Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Aquí, describimos un protocolo para evaluar el Ca2 + reserva de retículo sarcoplásmico y función para eliminar calcio diastólico en los cardiomiocitos por un sistema de imagen de calcio.
Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Cardiaco retículo sarcoplásmico (SR) sirve como un depósito de Ca2 + para la contracción, que reuptakes intracelular Ca2 + durante la relajación. El SR Ca2 + reserva disponible para golpes es determinada para contractibility cardiaca, y la eliminación de Ca intracelular2 + es crítica para la función diastólica cardíaca. Bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes y la insuficiencia cardíaca, remoción de calcio deteriorada y SR Ca2 + tienda en cardiomiocitos pueden implicar en el progreso de la disfunción cardiaca. Aquí, describimos un protocolo para evaluar SRCa2 + reserva y diastólica Ca2 + extracción. Brevemente, un cardiomiocito solo fue enzimático aislado, y la intracelular Ca2 + fluorescencia indicada con Fura-2 se registró por un sistema de proyección de imagen del calcio. Para emplear cafeína para inducir total SR Ca2 + liberación, preselección de un programa de interruptor automático de la perfusión por la interconexión del sistema de estimulación y el sistema de perfusión. Entonces, la guarnición de curva exponencial mono fue utilizada para analizar las constantes de tiempo de decaimiento de calcio transitorios y pulsos de calcio inducida por la cafeína. En consecuencia, la contribución de la SR Ca2 +-ATPasa (SERCA) y Na+-Ca2 + cambiador (NCX) a quitar calcio diastólico se evaluó.
Calcio intracelular ([Ca2 +]) reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en cardiomiocitos1. Como sabemos, inducida por el calcio Ca2 + lanzamiento inicia la excitación-contracción de acoplamiento, que traducen la señal eléctrica a la contracción. Despolarización de la membrana activa lo sarcolemales Ca tipo L2 + canales, que inducen Ca2 + lanzamiento de SR en el citoplasma a través de receptores de Ryanodina (RyR2) de 2. La transitoria elevada citoplásmicas Ca2 + inicia la contracción de las miofibrillas. Durante el diástole, citoplásmicas Ca2 + es reuptaken en el SR con el SR Ca2 +-ATPasa 2 (SERCA2) y bombeado en el cardiomiocito a través de la Na+-Ca2 + cambiador (NCX)2. Este proceso conduce a la contracción y relajación de los cardiomiocitos.
El SR cardiaco es una red intracelular de la membrana que rodea la maquinaria contráctil. Sirve como un depósito de Ca2 + para la contracción, y reabsorbe Ca intracelular2 + durante la relajación. El SR Ca2 + reserva disponible para beats es determinada para la contractilidad cardiaca. Mientras tanto, la eliminación de Ca intracelular2 + es crítica para la diástole cardiaca. Bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes e insuficiencia cardíaca, alteración Ca2 + despacho y deprimido SR Ca2 + tienda en cardiomiocitos puede estar involucrado en el proceso de disfunción cardiaca2,3 ,4.
Para medir Ca SR2 + liberación y diastólica Ca2 + retiro en cardiomiocitos, hay dos métodos ampliamente utilizados: la integridad de la corriente NCX basado en abrazadera del remiendo5,6y el Ca inducida por la cafeína 2 + pulso basado en Ca2 + fluorescencia imagen7,8,9. Lo anterior depende el hecho de que el Ca2 + de la SR es en gran medida bombeada fuera de la célula por NCX. Sin embargo, este enfoque está limitado por sus requerimientos de equipo avanzado y experto. En el presente estudio, describimos un método conveniente para evaluar reserva de SR Ca2 + y Ca2 + retiro en miocitos mediante la medición de un inducido por cafeína Ca2 + pulso basado en un Ca2 + fluorescencia sistema de imagen. Brevemente, intracelular Ca2 + fluorescencia indica Fura-2. Por la interconexión del sistema de estimulación y sistema de perfusión, presentamos un programa para la perfusión y el sistema de estimulación automáticamente. cafeína 10 mM fue empleada para inducir rápidamente la total liberación de Ca2 + en el SR. Las constantes de tiempo de decaimiento exponencial (Tau) de calcio transitorios y pulsos de calcio inducida por la cafeína se obtuvieron de mono exponencial curva de ajuste, que reflejan la contribución de SERCA y NCX para diastólica Ca2 + retiro en consecuencia.
Flujo de calcio liberado de lo SR es el Ca2 + fuente principal para la sístole en el corazón. A cierto punto, la amplitud del SR Ca2 + contenido y el fraccionario Ca2 + de la SR reflejan el SR Ca2 + reserva disponible para la contracción cardiaca. Por otra parte, la Ca2 + reserva de SR depende de la capacidad de la recaptación de Ca SR2 + , Ca2 + fuga de SR y su equilibrio a través del SR durante diástole12,</s…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (no. 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), médico y salud ciencia programa de la provincia de Zhejiang (no. 201646246, Dongwu Lai) y las Ciencias de la salud y Plan de tecnología de la ciudad de Hangzhou (n º 2013A28, Ding Lin).
NaCl | Alfa Aesar | E31K43 | |
MgCl2 | Alfa Aesar | I02T070 | |
KCl | Alfa Aesar | G22u018 | |
HEPEs | Sigma | SLBM 7880V | |
D-Glucose | Alfa Aesar | 10189341 | |
NaOH | Alfa Aesar | 10154048 | |
KOH | Alfa Aesar | 10144B17 | |
KH2PO4 | Alfa Aesar | F21S033 | |
MgSO4 | Alfa Aesar | C31U038 | |
L-Glutamic | Alfa Aesar | 10149849 | |
Taurine | Alfa Aesar | J5407a | |
EGTA | Sigma | SLBM6826V | |
Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
Collagenase Type II | Worthington | 45k16005 | |
BSA | Roche | 735094 | |
caffeine | Sigma | C0750 | |
Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |