Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Sektion Mammary Gland Whole Mounts för Lesion Identification

doi: 10.3791/55796 Published: July 24, 2017

Summary

Vi utvecklade en metod för att framgångsrikt avlägsna, bearbeta, avbilda och fläcka, för histopatologisk utvärdering, bröstvävnad som ursprungligen hade fixerats på glidbanor som hela fästen. Den här metoden kan främja insamling och utvärdering av bröstkörtelns hela fästen i studier om reproduktiv och utvecklingstest.

Abstract

Normal utveckling av bröstkörteln kan förändras genom exponering för miljöstiftmedel och läkemedel, överdriven exponering för hormoner och genetiska förändringar. Mammary körtel hela fästen är en billig metod för att fånga utvecklingen av morfologiska förändringar som kan uppstå efter exponering. Men i senare liv, när abnormiteter är mer benägna att utvecklas, kan ensam beroende av den här metoden inte alltid ge tillräcklig information för att göra en korrekt diagnos av avvikelsen. Historiskt sett avlägsnas en enda bröstkörtel vid studier av kemiska testriktlinjer vid nekropsyra och prepareras som en hematoxylin och eosin (H & E) -färgad sektion. Införlivandet av kontralaterala bröstkollektion och analys av bröstmonteringar minskar sannolikheten för en falsk-negativ bedömning. Utvärderingen av hela berget är begränsad av närvaron av en eller två hela bröstkörtlar på en glid, och i vissa fall är de abnormiteter som observeras i hela berget ingenT enhetligt representerad i H & E-sektionen. Målet med denna studie var att utveckla ett protokoll för omvandling av täckläckade bröstmassor till H & E-färgade sektioner så att lesioner som annars skulle ha missat eller som är svåra att diagnostisera kan identifieras. Här beskriver vi en metod för att producera en högkvalitativ, paraffininkonstruerad H & E-sektion från en bröstkörtel som ursprungligen var förberedd som ett helmonterat. I jämförelse med en vävnad som avsiktligt förbereddes för H & E-sektion, kräver hela berget ytterligare förberedelse för borttagning och behandling av vävnad. Denna metod anses emellertid billigt, eftersom det kräver vanliga labreagenser och lite extra tid. Som ett resultat kan denna metod ge ovärderlig information om hur kemiska och miljömässiga exponeringar förändrar normal bröstutveckling, samt visar förändringar som uppstår på grund av genetiska modifieringar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mammabrocket är en användbar och billig metod som implementeras i många rått- och musstudier för att förstå både normal och kemiskt inducerad, onormal utveckling. I allmänhet uppvisar en bröstkörtel i olika steg under utveckling av gnagare ( dvs. ungdomar, puberteten, mellan- till sen-gestation och involutionfasen) morfologiska förändringar i vävnad och cellulär arkitektur påverkad av parakrina, endokrina och autokrina faktorer 1 . I den åldrande råttan blir epitel- och strompartierna av körteln alltmer tät, vilket gör mätning av morfologiska parametrar svåra i ett helt berg. Således är det vanligt att samla en körtel för histologisk utvärdering för att identifiera förändringar på en mikroskopisk nivå. Båda processerna är särskilt användbara i studier som inbegriper kemisk exponering ( dvs. miljö- eller farmaceutisk) eller att undersöka de morfologiska förändringarna tillsammans med genetisk förändringations.

Tekniker och förmåga att använda bröstkörteln i riskbedömning fortsätter att utvecklas. Medan helmonterad förberedelse är rutinmässig och standardiserad, fortsätter modifieringen av snittning 2 , 3 . Många forskargrupper från olika bakgrunder ( dvs. akademi, regering och industri) har anpassat koronal / longitudinella delar av bröstvävnad som en föredragen metod, medan vissa laboratorier fortfarande använder tvärsnitt genom huden 4 . Den senare metoden resulterar i en överdriven representation av epidermis (hud), snarare än vävnad av intresse: bröstkörtelepitelet 2 . Koronala eller longitudinella sektioner är mer användbara för karakterisering av normal vävnad 5 och förbättrar avsevärt detekteringen av abnormiteter och lesioner på grund av den ökade ytarean och antalet strukturer som är närvarande. Sammantaget gör det hela moInte en lämplig metod för den jämförande histopatologiska bedömningen av bröstkörteln 1 , 2 . Om man använder en mus eller en råtta, hämtning och bevarande av den 4: e och femte ingreppskörteln rekommenderas starkt för jämförelsen av hela fästet till en kontralateral H & E-sektion.

När de används i kombination, ger H & E-sektionen och hela monteringen ett korrekt redogörelse för cell- och morfologiska förändringar som orsakas av miljöexponering. Detta är särskilt sant i vissa gnagare stammar där modellen har en låg mottaglighet för tumörbildning eller en tumör inte är grovt synlig. Under vissa omständigheter är det inte alltid möjligt att erhålla den erforderliga vävnaden med båda teknikerna ( dvs. otillräcklig vävnadsmängd, resurser eller oväntade experimentella resultat). I vårt fall observerades abnormiteter i bröstmassan, medan histopathoLogiska fynd i den kontralaterala H & E-körteln var vanligen normala. Den överväldigande skillnaden mellan de kontralaterala körtlarna ledde oss till att utveckla ett ekonomiskt och effektivt förfarande för att identifiera avvikelserna i hela fästena. Med användning av ett modifierat förädlings- och inbäddningsförfarande framställdes högkvalitativa H & E-färgade sektioner från paraffininkopplade helmonteringar. Vi ser det här protokollet som ett kraftfullt upptäcktverktyg för kemiska exponeringseffekter, vilket förbättrar jämförelser mellan laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

All djuranvändning och procedurer för denna studie godkändes av NIEHS Laboratory Animal

Vård och användningskommitté och genomfört i en förening för bedömning och ackreditering av

Laboratorie Animal Care-ackrediterad anläggning.

1. Mammary Whole Mount Preparation 2 , 3 , 6 , 7

  1. Ta bort de inguinala bröstkörtlarna från en sida av en icke-gravid CD-1 kvinnlig mus, som beskrivs i referens 3 , och placera dem på en elektrostatiskt laddad glid.
  2. Täck körteln med non-stick papper eller film och placera en annan bild på toppen. Lägg till tryck ( dvs vattenvikter) till glidbanan för att sprida körteln ut platt så att körteln kommer att hålla fast vid glidbanan för fixering.
  3. Dunkla diabilderna i fixativet ( t.ex. 100% etanol, kloroform och isättika i ett förhållande 6: 3: 1)Över natten vid rumstemperatur.
  4. Ta bort körtlarna från fixativet och tvätta i etanol i 15-30 minuter. Efter 30 minuters tvätt, byt gradvis till vatten genom att hälla ut 1/3 av etanolen och tillsätta vatten. Låt tvätten sitta i ca 5 min varje gång och upprepa med tillsats av vatten 3 gånger.
  5. Stain ( t.ex. carmine alum-lösning) i 12-24 timmar.
    OBS! Tjockare vävnader kräver längre färgningstider. Se referens 3 för färgning detaljer.
  6. Häll av fläcken efter den tilldelade tiden och skölj glidorna i vatten i 30 s. Dehydrera vävnaderna genom att tvätta glidbanorna i 70% etanol i 15 minuter, följt av 15 minuters tvätt i 95% etanol och en slutlig tvätt i 100% etanol under 20 minuter.
  7. Rensa fettet från vävnaderna genom att placera dem i xylen i minst 24 timmar, eller längre om vävnaden är tjock så att eventuella ogenomskinliga eller vita ytor avlägsnas.
  8. Ta bort vävnaden från xylenen och tillsätt snabbt mOjämn medium till glidbanan för att undvika vävnadsdehydrering; Placera en täckglas på toppen. Låt sliden torka i minst 48 timmar.
  9. Utvärdera den helmonterade vävnaden för avvikelser, som beskrivs i 2 .
    OBS! När lesioner upptäcks i hela fästen och sektioner är nödvändiga för att fastställa deras identitet, ska följande steg följas.

2. Avlägsnande av hela mammamammaren från en glasskiva

  1. Ta bort täckglaset och monteringsmediet genom att nedsänka bröstmedlet i helglaset i en glasfärgburk fylld med xylen över natten.
    OBS! Tjockare vävnader och glidbanor med överdriven monteringslösning kan kräva ytterligare tid för täckplåtsavlägsnande.
  2. Efter den första natten över natten, lägg glidorna i fräsch xylen och blöt i 6 timmar. Gör en sista blöt i färsk xylen över natten.
    OBS! Skyddsglaset faller lätt efter glidningen
  3. Med agÄlskad hand, håll bilden och ta försiktigt bort täckglaset med ett par tångar för att säkerställa att den tas bort i ett stycke.
    OBS! Om luckan fortfarande är fäst på glasskivan fortsätt blötläggning tills den kan avlägsnas med liten ansträngning.
  4. När du har tagit bort skyddsglaset håller du bilden vinkelrätt mot en petriskål med glas, som innehåller xylen, försiktigt ta en skarp, engångs rakblad och skjut bladet i en rörelse nerför objektglaset.
  5. När vävnaden är avlägsnad, sjunka snabbt bröstkorget i en xylenfylld petrifat för att säkerställa att vävnaden inte lufttorkar.
    OBS! Var försiktig med detta steg. Hela monteringen är tunn (≤ 1 mm) och ömtålig från xylenbearbetning. Eventuella intryck eller tårar kan förändra vävnadens morfologi och komplicera senare utvärderingar.

3. Vävnadsbehandling

  1. När vävnaden är i Petriskålen, överför den försiktigtTill en märkt histologi-kassett. Ta tag i kanten av fettkudden med trubbiga nätspetsar för att minimera vävnadsskador.
    1. Använd en rakhyvel, skär större vävnader (speciellt för råttor) i halva och placera dem i två separata märkta kassetter som rymmer vävnadsstorleken. Placera vävnaden höger upp (använd lymfkörteln som referens). Se till att vävnaden utan lymfkörteln hålls i samma upprättstående position när den överförs till kassetten.
  2. Placera kassetten i en behållare med xylen i upp till 2 timmar innan du placerar den i vävnadsprocessorn.
    OBS! Det rekommenderas att bearbeta proverna samma dag som de placeras i kassetten. Utökad blötläggning i xylen har inte testats.
  3. Ladda maximalt antal kassetter i vävnadsprocessorn för hand.
  4. Före början, programmera alla reagenser som kommer att användas för denna process i processorns reagenslista. För att automatisera rörelsenFrån en station till nästa, använd menyalternativen och skapa ett nytt program. När alla steg har slutförts, välj "OK" för att fortsätta.
    OBS! Processorn tillåter granskning av alla stationsdetaljer innan de startas.
    1. Automatisera processorn för att suga kassetterna i xylen i 30 minuter vid 37 ° C, följt av en andra blöt i färsk xylen under samma betingelser. Automatisera processorn för att ta bort kassetterna från xylenlösningen och överföra vävnaderna till nästa station innehållande en 1: 1 xylen: smält paraffinblandning, inställd vid 60 ° C under 30 minuter.
      OBS! Processorn överför sedan kassetterna till en ny kammare som innehåller smält paraffin i 1 timme. Efter 1 timme överförs proverna automatiskt till en ny kammare med färsk smält paraffin och bearbetas ytterligare 2 timmar. Båda stegen utförs vid 60 ° C.
    2. Processorn överför sedan kassetterna till stationen som innehåller smält paraFin i 1 h. Därefter överförs proverna automatiskt till slutstationen av färsk smält paraffin och bearbetas under ytterligare 2 timmar. Båda stegen utförs vid 60 ° C.

4. Inbäddning av den bearbetade mammanvävnaden

  1. Placera kassetterna i 58 ° C-paraffinhållarens behållare i inbäddningsstationen tills de är redo att bädda in vävnaden i formen.
  2. Ta bort kassettlocket för att bestämma den bästa formstorleken för vävnaden. Se till att formen är tillräckligt stor för att rymma vävnaden och lämna tillräckligt med utrymme för att få en vävnadsfri kant av paraffin runt omkretsen.
  3. Tillsätt 3-4 mm smält paraffin till formen och rikta in hela bröstmassan, som var intill botten av glasskenan och botten av kassetten vänd upp i formen.
  4. Överför formen till en kylplatta och justera vävnaden snabbt efter behov så att den är parallell med formen bottom.
    OBS! När paraffinen har hårdnat kommer vävnaden att försäkra sig på plats.
  5. Använda varma tångar, placera den märkta bottenhalvan av kassetten ovanpå formen; Tryck fast med tangarna.
  6. Lägg till ytterligare smält paraffin i formen i en kontinuerlig rörelse för att täcka hela kassetten. Flytta formen från den varma plattan till en kallplåt för att slutföra härdningen av blocket.
  7. Ta bort blocket från formen när paraffinen fullständigt stelnar för att undvika sprickor eller luftbubblor.
    ANMÄRKNING: Förvara de paraffininkopplade vävnaderna vid rumstemperatur tills de är färdiga till sektionen.

5. Sektionering av den paraffin-inbäddade mammarvävnaden på mikrotomen

  1. Innan snittning inkuberas paraffinblocken vid -20 ° C i 1 h.
    OBS! Det kommer att finnas kvarstående monteringsmedium i blocket från den ursprungliga täckplåten i hela vägen. Kylning av kvarteret förbättrar blockskärning och bandning.
  2. Förbered mikrofonenRotom genom att sätta på vattenbadet, innehållande nytt destillerat vatten och justera temperaturen till 42-45 ° C. Placera ett nytt, lågprofiligt blad på mikrotomen och sätt det på 4 μm.
    OBS: Sektionskvaliteten minskas med sektioner tjockare än 4 μm på grund av förekomsten av kvarvarande monteringsmedium i vävnaden.
  3. Sätt in blocket i mikrotomen med vaxet vänd mot bladet och inriktat mot vertikalplanet. Därefter fuktar du en sektion av gasväskan i kallt vatten och lägger det på blocket i flera minuter.
  4. Avdela kvarteret genom att vrida det stora hjulet medurs i rörelse i kombination med det grova avancerade hjulet tills ett fullständigt ansikte eller en representativ del av kvarteret erhålls.
    OBS! Vävnaden är tunn på grund av xylenröjning under hela monteringsprocessen. Justera blocket ordentligt med bladet för att minimera antalet snitt för att få en representativ sektion.
  5. Välj bandetSnett försiktigt med bandet i det varma (45 ° C) vattenbadet (förberedt i förväg), låt vävnadskrynkorna släppa ut och försiktigt flyta en sektion på en ren glasruta.
  6. Placera objektglaset upprätt på ett torkställ för att ta bort överskott av vatten. Inkubera glidbanorna i en lätt öppnad glidlåda över natten vid 37 ° C.

6. Automatiserad och manuell H & E-färgning av delade mammamuskvävnader

  1. Före färgning lagras glidbanorna vid rumstemperatur.
  2. För automatisk färgning, välj H & E från fläckalternativen på huvudmenyn. Deparaffinisering, färgning och uttorkning är alla färdiga på den automatiska färgfärgen. Använd monteringsmedium och täckglas för att montera sektionerna.
  3. Om man manuellt bläddrar glidbanorna, avfymerar du sektionerna genom att sänka glidorna i xylen i 5 minuter. Överför till fräsch xylen och upprepa i 5 min.
  4. Rehydrera glidbanorna genom att fördjupaEm två gånger i 100% etanol i 3 min vardera, följt av två repetitioner i fräsch 95% etanol och två separata tvättar i 1X tvättbuffert vid 5 min vardera.
  5. Skölj glidorna i destillerat vatten.
  6. Lägg glidarna i hematoxylinet i 1-2 minuter. Ta bort glidbanorna och skölj dem med rinnande kranvatten i 5 minuter.
    OBS: Filtrera hematoxylin före varje användning.
  7. Placera bilderna i 1% isättiksyra i 30 s för att främja färgdifferentiering och skölj sedan i rinnande kranvatten i 1 min.
  8. Lägg glidor till 1X PBS i 30 s till 1 min till blått vävnadssektionerna, följt av en 5 min sköljning i kranvatten och sedan i 95% alkohol i 15-20 s.
  9. Counterstain med eosinlösning i 30 s till 1 min. Därefter dehydreras objektglasen två gånger i 95% etanol, följt av två färska repetitioner i 100% etanol. Utför varje tvätt under 5 minuter.
  10. Rensa diabilderna i xylen, med två ändringar i xylen i 5 min vardera.
  11. CoverVävnadssektionen med monteringsmedium och torr platt över natten vid rumstemperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna metod är effektiv för att hjälpa till med diagnoser som annars kan ha missat om den ursprungliga kontralaterala H & E-delen av bröstkudden inte visade några histologiska förändringar. Utfallet kommer dock endast att vara användbart om det tas hand om under den första hela beredningen, liksom under beredningen av vävnaden för den histologiska utvärderingen. Inbäddning av paraffin kommer att ge skydd och hjälper till att bevara vävnaden för framtida snittning.

För att bestämma den ideala tjockleken hos bröstvävnaden framställdes 4 pm och 6 pm sektioner. Vi testade djup som var större än felmarginalen ± 1 μm på mikrotomen. Sektioner med en tjocklek av 6 μm ( Figur 1A ) var mycket täta med kompakta celler. Sammantaget saknade objektglasen distinkta cellulära detaljer som skulle vara nödvändiga för att göra en korrekt identifieringblue. Den optimala tjockleken var 4 μm ( Figur IB ). Dessa vävnader gav de bästa resultaten, där epitel- och stromområden och motsvarande celltyper lätt skiljdes.

Diabilder från en stor pågående studie användes för att illustrera enkelheten och användbarheten av denna metod. I flera fall har den ursprungliga H & E-sektionen från 14 månaders gamla jungfruliga CD-1-avkommor visat sig ha motstridiga fynd jämfört med det kontralaterala bröstfäste från samma djur. Lesioner var uppenbara i hela berget, men kunde inte identifieras utan ytterligare snittning och färgning. Prover från två olika djur valdes som representativa fall. I båda fallen användes en enda sektion för färgning, men flera stycken gjordes tills en representativ sektion erhölls. Mycket få nedskärningar var nödvändiga för att få en representativ sektion, eftersom tidigare förberedelser för helmonteringen rensades moSt av fettkudden, vilket lämnar körteln väldigt tunn jämfört med en bröstkörtel som ursprungligen är förberedd för inbäddning av paraffin, som omges av en tjock fet kudde. Figur 2 A och Figur 3 A illustrerar histologiska sektioner av körtlar som bedömdes som vanliga. Båda körtlarna visar duktala strukturer omgivna av en robust och homogen adipocytrik befolkning. Varje kanal är fodrad av ett enda lager av enkla kuboidala epitelceller och upprätthålls av ett andra lager av basalceller, huvudsakligen sammansatta av myopiteliala celler, men omfattar också stam- och stamcellerpopulationer. De representativa kontralaterala hela fästena ( figurerna 2B och figur 3B ) demonstrerade kanaler och stroma med ökad opacitet. Det var emellertid svårt att avgöra om opakenheten var resultatet av hyperplastiska, inflammatoriska eller neoplastiska förändringar medUt har en H & E sektion som kan ge distinkta cellulära detaljer.

Kontralaterala hela fästen från samma djur användes för att genomföra den metod som beskrivs här och kan observeras i Figur 2 C och D och Figur 3 C och D. Proverna i Figur 2 C & D diagnostiserades som perivaskulär inflammation på grund av det ökade antalet lymfocyter som var närvarande runt ett stort blodkärl i bröstkörteln. För det andra fallet bibehölls bröstkörteln lobulär arkitektur men förstorades multifokalt av det ökade antalet och storleken av normala alveoler och kanaler (lobuloalveolär hyperplasi). Alveolära epitelceller var väl differentierade, runda, ofta vakuolerade och bildade ett koncentriskt skikt runt en lumen som typiskt innehöll proteinhaltig vätska. DucTs fodrade av kolumnarceller och liknade alveolära celler, med ett väl differentierat epitel som bildade ett koncentriskt skikt. Denna fenotyp observeras oftast i bröstkörtlarna hos mid-pregnant möss och råttor. Detta bör inte förväxlas med lobuloalveolära strukturer i bröstkörtlarna hos vuxna hanrotter 8 . I den vuxna manliga bröstkörteln är alveoler framträdande och kanalen är sällsynta, men alveolerna och kanalerna är fodrade av stratifierat epitel med långa, vacuolerade kuoidala till korta kolumna epitelceller.

Figur 1
Figur 1 : Rekommenderad tjocklek för musbröstkörtel helmontering till H & E sektioner . A) 6 | im och B) 4 | im. Upplösningarna av bröstkörtelstrukturer var inte optimala för histopatologisk utvärdering med användning av den tjockare (6 - & #181; m) sektioner, så 4-μm sektionen rekommenderas. Denna siffra har modifierats från Tucker et al. 9 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2 : Hela montaget till H & E-delen av perivaskulär inflammation. Denna bild är en muskörtelkörtel som samlades i diestrus. A) Formalin-fixat H & E-bröstkörtelsnitt utan histopatogiska förändringar. B) Kontralateral helmonterad sektion, med områden med ökad opacitet (boxad area). C) 20x förstoring av en H & E-sektion från ett bröstfäste (boxed area). Kluster av mononukleära celler omringade blodkärlet och utsträcktes i den omgivande fettvävnaden. D) ThE 40x förstoring av en H & E-sektion från ett bröstfäste (boxed area) visar i större detalj att den största delen av den mononukleära populationen består av lymfocyter och belyser svårighetsgraden av den perivaskulära inflammationen. Denna siffra har modifierats från Tucker et al. 9 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3 : Hela montaget till H & E-sektionen av lobulär alveolär hyperplasi . Denna bild är en muskörtelkörtel som samlades i diestrus. A) Formalin-fixat H & E-bröstkörtelsnitt utan histopatologiska förändringar. B) Kontralateral helmonterad sektion med ökad opacitet i duktala och stromala områden (boxed ären). C) 20x förstoring av en H & E-sektion från ett bröstfäste (boxed area). Lobulärarkitektur bibehölls men förstorades multifokalt av det ökade antalet och storleken på normala alveoler och kanaler (lobuloalveolär hyperplasi). D) Den 40x förstoringen av en H & E-sektion från ett bröstmottagande bröd (boxed area) avslöjar att de förstorade lobulerna innehåller ett ökat antal alveoler och kanaler som är fodrade med väl differentierade, ofta vakuolerade epitelceller som bildar lumen som innehåller Proteinhaltig vätska. Denna siffra har modifierats från Tucker et al. 9 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bröstkörteln hel mount är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att illustrera den normala bröstutvecklingen och morfologiska förändringar som kan uppstå och kvarstår efter exponering för kemikalier, inklusive hormonförstörande medel. När en helmonterad och H & E-sektion från samma djur utvärderas tillsammans kan de ge en korrekt visuell ögonblicksbild av tidiga förändringar som kan utvecklas till ett mer sjukt tillstånd.

Förmågan att erhålla denna användbar information ligger i att försäkra sig om att vård tas till för att bevara och ej kompromissa glandulär morfologi när vävnaden tas bort. Medan gnagaren har flera bröstkörtelplatser placerade bilateralt längs dorsalväggen, rekommenderas att samla 4: e och 5: e körteln för att minimera återvinning av muskelvävnad. Bröstvårtfästningsområdet och lymfkörden bör också finnas närvarande, eftersom de tjänar som användbara morfologiska landmärken. Kirtlet bör också spridas och stretasChed över en plan yta ( dvs. en glasskiva, kartong eller tyg) för att nära efterlikna vävnads naturliga struktur in situ . Avvikelser i bröstkörteln är vanligtvis inte synliga förrän körteln har avfettats i xylen eller har blivit karminfärgade. Till skillnad från bröstvävnad som ursprungligen var förberedd för histologisk snittning, kommer ett helt berg som avlägsnats från glaset för paraffininkontering att vara extremt tunt och bräckligt. Tvinga intryck och vävnadstår ska undvikas, eftersom de eventuellt kommer att förändra cellmorfologin och göra histopatologiska utvärderingar av den färdiga produkten svåra.

När hela berget har blivit paraffininkopplat, före snittning rekommenderas att blocken inkuberas vid -20 ° C under 1 h. Detta steg förbättrar möjligheten att få en optimal representativ vävnadssektion i ett band. Sektionering av vävnaden vid 6 μm ( Figur 1A ) 9 Figur 1B ) 9 , identifierades alla cellulära egenskaper, inklusive epitelvävnad och omgivande stromalinfiltrat. Det bör också noteras att även om dessa sektioner tidigare var karminfärgade, var fläcken inte synlig efter snittning och störde inte H & E-färgning. Därför var ett avfärgningssteg inte nödvändigt i protokollet. Även om vävnadssektioner färgades uteslutande med H & E, förväntar vi oss med små modifieringar, andra histokemiska och eventuellt immunohistokemiska fläckar kan vara tillämpliga när sektionen är fullständig. Det var dock bortom omfattningen av detta protokoll och kommer att kräva ytterligare undersökning för att bestämma de optimala förutsättningarna för dessa fläckar.

Denna procedur utvecklades på grund av att vi observerade missvisande fynd mellan rutinmässigt uppsamlade vemLe mounts och kontralaterala H & E-färgade bröstkorgsektioner från samma djur. Liknande mammarprotokoll existerar 6 , 10 ; Förfarandena var dock inte detaljerade eller enkla att följa. Dessa metoder utgjorde en grund för utvecklingen av vårt protokoll. Normal körtelmorfologi observerades i H & E-färgade vävnadssektionerna ( Figur 2A och Figur 3A ) 1 , medan de komplementära helmonteringarna avslöjade många abnorma morfologiska särdrag ( Figur 2B och Figur 3B ) 9 . Genom att utföra histologi på hela fästen kunde vi klassificera de onormala funktionerna. Exempelvis identifierades perivaskulär inflammation och lobuloalveolär hyperplasi i två separata fall som var olikartade jämfört medE H & E-fynd som observerats i de kontralaterala sidorna ( Figur 2 C och D och Figur 3 C och D ) 9 .

För författarens kunskap finns det inga kända rapporter om brist på bröstkörteln som liknar dem som observerats i vår pågående studie. Detta kan emellertid bero på experimentella designproblem snarare än brist på förekomst, eftersom bröstkörteln ofta endast samlas in för en applikation eller analys som inte involverar morfologi, såsom RT-PCR eller Western blots. Emellertid innehåller många experiment flera applikationer som kräver en tillräcklig mängd vävnad för varje slutpunkt. De inguinala körtlarna är det föredragna valet för hela fästen och applikationer nedströms eftersom de sällan har förorenande omgivande vävnad som bröstkörtlarna ( dvs muskelförorening) och eftersom de inguinala bröstlymfkörtlarna ger värdetKunna landmärken för orientering och jämförelse över körtlarna. Att bestämma vilken körtel och hur mycket av körteln som kommer att användas för varje ansökan kommer därför att påverka detekteringens noggrannhet. Prioritering för användningen av bröstkörteln bör vara för: 1) en helhet fäste består av hela 4: e och 5: e körtlar, 2) histologi av den kontralaterala 4: e körtel innehållande viss lymfkörtel för användning som ett landmärke, och 3) Den kontralaterala 5: e körteln (utan förorenande lymfkörteln) för nedströmsapplikationer ( dvs. RNA, DNA och protein). Om en abnormitet är synlig vid nekropi, bör ett helt berg föredraget för histologiinsamling.

Som med något protokoll finns åtföljande begränsningar; Behovet av att permanent förstöra hela berget under snittning och ha begränsad vävnad för användning i alternativa analyser, till exempel. Således rekommenderar vi att du utför omfattande dokumentation av hela fästen med ett skrivbord sCanner att producera digitala bilder för framtida analys och referens. Om färgning inte kommer att ske inom en månad, begränsa antalet sektioner för att bevara vävnaden för framtida analyser. Fördelarna med denna hela monteringen till H & E-sektionsmetoden uppväger begränsningarna, så att den kan tillämpas universellt på mammarstudier som involverar flera discipliner, särskilt toxikologi. Flera studier med kemikalier med kända endokrina effekter har inkluderat en modifierad version av detta protokoll, vilket visar dess tillämplighet 11 , 12 , 13 . Resultat från dessa studier kan bidra till att minska risken för en falsk negativ i kemisk provning men kan också ge ny eller ytterligare information som kan användas för beslutsfattande och riskbedömning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga motstridiga intressen att förklara i samband med forskning, författarskap och / eller publicering av denna artikel.

Acknowledgments

Författarna skulle vilja bekräfta Pam Ovwigho, Tenette Jones och Natasha Clayton, NIEHS, för deras tekniska expertis och stöd med detta projekt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Permount Thermo Fisher Scientific SP15-100 mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections
Leica automated processor Leica Biosystems Model # ST5020
HM 355S Automatic Microtome Thermo Fisher Scientific  905200
Paraffin Leica Biosystems EM-400
Superfrost plus microscope slides Thermo Fisher Scientific 4951PLUS-001 electrostatically charged
Fisher Finest 24x60x1 Thermo Fisher Scientific 12-548-5P coverslips
Varistain Gemini ES Automatic slide stainer Thermo Fisher Scientific A78000014
Sta-On Leica Biosystems 3803107 liquid adhesive; used in water bath at sectioning
Modified Harris Hematoxylin 72711 Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) 72711
Eosin Leica Biosystems 3801600
Lithium Carbonate SkyTech Laboratories LCQ500
Glacial Acetic Acid Thermo Fisher Scientific A38-500 needed in Carnoy's fixative
Chloroform Macron Fine Chemicals 4440-04 needed in Carnoy's fixative
100% Ethanol The Warner Graham Company 6505001050000 needed in Carnoy's fixative and washing slides
95% Ethanol The Warner Graham Company 6505011137320190
Carmine Alum Sigma-Aldrich C1022-25G
Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra Sigma-Aldrich A7210-500G
Automation wash buffer, 20X Biocare Medical TWB945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119, (8), 1053-1061 (2011).
  2. Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41, (2), 190-209 (2013).
  3. Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. In press (2017).
  4. Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf (2011).
  5. Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf (2011).
  6. Mammary gland whole mount processing and staining. Available from: http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm (2016).
  7. Whole mount preparations. Available from: http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149 (2016).
  8. Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44, (7), 1034-1058 (2016).
  9. Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44, (7), 1059-1064 (2016).
  10. Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63, (4), 317-324 (2011).
  11. Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146, (9), 4138-4147 (2005).
  12. Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147, (10), 4871-4882 (2006).
  13. Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18, (6), 803-811 (2004).
Sektion Mammary Gland Whole Mounts för Lesion Identification
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).More

Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter