Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar sarcoplasmático Ca2 + reserva e função de remoção de cálcio diastólica em cardiomyocytes por um sistema de imagem de cálcio.
Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Retículo sarcoplasmático cardíaco (SR) serve como um reservatório de Ca2 + para a contração, que reuptakes intracelular Ca2 + durante o relaxamento. A SR Ca2 + reserva disponível para batidas é determinante para contractibility cardíaca, e a remoção de intracelular Ca2 + é crítica para a função cardíaca diastólica. Sob algumas condições fisiopatológicas, tais como diabetes e insuficiência cardíaca, liberação de cálcio prejudicada e SR Ca2 + loja em cardiomyocytes podem estar envolvidos no progresso da disfunção cardíaca. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar SRCa2 + reserva e diastólica Ca2 + remoção. Brevemente, um único casos estava enzimaticamente isolado, e a intracelular Ca2 + fluorescência indicada pelo Fura-2 foi gravada por um sistema de imageamento de cálcio. Para empregar a cafeína para indução total SR Ca2 + lançamento, nós um programa de interruptor automático perfusão pré-estabelecido pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão. Em seguida, o encaixe de curva mono-exponencial foi usado para a análise de constantes de tempo de decaimento de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio. Nesse sentido, a contribuição do SR Ca2 +-ATPase (SERCA) e at+-Ca2 + trocador (NCX) para remoção de cálcio diastólica foi avaliada.
Cálcio intracelular ([Ca2 +]eu) reciclagem desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes1. Como sabemos, induzida por cálcio Ca2 + versão inicia o acoplamento, excitação-contração que traduzir o sinal elétrico para a contração. Despolarização da membrana ativa mecanismos L-tipo Ca2 + canais, que induzem Ca2 + lançamento do SR para o citoplasma via receptores ryanodine 2 (RyR2). Os transientes elevados citoplasmática Ca2 + inicia a contração das miofibrilas. Durante a diástole, citoplasmática Ca2 + é reuptaken para o SR mediante o SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) e bombeado fora os casos atravésdo nd+-Ca 2 + trocador (NCX)2. Este processo leva a reciclagem nos casos de contração-relaxamento.
O SR cardíaca é uma rede intracelular da membrana que rodeia a maquinaria contrátil. Ele serve como um reservatório de Ca2 + para a contração, e ele reabsorve intracelular Ca2 + durante o relaxamento. A SR Ca2 + reserva disponível para batidas é determinante para a contratilidade cardíaca. Entretanto, a remoção do intracelular Ca2 + é crítica para a diástole cardíaca. Sob algumas condições fisiopatológicas, loja em cardiomyocytes como diabetes e insuficiência cardíaca, prejudicada Ca2 + desembaraço e deprimido SR Ca2 + pode estar envolvida no processo de disfunção cardíaca2,3 ,4.
Para medir o SR Ca2 + liberação e diastólica Ca2 + remoção em cardiomyocytes, existem duas abordagens amplamente utilizadas: a integridade da corrente NCX baseado no remendo-braçadeira5,6e o Ca induzida por cafeína 2 + pulso baseado no Ca2 + fluorescência de imagem7,8,9. A primeira abordagem depende do fato de que o Ca2 + libertado o SR é largamente bombeado fora da célula por NCX. No entanto, essa abordagem é limitada pela sua exigência de equipamento avançado e hábil operação. No presente estudo, descrevemos uma abordagem conveniente para avaliar SR Ca2 + reserva e Ca2 + remoção em miócitos medindo induzida por cafeína Ca2 + pulso com base em um Ca2 + fluorescência sistema de imagem. Brevemente, intracelular Ca2 + fluorescência é indicada pelo Fura-2. Pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão, apresentamos um programa para mudar a perfusão e automaticamente o sistema de estimulação. cafeína de 10 mM foi empregada para induzir rapidamente total Ca2 + lançamento no Sr. As constantes de tempo de decaimento exponencial (Tau) de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio foram obtidas de mono-exponencial curva de encaixe, que refletem a contribuição da SERCA e NCX para remoção de Ca2 + diastólica em conformidade.
Fluxo de cálcio libertado o SR é a principal fonte de Ca2 + para sístole no coração. Em certa medida, a amplitude do SR Ca2 + conteúdo e o fracionário Ca2 + libertado o SR refletir SR Ca2 + reserva disponível para a contração cardíaca. Por outro lado, a Ca2 + reserva de SR depende da capacidade de recaptação de SR Ca2 + , Ca2 + vazamento de SR e seu equilíbrio através do SR durante a diástole12,…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), a medicina e saúde ciência programa da província de Zhejiang (n. º 201646246, Dongwu Lai) e a ciência de saúde e Plano de tecnologia da cidade de Hangzhou (n. º 2013A28, Ding Lin).
NaCl | Alfa Aesar | E31K43 | |
MgCl2 | Alfa Aesar | I02T070 | |
KCl | Alfa Aesar | G22u018 | |
HEPEs | Sigma | SLBM 7880V | |
D-Glucose | Alfa Aesar | 10189341 | |
NaOH | Alfa Aesar | 10154048 | |
KOH | Alfa Aesar | 10144B17 | |
KH2PO4 | Alfa Aesar | F21S033 | |
MgSO4 | Alfa Aesar | C31U038 | |
L-Glutamic | Alfa Aesar | 10149849 | |
Taurine | Alfa Aesar | J5407a | |
EGTA | Sigma | SLBM6826V | |
Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
Collagenase Type II | Worthington | 45k16005 | |
BSA | Roche | 735094 | |
caffeine | Sigma | C0750 | |
Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |