Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları

doi: 10.3791/55796 Published: July 24, 2017

Summary

Başlangıçta slaytlar üzerinde sabitlenmiş olan meme dokusunu histopatolojik değerlendirme için başarıyla çıkarmak, işlemek, kesmek ve lekelenmek için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, üreme ve gelişimsel test kılavuz çalışmalarında meme bezlerinin tümünün monte edilmesini ve değerlendirilmesini teşvik edebilir.

Abstract

Normal meme bezi gelişimi, çevresel toksik maddelere ve farmasötik ürünlere maruz kalma, hormonlara aşırı maruz kalma ve genetik değişikliklerle değiştirilebilir. Meme bezi tüm montajları maruz kaldıktan sonra ortaya çıkabilecek morfolojik değişikliklerin ilerlemesini yakalamak için ucuz bir yöntemdir. Bununla birlikte, sonraki yaşamda, anormalliklerin gelişme eğilimi daha fazla olduğunda, bu metot üzerindeki tek dayanak, anormalliği doğru bir şekilde teşhis etmek için her zaman yeterli bilgi sağlamayabilir. Tarihsel olarak, kimyasal test kılavuz çalışmalarında tek bir meme bezi otopside alınır ve hematoksilen ve eozin (H & E) boyalı kesit olarak hazırlanır. Karşı taraf meme tüm montajı toplama ve analizin dahil edilmesi yanlış-negatif bir değerlendirme olasılığını azaltır. Tüm desteğin değerlendirilmesi, bir slaytta bir veya iki tüm meme bezinin varlığı ile sınırlıdır ve bazı durumlarda, tüm yuvada gözlemlenen anormallikler hayırH & E bölümünde tek biçimli olarak temsil edilmiştir. Bu çalışmanın amacı, aksi halde kaçırılmış veya tanı koymak güç olan lezyonların tanımlanması için lamelleri örten meme tümörünün H & E lekeli bölümlerine dönüştürülmesi için bir protokol geliştirmektir. Burada, başlangıçta bütün olarak hazırlanan meme bezinden yüksek kaliteli, parafin gömülü bir H & E bölümü üretmek için bir yöntem ayrıntılı. H & E kesitlemesi için kasıtlı olarak hazırlanmış bir dokuya kıyasla, tüm gövde doku çıkartılması ve işlenmesi için ilave hazırlık gerektirir. Bununla birlikte, bu yöntem, ortak lab reaktifleri ve az ek süre gerektirdiği için ucuzdur. Sonuç olarak, bu metot, kimyasal ve çevresel maruziyetlerin normal meme gelişimini nasıl değiştireceği ve genetik değişiklikler nedeniyle oluşan değişiklikleri gösterdiği konusunda çok değerli bilgiler sağlayabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Meme bütünlüğü, normal ve kimyasal olarak uyarılan anormal gelişimin anlaşılması için birçok sıçan ve fare çalışmasında uygulanan yararlı ve ucuz bir yöntemdir. Genel olarak, kemirgen gelişimi sırasında ( yani ergenlik, ergenlik, orta-geç gebelik ve involüsyon evresi) çeşitli aşamalarında toplanan bir meme bezi, parakrin, endokrin ve otokrin faktörlerden etkilenen doku ve hücresel mimaride morfolojik değişiklikler gösterecektir 1 . Yaşlanmakta olan sıçanda, bezin epitelial ve stromal kısımları gittikçe yoğunlaşmakta ve bu da morfolojik parametrelerin ölçülmesini bütün montajda zorlaştırmaktadır. Bu nedenle mikroskobik seviyedeki değişiklikleri tanımlamak için histolojik değerlendirme için bir bez toplamak yaygın bir uygulamadır. Her iki proses özellikle kimyasal maruziyeti içeren ( yani çevresel veya farmasötik) çalışmaları veya genetik değişiklik eşliğinde morfolojik değişiklikleri incelemek için yararlıdırations.

Risk değerlendirmesinde meme bezini kullanma teknikleri ve yetenekleri gelişmeye devam etmektedir. Bütün montaj hazırlığı rutin ve standartlaştırılmış iken, kesitlemedeki değişiklikler 2 , 3'e devam eder. Bazı laboratuarlar hala deri 4 boyunca enine kesim bölümleri kullanırken çeşitli arka (yani, akademik, hükümet ve endüstri) gelen çok sayıda araştırma grupları, tercih edilen yöntem olarak meme dokusunda uzunlamasına / koronal kesitler adapte edilmiştir. İkinci yöntem, ilgili dokudan ziyade epidermisin (cilt) aşırı derecede temsil edilmesine neden olur: meme bezi epiteli 2 . Koronal veya uzunlamasına kesitler, normal dokuyu 5 karakterize etmek için daha kullanışlıdır ve artan yüzey alanı ve mevcut yapıların sayısı nedeniyle anormalliklerin ve lezyonların belirlenmesini büyük ölçüde iyileştirir. Genel olarak, bu bütün mo yaparMeme bezi 1 , 2 karşılaştırmalı histopatolojik değerlendirme için uygun bir yöntem. Kasık bezleri inci bir fare ya da bir fare, alma ve 4. korunmasını ve 5 kullanılarak yüksek tüm karşılaştırılması için önerilir olsun kontralateral H & E bölümüne monte edilir.

Bileşik olarak kullanıldığında, H & E bölümü ve tüm montaj, çevresel maruz kalmanın neden olduğu hücresel ve morfolojik değişikliklerin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlar. Bu, özellikle modelin tümör oluşumuna karşı düşük duyarlılığa sahip olduğu veya tümörün gözle görülemediği bazı kemirgen suşlarında özellikle geçerlidir. Bazı durumlarda, gerekli dokuyu elde etmek her zaman her iki yöntemi de ( ör. Yetersiz doku miktarı, kaynak veya beklenmedik deney sonuçları) kullanarak mümkün olmayabilir. Olgumuzda meme tümü anormallikleri görülürken histopatoKontralateral H & E bezindeki mantıklı bulgular çoğunlukla normaldi. Kontrlateral bezler arasındaki ezici tutarsızlık, tüm bağlardaki anormalliklerin saptanması için ekonomik ve etkili bir prosedür geliştirdi. Modifiye edilmiş bir işleme ve gömme işlemi uygulayarak, yüksek kaliteli H & E lekeli kesitler, parafin gömülü tüm montajlardan hazırlandı. Bu protokolün kimyasal maruz kalma etkileri için güçlü bir algılama aracı haline gelmesini ve laboratuvarlar arası karşılaştırmaları geliştirmesini düşünüyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışma için tüm hayvan kullanımı ve prosedürleri NIEHS Laboratuar Hayvan

Bakım ve Kullanım Komitesi ve bir Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği

Laboratuar Hayvan Bakımı tarafından akredite edilmiş tesis.

1. Meme Tam montajlı Hazırlama 2 , 3 , 6 , 7

  1. Referans 3'te açıklandığı gibi gebe olmayan bir CD-1 dişi farenin bir tarafındaki kasık bezi bezlerini çıkarın ve bunları elektrostatik yüklü bir slayda yerleştirin.
  2. Bezi yapışmayan kâğıda veya filmle örtün ve üstüne başka bir slayt yerleştirin. Sızdırmazlık bezi sabitlemek için sızdırmazlık bezi slaytlar yapacak şekilde bezin düz bir şekilde dışarıya yayılması için slayda basınç ( yani su ağırlıkları) ekleyin.
  3. Slaytları fiksatif suya daldırın ( örn. % 100 etanol, kloroform ve buzlu asetik asit 6: 3: 1 oranında)Gece boyunca oda sıcaklığında.
  4. Fiksatif bezleri çıkarın ve 15-30 dakika etanol ile yıkayın. 30 dakikalık yıkamayı takiben, etanolun 1 / 3'ünü dökerek su ilave edin ve su ekleyin. Yıkama her seferinde yaklaşık 5 dakika bekletilmeli ve su ilave edilerek 3 kez tekrar edilmelidir.
  5. Lekeyi ( örn., Karmin alum çözeltisi) 12-24 saat boyunca.
    NOT: Daha kalın dokular uzun boyanma süreleri gerektirir. Boyama detayları için referans 3'e bakınız.
  6. Boşa dökülen zamandan sonra dökün ve slaytları 30 saniye süreyle suyla durulayın. Slaytları% 70 etanol içinde 15 dakika yıkayarak dokuları kurutun, bunu takiben% 95 etanol içinde 15 dakika yıkayın ve 20 dakika süreyle% 100 etanol içinde nihai yıkama yapın.
  7. En az 24 saat boyunca ksilende yerleştirerek dokulardaki yağları temizleyin veya doku kalınsa herhangi bir opak veya beyaz alanı uzaklaştırmak için yağları temizleyin.
  8. Ksilenden dokuyu çıkarın ve hızlı bir şekilde mDoku dehidrasyonunu önlemek için slaydaya orta besleme; Üzerine lamel yerleştirin. Slayt en az 48 saat kurumasını bekleyin.
  9. 2'de tarif edildiği gibi, anormallikleri için bütün monte doku değerlendirir.
    NOT: Tüm lekelerde lezyonlar tespit edildiğinde ve bölümlerin kimlik tespiti için gerekli olması durumunda aşağıdaki adımlar takip edilmelidir.

2. Bir Cam Slayt'dan Sütun Dağı Tümünün Çıkarılması

  1. Mamul tam monte slayt bir gece boyunca ksilen dolu cam boyama kavanoza batırarak lamel ve montaj orta çıkarın.
    NOT: Aşırı montaj çözeltisine sahip daha kalın dokular ve slaytlar lamel kaldırma için ek zaman gerektirebilir.
  2. İlk gece beklettikten sonra, slaytları taze ksilen içine yerleştirin ve 6 saat bekletin. Bir gece boyunca taze ksilen koyun.
    NOT: Lambalı son bulamadan sonra slayttan kolayca düşer.
  3. Ag ileElinizi severek slayt tutun ve bir parça halinde çıkarılmasını sağlamak için dikkatli bir forsepsle birlikte lamelleri çıkarın.
    NOT: Lamerleri hala cam slaydına yapıştırdıysanız, az miktarda çaba harcayana kadar ıslanmaya devam edin.
  4. Lamel kaldırıldıktan sonra, sürgüyü ksilen içeren cam bir Petri kabına dik tutun, dikkatlice keskin, tek kullanımlık traş bıçağı alın ve bıçağı kaydırarak tek bir hareketle kaydırın.
  5. Doku kaldırıldıktan sonra, dokunun hava kuruması sağlanmadığından emin olmak için meme pedini bir ksilen dolu cam Petri kabına daldırın.
    NOT: Bu adımda dikkatli olun. Bütün gövde ince (≤ 1 mm) ve ksilen işlenmesinden kırılgan. Herhangi bir izlenim veya gözyaşı dokunun morfolojisini değiştirebilir ve daha sonraki değerlendirmeleri daha da karmaşık hale getirebilir.

3. Doku İşleme

  1. Doku Petri kabında olduğunda, onu dikkatle aktarınEtiketlenmiş bir histoloji kasetine. Doku hasarını en aza indirgemek için küt uçlu, tırtıklı uçlu forseps ile yağ yastığının kenarından tutun.
    1. Bir ustura kullanarak, büyük dokuları (özellikle sıçanlar için) yarım kesip, doku boyutlarını karşılayacak iki ayrı etiketli kasete yerleştirin. Dokuyu sağ tarafa yerleştirin (lenf nodunu referans olarak kullanın). Lenf düğümü olmayan dokunun, kasete aktarıldığında aynı dik konumda tutulduğundan emin olun.
  2. Kaseti, doku işlemcisine yerleştirmeden önce en fazla 2 saat boyunca bir ksilen kabı içine yerleştirin.
    NOT: Örneklerin kasete yerleştirildiği gün işleme tabi tutulması önerilir. Ksilen içinde uzatılmış ıslatma test edilmemiştir.
  3. Elle doku işlemcisine maksimum sayıda kaset yükleyin.
  4. Başlamadan önce, bu işlem için kullanılacak tüm reaktifleri işlemcinin reaktif listesine programlayın. Hareketi otomatikleştirmek içinBir istasyondan diğerine geçmek için menü seçeneklerini kullanın ve yeni bir program oluşturun. Tüm adımlar tamamlandığında, devam etmek için 'Tamam'ı seçin.
    NOT: İşlemci, başlamadan önce tüm istasyon ayrıntılarının gözden geçirilmesine izin verir.
    1. İşlemciyi kasetleri, 37 ° C'de 30 dakika boyunca ksilen içinde bekletmek üzere otomatik hale getirin ve ardından ikinci kez aynı koşullar altında yeni ksilen emdirin. İşlemciyi, ksilol çözeltisinden çıkarmak için makineyi otomatikleştirin ve dokuları 30 dakika boyunca 60 ° C'ye ayarlanmış bir 1: 1 ksilen: eritilmiş parafin karışımı içeren bir sonraki istasyona aktarın.
      NOT: İşlemci daha sonra kasetleri, 1 saat erimiş parafin içeren yeni bir odaya aktaracaktır. 1 saat sonra numuneler otomatik olarak yeni bir eriyik parafin odasına aktarılır ve 2 saat daha işlenir. Her iki adım da 60 ° C'de gerçekleştirilir.
    2. İşlemci daha sonra kasetleri eriyik para içeren istasyona aktarır1 saat boyunca ffin. Daha sonra, numuneler otomatik olarak taze eritilmiş parafinin son istasyonuna aktarılır ve 2 saat daha işlenir. Her iki adım da 60 ° C'de gerçekleştirilir.

4. İşlenmiş Meme Doku Gömme

  1. Kasetleri kalıba gömmek için hazır olana kadar gömme istasyonunun 58 ° C'lik parafin tutma tankına yerleştirin.
  2. Doku için en iyi kalıp boyutunu belirlemek için kaset kapağını çıkarın. Kalıbın dokuyu yerleştirmek için yeterince büyük olduğundan ve çevre çevresinde doku içermeyen parafin bir sınır olması için yeterli yer bıraktığından emin olun.
  3. Kalıpta 3-4 mm erimiş parafin ekleyin ve cam slaytun tabanına ve kasetin altına komşu olan memeye tümüyle monte edilmiş yüzeyi, kalıpta yukarı bakacak şekilde yönlendirin.
  4. Kalıbı bir soğutma plakasına aktarın ve dokuyu gerektiğinde kalıba paralel olacak şekilde hızla ayarlayın bottom.
    NOT: Parafin sertleştikten sonra doku yerinde korunacaktır.
  5. Sıcak forseps kullanarak kasetin etiketli alt yarısını kalıp üzerine yerleştirin; Forseps kullanarak sıkıca bastırın.
  6. Tüm kaseti kaplayacak şekilde sürekli eriyik halinde kalıba ilave erimiş parafin ekleyin. Blok sertleşmesini tamamlamak için kalıp ılık plakadan soğuk bir plakaya hareket ettirin.
  7. Çatlaklar veya hava kabarcığı önlemek için parafin tamamen katılaştığında bloğu kalıptan çıkarın.
    NOT: Parafine gömülmüş dokuları, hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.

5. Parafine gömülü Meme Dokusunun MikroTomda Parçalanması

  1. Kesit almadan önce parafin bloklarını -20 ° C'de 1 saat inkübe edin.
    NOT: Blokta, orijinal kaplamalı tüm montaj dokusundan artık montaj ortamı olacaktır. Bloğu soğutmak, blok kesitlemeyi ve şeritleme işlemini geliştirir.
  2. Mikrofonu hazırlaTaze susuz su içeren su banyosunu açarak rotome yapın ve sıcaklığı 42-45 ° C'ye ayarlayın. Mikrotom üzerine yeni, alçak profilli bir bıçak yerleştirin ve 4 μm'ye ayarlayın.
    NOT: Dokuda artık montaj ortamı bulunması nedeniyle bölüm kalitesi 4 μm'den kalın bölümlerle azalır.
  3. Balonu balata bakacak ve dikey düzleme hizalayacak şekilde bloğu mikrotom içine yerleştirin. Ardından, gazlı bezin bir bölümünü soğuk suda nemlendirin ve birkaç dakika boyunca bloğa yerleştirin.
  4. Büyük tekerleği, kaba gelişmiş tekerlekle birlikte saat yönünde hareket ettirerek, tam bir yüz veya temsilci blok bölümü elde edilinceye kadar bloğu parçalayın.
    NOT: Bütün montaj işlemi sırasında ksilen temizlendiğinden doku incedir. Temsili bir kesim elde etmede kesilme sayısını en aza indirgemek için bloğu düz bıçakla hizalayın.
  5. Şerit seçElle bölüp şeridi ılık (45 ° C) su banyosunda önceden püskürtün (önceden hazırlanmış), doku kırışıklarının dağılmasına izin verin ve bir bölümü temiz bir cam slayt üzerine dikkatlice yüzdürün.
  6. Fazla suyu alabilmek için slaytları dikey bir kurutucuya yerleştirin. Slaytları hafifçe açılmış bir slayt kutusunda gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.

6. Bölmeli Meme Dokularının Otomatik ve Manuel H & E boyanması

  1. Boyamadan önce, slaytlar oda sıcaklığında saklanır.
  2. Otomatik boyama için, ana menüdeki leke seçeneklerinden H & E'yi seçin. Deparaffinizasyon, boyama ve dehidrasyon, otomatik boyayıcıda tamamlanır. Bölümleri monte etmek için montaj orta ve lamel kullanın.
  3. Sürgüleri manuel olarak boyarsanız, sürgüleri 5 dakika süreyle ksilen içine batırarak bölümleri deparafinize hale getirin. Yeni ksilen'e aktarın ve 5 dakika tekrarlayın.
  4. Slaytları suya batırarak yeniden su haline getirin.Em üç dakikada% 100 etanol ile iki kere uygulayın, bunu takiben% 95 taze etanol içinde iki kez tekrarlayın ve 5 dakikada bir 1X yıkama tamponu içinde iki ayrı yıkama yapın.
  5. Slaytları damıtılmış suda yıkayın.
  6. Slaytları 1-2 dakika boyunca hematoksilen içine ekleyin. Sürgüleri çıkarın ve 5 dakika boyunca akan musluk suyu ile durulayın.
    NOT: Hematoksilen her kullanımdan önce filtrelenmelidir.
  7. Renk ayrımını artırmak için slaytları 30 saniye süreyle% 1 buzlu asetik asit içine yerleştirin ve akan musluk suyunda 1 dakika boyunca durulayın.
  8. Doku bölümlerini mavileştirmek için 30 saniye ile 1 dakika arasında 1X PBS'ye slaytlar ekleyin, bunu takiben musluk suyunda 5 dakika durulayın ve daha sonra 15-20 saat boyunca% 95 alkolle yıkayın.
  9. 30 dakika ila 1 dakika süreyle eozin çözeltisi ile karşı lekeler. Bunu takiben, slaytları taze% 95 etanol içinde iki kez kurutun ve ardından% 100 etanol içinde iki kez tekrarlayın. Her bir yıkamayı 5 dakika boyunca uygulayın.
  10. Ksilendeki kayaları temizleyin, her biri 5 dakika süreyle ksilende iki değişiklik yapın.
  11. coverslipMontaj orta ve kuru gece boyunca oda sıcaklığında doku bölümü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yöntem, meme yastığının orijinal kontralateral H & E bölümünde herhangi bir histolojik değişiklik göstermediyse, aksi halde kaçılacak tanılarla desteklemede etkilidir. Bununla birlikte, sonuç, yalnızca başlangıçtaki bütün montaj hazırlığında ve histolojik değerlendirme için doku hazırlanırken dikkat edilmesi halinde yararlı olacaktır. Parafin gömülmesi koruma sağlayacak ve gelecek bölümlere ayırmak için dokuyu korumaya yardımcı olacaktır.

Meme dokusunun ideal kalınlığını belirlemek için 4-μm ve 6-μm kesitleri hazırlandı. Mikrotom üzerinde hata marjı ± 1 μm'den daha büyük olan derinlikleri test ettik. 6 μm kalınlıktaki bölümler ( Şekil 1A ) kompakt hücrelerle çok yoğunlardı. Genel olarak, slaytlar uygun bir kimlik oluşturmak için gerekli olan farklı hücresel ayrıntılardan yoksundu.ication. En uygun kalınlık 4 μm idi ( Şekil 1B ). Bu dokular, epitelial ve stromal alanların ve karşılık gelen hücre tiplerinin kolaylıkla ayırt edildiği en iyi sonuçları vermiştir.

Bu yöntemin kolaylığı ve faydasını göstermek için büyük, devam etmekte olan bir çalışmadan elde edilen veriler sunulmuştur. Birkaç vakada, 14 aylık bakire dişi CD-1 yavrularından orijinal H & E bölümünün, aynı hayvandan alınan kontralateral meme tümü ile karşılaştırıldığında bulguları çelişkili olduğu bulundu. Tüm lekede lezyonlar belirgindi, ancak daha fazla kesitlendirme ve lekelenme olmadan tanımlanamadı. İki farklı hayvandan örnekler temsili vakalar olarak seçilmiştir. Her iki durumda da lekelenme için tek bir bölüm kullanıldı, ancak temsilci bir bölüm elde edilinceye kadar birkaç kesim yapıldı. Temsilci bir bölüm elde etmek için çok az kesme gerekiyordu, zira önceki tüm montaj hazırlıkları moKalınlığında bir yağ yastığı ile çevrili olan parafin gömme için hazırlanan bir meme bezine kıyasla bezi çok ince bırakarak yağ yastığının st'sini oluşturur. Şekil 2, A ve Şekil 3, bir normal olarak değerlendirildi bezlerinin histolojik bölümler gösterir. Her iki bez de, sağlam ve homojen bir adiposit zengini popülasyonla çevrili duktal yapıları göstermektedir. Her kanal, basit cuboidal epitel hücrelerinin tek bir katmanı ile kaplanır ve çoğunlukla miyoepitelyal hücrelerden oluşan, ancak kök ve progenitör hücre popülasyonlarını kapsayan ikinci bir temel hücre tabakası tarafından muhafaza edilir. Örnek karşı bütün bağlar (Şekil 2B ve Şekil 3, B) kanalları ve artan opaklıkla stroma gösterdi. Bununla birlikte, opaklığın hiperplastik, inflamatuar veya neoplastik değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek zorduFarklı hücresel ayrıntılar sağlayabilecek bir H & E bölümü olan.

Aynı hayvanlardan kontralateral tüm montajlar burada açıklanan yöntemi uygulamak için kullanıldı ve Şekil 2 C ve D ve Şekil 3 C ve D' de görülebilir. Şekil 2 C & D' deki örnekler, meme bezi bölümünde büyük bir kan damarı çevresinde bulunan lenfosit sayısının artması nedeniyle perivasküler inflamasyon olarak teşhis edildi. İkinci olguda, meme bezi lobüler mimarisi muhafaza edildi, ancak normal alveollerin ve kanalların sayısının ve büyüklüğünün artmasıyla (lobuloalveoler hiperplazi) multifokal olarak genişledi. Alveolar epitel hücreleri, iyi diferansiye edilmiş, yuvarlak, sık sık vaküole edilmiş ve tipik olarak proteinli sıvı içeren lümen çevresinde bir konsantrik tabaka oluşturdu. DucTs, kolumnar hücrelerle kaplanmıştı ve alveoler hücrelere benziyordu ve bir konsantrik katman oluşturan iyi diferansiye edilmiş bir epitel vardı. Bu fenotip, hamilelik dönemindeki farelerin ve sıçanların meme bezlerinde daha sık görülür. Yetişkin erkek sıçanların meme bezlerinde lobülo-venöz yapılar ile karıştırılmamalıdır 8 . Erişkin erkek meme bezinde alveoller belirgindir ve kanallar nadirdir, ancak alveoller ve kanallar, kataraktif epitel ile boyuna, vakuolize küboidal kısa kolumnar epitel hücreleriyle kaplanmıştır.

Şekil 1
Şekil 1 : H & E bölümlerine fare meme bezi tam montaj için önerilen kalınlık . A) 6 um ve B) 4 um. Meme bezi yapılarının çözünürlüğü histopatolojik değerlendirmede daha kalın (6 - & #181; m) kesitleri, bu nedenle 4-μm kesit önerilir. Bu rakam Tucker ve ark. Tarafından değiştirildi . 9 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2 : Perivasküler inflamasyonun H & E bölümüne tümü monte edilir. Bu görüntü diestrus'ta toplanmış bir fare meme bezi. A) Formalin-sabit H & E meme bezi bölümü histopatolojik değişiklikler içermez. B) Karşıtlık artmış opaklık alanları (kutulu alan) ile birlikte kontralateral tüm montaj bölümü. C) bir meme bütün montaj (kutulu alan) bir H & E bölümünde 20x büyütme. Mononükleer hücrelerin kümeleri, kan damarını çevreledi ve çevresindeki yağ dokusuna kadar uzattı. D) ThBir göğüs tüm montajından (kutulu alan) bir H & E bölümünün 40x büyütülmesi, mononükleer popülasyondan çoğunun lenfositlerden oluştuğu ve perivasküler iltihaplanmanın ciddiyetinin altını çizen daha ayrıntılı olarak gösterir. Bu rakam Tucker ve ark. Tarafından değiştirildi . 9 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3 : Lobüler alveoler hiperplazinin H & E bölümüne tam montaj . Bu görüntü diestrus'ta toplanmış bir fare meme bezi. A) Formalin-sabit H & E meme bezi bölümü histopatolojik değişiklikler içermez. B) Duktal ve stromal alanlarda artmış opasite ile kontralateral tam montaj bölümü (kutu halindea). C) bir meme bütün montaj (kutulu alan) bir H & E bölümünde 20x büyütme. Lobüler mimari korunmuş fakat artmış sayı ve normal alveol ve kanal kanallarının genişlemesi (lobüloalveolar hiperplazi) ile multifokal olarak büyütülmüştür. D) Bir meme tümöründen (kutulu alan) bir H & E bölümünün 40x büyütülmesi, büyütülmüş lobüllerin, iyi diferansiye edilmiş, çoğunlukla boşaltılmış epitel hücreleri tarafından astarlanan artmış sayıda alveoller ve kanallar içerdiğini ortaya çıkarır; bunlar, içerdiği lümenleri oluştururlar Proteinli sıvı. Bu rakam Tucker ve ark. Tarafından değiştirildi . 9 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Meme bezi tam montajı, endokrin bozucular da dahil olmak üzere kimyasallara maruz kaldıktan sonra ortaya çıkabilen ve devam edebilen normal meme gelişimini ve morfolojik değişiklikleri göstermek için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Aynı hayvandan bir bütün montaj ve H & E bölümü birlikte değerlendirildiğinde, erken hastalıkların daha hastalıklı bir duruma gelebilecekleri konusunda doğru görsel bir enstantane sağlayabilirler.

Bu yararlı bilgiyi edinme kabiliyeti, dokuyu çıkartırken glandüler morfolojiyi korumak ve bozmamak için özen gösterilmesinin sağlanmasında yatar. Kemirgen dorsal duvar boyunca iki taraflı bulunduğu birçok meme bezi siteleri vardır, kas dokusu kurtarma aza indirmek için 4 ve 5. bezlerini toplamak için tavsiye edilir. Meme yüzeyinde bağlanma bölgesi ve lenf nodu da bulunmalıdır çünkü bunlar yararlı morfolojik yerlerdir. Bez ayrıca yayılmalı ve gerilmeliIn situ dokunun doğal yapısını yakından taklit etmek için düz bir yüzeye ( örneğin bir cam slayt, kağıt stoğu veya bez) geçirilir . Meme bezi içindeki anormallikler, bez ksilen dezenfekte edilinceye kadar veya carmine lekeleninceye kadar genellikle görünür değildir. Histolojik kesitleme için başlangıçta hazırlanan meme dokusunun aksine, parafin gömme işlemi için camdan çıkarılmış bir bütün parça son derece ince ve kırılgan olacaktır. Forseps gösterimleri ve doku gözyaşıları, muhtemelen hücresel morfolojiyi değiştirecek ve bitmiş ürünün histopatolojik değerlendirmelerini zorlaştıracağından kaçınılmalıdır.

Kesitten önce tüm montaj parafin gömülü hale getirildiğinde blokların 1 saat boyunca -20 ° C'de inkübe edilmesine izin verilmesi önerilir. Bu adım, bir şeritte en uygun temsili doku bölümünü elde etme becerisini geliştirir. Dokunun 6 μm'de kesilmesi ( Şekil 1A ) 9 Şekil 1B ) 9 kullanarak, epitel dokusu ve çevresindeki stromal sızıntıları da içeren tüm hücresel özellikler kolayca tespit edildi. Ayrıca, bu bölümlerin önceden carmine lekeli olmasına rağmen, lekenin kesitlemeden sonra görünür olmadığı ve H & E boyanmasına müdahale etmediği de belirtilmelidir. Bu nedenle, protokolde bir lekelenme basamağı gerekli olmadı. Doku kesitleri yalnızca H & E ile boyandı, ancak küçük değişiklikler bekliyoruz, kesit tamamlandıktan sonra diğer histokimyasal ve muhtemelen immünohistokimyasal lekeler uygulanabilir. Bununla birlikte, bu protokolün kapsamı dışındadır ve bu lekeler için en uygun koşulları belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyulacaktır.

Bu prosedür geliştirildi çünkü rutin olarak toplananlar arasında tutarsız bulgular gördükLe bağlar ve kontralateral H & E boyalı meme bezi bölümlerini aynı hayvandan alır. Benzer meme protokolleri 6 , 10 ; Bununla birlikte, işlemler ayrıntılı veya takip edilmesi kolay değildir. Bu yöntemler protokolümüzün geliştirilmesi için bir temel oluşturdu. Tamamlayıcı bütün bağlar sayıda anormal morfolojik özellikleri içerirler (Şekil 2 B, Şekil 3-B) 9 ortaya koyarken normal bezi morfolojisi, H & E boyalı doku bölümleri (Şekil 2 A ve Şekil 3, A), 1 gözlenmiştir. Bütün bağlar üzerinde histoloji uygulayarak, anormal özellikleri sınıflandırabiliriz. Örneğin, perivasküler inflamasyon ve lobüloalveolar hiperplazi, iki ayrı vakada,Karşı taraflarda gözlenen H & E bulguları ( Şekil 2 C ve D ve Şekil 3 C ve D ) 9 .

Yazarların bilgisine göre, devam eden çalışmamızda görülen meme bezi uyuşmazlıklarına benzer bilinen bir rapor bulunmamaktadır. Bununla birlikte, meme bezi çoğu kez tek bir uygulama veya RT-PCR veya Western lekeleri gibi morfoloji içermeyen analizler için toplandığından, bunun oluşma eksikliği yerine deneysel tasarım sorunlarından kaynaklanıyor olabilir. Bununla birlikte, birçok deney, her son nokta için yeterli miktarda doku gerektiren çoklu uygulamalar içerir. İnguinal bezler, toraks bezleri gibi çevreleyen dokuları nadiren bulaştırdıkları için ( örn. Kas kontaminasyonu) tüm kulakçıklar ve aşağı akım uygulamaları için tercih edilen bir seçenektir ve kasık dudak lenf düğümleri valu sağlarYönlendirme ve karşılaştırma için bezler arası karşılaştırılabilir yer işaretleri. Bu nedenle, hangi bezin ve bezin ne kadarının her bir uygulamaya ayrıldığına karar verme, algılamanın hassasiyetini etkiler. Meme bezi kullanımı için Öncelik için olmalıdır: 1) bir bütün bütün 4 ve 5. bezleri oluşan montaj, 2) bir dönüm noktası olarak kullanılmak üzere bir lenf düğümü içeren bezi inci karşı 4 histoloji ve 3) alt uygulamalar için (kirlenmeye sebep olan hiçbir lenf nodu) karşı 5. bezi (örneğin, RNA, DNA ve protein). Nekropside bir anormallik görülüyorsa, histoloji toplama için bütün bir bağlanma tercih edilmelidir.

Herhangi bir protokolde olduğu gibi eşlik eden sınırlamalar vardır; Örneğin bölümleme sırasında bütün tahtanın kalıcı olarak yok edilmesi ve alternatif analizlerde kullanım için sınırlı dokuya ihtiyaç duyulması. Bu nedenle, bir masaüstüyle tüm montajları kapsamlı bir şekilde belgelemenizi öneririzGelecekteki analiz ve referans için dijital görüntüler üretmek için canner. Ayrıca, lekelenme bir ay içinde gerçekleşmezse, gelecek analizler için dokuyu korumak için kesilen bölüm sayısını sınırlayın. Bu bütün montajın H & E bölüm yöntemine sağladığı faydalar sınırlamalardan daha ağır basmaktadır, böylelikle birden çok disiplin, özellikle toksikoloji içeren meme çalışmalarına evrensel olarak uygulanabilir. Bilinen endokrin etkilere sahip kimyasalları kullanan birkaç çalışma, 11 , 12 , 13 numaralı uygulanabilirliklerini gösteren bu protokolün değiştirilmiş bir versiyonunu içermektedir. Bu araştırmalardan elde edilen bulgular, kimyasal testlerde yanlış negatif olma ihtimalini azaltmaya yardımcı olabilir, ancak düzenleyici ve risk değerlendirme kararlarında kullanılabilecek yeni veya ilave bilgi sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların, bu makalenin araştırması, yazarlığı ve / veya yayımı ile ilgili olarak beyan etmek için çelişkili çıkarları yoktur.

Acknowledgments

Yazarlar, bu projeyle ilgili teknik uzmanlıkları ve desteği için Pam Ovwigho, Tenette Jones ve Natasha Clayton, NIEHS'yi onaylamak istiyorlar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Permount Thermo Fisher Scientific SP15-100 mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections
Leica automated processor Leica Biosystems Model # ST5020
HM 355S Automatic Microtome Thermo Fisher Scientific  905200
Paraffin Leica Biosystems EM-400
Superfrost plus microscope slides Thermo Fisher Scientific 4951PLUS-001 electrostatically charged
Fisher Finest 24x60x1 Thermo Fisher Scientific 12-548-5P coverslips
Varistain Gemini ES Automatic slide stainer Thermo Fisher Scientific A78000014
Sta-On Leica Biosystems 3803107 liquid adhesive; used in water bath at sectioning
Modified Harris Hematoxylin 72711 Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) 72711
Eosin Leica Biosystems 3801600
Lithium Carbonate SkyTech Laboratories LCQ500
Glacial Acetic Acid Thermo Fisher Scientific A38-500 needed in Carnoy's fixative
Chloroform Macron Fine Chemicals 4440-04 needed in Carnoy's fixative
100% Ethanol The Warner Graham Company 6505001050000 needed in Carnoy's fixative and washing slides
95% Ethanol The Warner Graham Company 6505011137320190
Carmine Alum Sigma-Aldrich C1022-25G
Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra Sigma-Aldrich A7210-500G
Automation wash buffer, 20X Biocare Medical TWB945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119, (8), 1053-1061 (2011).
  2. Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41, (2), 190-209 (2013).
  3. Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. In press (2017).
  4. Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf (2011).
  5. Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf (2011).
  6. Mammary gland whole mount processing and staining. Available from: http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm (2016).
  7. Whole mount preparations. Available from: http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149 (2016).
  8. Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44, (7), 1034-1058 (2016).
  9. Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44, (7), 1059-1064 (2016).
  10. Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63, (4), 317-324 (2011).
  11. Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146, (9), 4138-4147 (2005).
  12. Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147, (10), 4871-4882 (2006).
  13. Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18, (6), 803-811 (2004).
Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).More

Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter