 (2016).
  10. Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63, (4), 317-324 (2011).
  11. Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146, (9), 4138-4147 (2005).
  12. Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147, (10), 4871-4882 (2006).
  13. Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18, (6), 803-811 (2004).
병변 식별을위한 유선 절개 전체 장착
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).More

Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter