Summary
Vaskulära endotel styr tätt leukocyt rekrytering. Otillräcklig leukocyt extravasering bidrar till inflammatoriska sjukdomar. Söka efter romanen reglerande element av endothelial aktivering därför nödvändigt att utforma förbättrade terapier för inflammatoriska sjukdomar. Här beskriver vi en omfattande metod för att karakterisera roman endothelial regulatorer som kan ändra leukocyt människohandel vid inflammation.
Abstract
Den endothelial lagret är väsentliga för att upprätthålla homeostas i kroppen genom att kontrollera många olika funktioner. Regleringen av den inflammatoriska reaktionen av endothelial lagret är avgörande för att effektivt bekämpa skadliga ingångar och stöd i återhämtning av skadade områden. När endotelceller utsätts för en inflammatorisk miljö, såsom den yttersta delen av gramnegativa bakterier membran, lipopolysackarid (LPS), de express lösliga pro-inflammatoriska cytokiner, såsom Ccl5, Cxcl1 och Cxcl10, och utlösa de aktivering av cirkulerande leukocyter. Dessutom möjliggör uttrycket av adhesionsmolekyler E-selektin, VCAM-1 och ICAM-1 på endotelceller ytan interaktion och vidhäftning av de aktiverade leukocyter till endothelial lagret, och så småningom extravaseringen mot inflammerad vävnad. I det här fallet måste endotelfunktion regleras tätt eftersom överdriven eller defekta aktivering i leukocyt rekrytering kan leda till inflammatoriska-relaterade sjukdomar. Eftersom många av dessa sjukdomar inte har en effektiv behandling, måste nya strategier med fokus på vaskulär lager undersökas. Vi föreslår omfattande analyser som är användbara för sökning av romanen endothelial regulatorer som ändra leukocyt funktion. Vi analyserar endothelial aktivering med hjälp av specifika uttryck mål inblandning i leukocyt rekrytering (såsom, cytokiner, chemokiner och adhesionsmolekyler) med flera tekniker, inklusive: realtid kvantitativa polymerasen kedjar reaktion ( RT-qPCR), western-blot, flow flödescytometri och vidhäftning analyser. Dessa metoder bestämma endotelfunktion i samband med inflammatorisk och är mycket användbara för att utföra screening analyser för att karakterisera roman endothelial inflammatoriska regulatorer som är potentiellt värdefulla för att utforma nya terapeutiska strategier.
Introduction
Inflammation är ett fördelaktigt biologiska svar mot smittämnen, med stora målet att eliminera patogenen och reparera skadad vävnad. Under vissa förhållanden, till exempel kroniska infektioner eller autoimmuna sjukdomar, löser inte inflammation. I stället finns det en avvikande reaktion med kontinuerlig infiltration av leukocyter, vilket resulterar i en långvarig immunsvar som leder till vävnadsskada, fibros, förlust av funktion, och övergripande, funktionshinder och i vissa fall döden av patienten. Dessa mänskliga sjukdomar, katalogiseras inflammatoriska sjukdomar som, alla innebär att blodkärlen för kontroll av leukocyter extravasering1,2.
Endotelceller spela en grundläggande roll i regleringen av den inflammatoriska reaktionen genom att kontrollera leukocyt människohandel. När endothelial lagret utsätts för inflammatoriska mediatorer såsom LPS, vilande endotelet aktiverar och uttrycker pro-inflammatoriska cytokiner (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) och adhesionsmolekyler (E-selektin, VCAM-1 och ICAM-1) som tjänst rekrytering av cirkulerande leukocyter till webbplatsen infektion. Cellväggar Primas av den släppta cytokiner sedan medla rullande och interaktion med endothelial lagret genom de korrespondent självhäftande motsvarigheterna: PSGL-1 till selektin, α4β1-integrin till VCAM-1 och αLβ2 integrin till ICAM-1. Slutligen, cellväggar migrerar över vaskulatur mot fokus för inflammation3.
Den viktiga rollen som endotelet i regleringen av den inflammatoriska reaktionen har visats på möss som var genetiskt modifierad för att uttrycka den LPS-receptorn, toll-like receptor 4 (TLR4), endast på endotelceller. Dessa endothelial-TLR4 djur kunde svara en LPS-medierad inflammation och upptäcka infektionen genereras efter bakterier Inympning, och följaktligen uppnå infektion upplösning och överlevnad på liknande nivåer som vilda typ möss4 , 5.
För den endotel-reglerade inflammatorisk reaktion vägen, har det varit postulerade att hämning i vissa skeden av leukocyt-endotel interaktionen skulle resultera i en minskning av trans-endothelial migration och en bättre prognos för inflammatoriska sjukdomar. I själva verket har flera strategier inriktning endothelial aktivering och leukocyt-endotel interaktionen utformats för att hindra extravasering av immunceller som en behandling av inflammatoriska sjukdomar6,7.
I den här rapporten beskriver vi en grundlig grupp av in vitro- metoder för att fullständigt karakterisera aktiviteten endothelial svar på inflammatoriska stimulans LPS och dess roll i leukocyt aktivering och vidhäftning till vaskulär lager. Endotelcell modellen används i detta manuskript var raden mus lung endotelceller (MLEC-04), som beskrivs av Hortelano et al. 8. the MLEC-04 cellinje har validerats i litteraturen vara ett lämpligt system att studera endothelial aktiveringen9,10. Baserat på forskningsintressen, dessa synsätt kan lätt extrapoleras till alla endotelceller eller leukocyt system och inflammatoriska profil. När endothelial parametrarna i de markerade villkoren definieras, kan systemet testa nya läkemedel på den föreslagna experiment att utvärdera vaskulär aktiveringen. I sammanhanget inflammatoriska endotel cellerna testade med sammansatta av intresse kan jämföras med villkoren kontroll av celler, och alla resulterande skillnader kan informera drogens prognostiska resultatet på utveckling och progression av inflammation. Sammanfattningsvis föreslår vi ett relevanta system för att karakterisera nya läkemedelsmål till endotelceller, vilket kan påverka utformningen av romanen vaskulär-specifika behandlingar mot inflammatoriska sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. endothelial cellkultur
- vävnadsodling behandlade plattor
- Coat 100 mm vävnadsodling plattor med 2,5 mL gelatin lösningen (autoklaveras, 0,1% gelatin i destillerat vatten) under 30 minuter vid 37 ° C, detta kan extrapoleras till formatet krävs väl. Aspirera gelatin lösningen och lämna plattor lufttorka i vävnadsodling huven.
- Vävnadsodling villkor
- odla MLEC-04 cellerna inuti en biologisk inkubator (37 ° C, 95% luftfuktighet, 5% CO 2). Odla cellerna i komplett media av Dulbecco ' s ändrad Eagle Medium: näringsämne blandning F-12 (DMEM/F-12) kompletteras med 10% fetalt bovint Serum (FBS) och 100 enheter/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin (P/S).
- Räkna cellerna enligt standardmetoden Neubauer kammare, och lägga till MLEC-04 cellerna i 100 mm gelatin-behandlade plattorna i 10 mL komplett media, på en låg densitet på 2-11 x 10 4 celler/cm 2. Dela upp cellerna 1:3 när de når sammanflödet.
Obs: Ofta detta sker efter två till tre dagar i kultur. - Subkultur cellerna genom att tvätta plattorna med 10 mL sterilt fosfat buffrad saltlösning (PBS) följt av att lägga till 2 mL trypsin-EDTA-lösning (0,25% trypsin, 5 mM EDTA) och Inkubera under 3 minuter vid 37 ° C.
- Stoppa trypsin-EDTA reaktionen och återställa de suspenderade cellerna genom att tillsätta 10 mL komplett media. Snurra ner cellerna (300 x g, 5 min), Kassera supernatanten, Återsuspendera cellulära pelleten i komplett medie- och subkultur lämpligt.
2. LPS behandling och medlare
- plåt MLEC-04 cellerna i komplett media på sub confluence till följande väl format: 7 x 10 5 celler per brunn på 6-bra plattor och 2,5 x 10 5 celler per brunn på 96 brunnar.
- Inkubera kulturen för 6 h i en cell inkubator (37 ° C, 95% luftfuktighet, 5% CO 2). Växla cellerna till ofullständig media (DMEM-F12, P/S) och lämna över natten (på) att synkronisera och minska cellaktivitet.
- Ta bort materialet och testa nya farmakologiska föreningar genom ruvning endotelceller med (eller utan) läkemedlet i fråga (t.ex. DT 10) utspätt i ofullständig media (30 min, 37 ° C); lägga till 1,4 mL/bra för 6-well platta eller 0.14 mL per brunn för plattor med 96 brunnar).
- Utmana cellerna genom att lägga till LPS inkubation media (100 ng/mL, slutlig koncentration) för tidsperioden som anges i varje analys. Använda PBS som en kontroll.
3. Utvärdering av transkriptionell profil på aktiveras endotelet av RT-qPCR
- utsäde med MLEC-04 celler på sub confluence i 6-väl kultur plattor (7 x 10 5 celler per brunn). Inkubera i 6 h (37 ° C, 95% luftfuktighet, 5% CO 2) och därefter vidare till serum svält (Inkubera ON).
- Ta bort media och behandla (eller inte behandla) endothelial cellen kulturer med drogen av intresse utspädd i ofullständig media (Inkubera 30 min, 37 ° C); lägga till 1,4 mL/bra för 6-well plate (30 min, 37 ° C).
- Utmana cellerna genom att lägga till 100 ng/mL LPS ruvade media (som beskrivs i steg 2,3) och inkubera för 6 h. stoppa reaktionen genom att tvätta två gånger med kallt PBS och hålla plattor vid-80 ° C tills provet bearbetning.
- RNA-extraktion
- Tina plattorna och tillsätt 1 mL per brunn RNA extraktion buffert (38% fenol och 0,8 M guanidinium isotiocyanat; se tabell material). Låt verka i 30 min i rumstemperatur (RT) under agitation och samla Homogenatet i 1,5 mL rör.
- Tillsätt 200 µL kloroform och gnugga försiktigt i 15 s. Inkubera i 3 min vid RT och centrifugera (11,600 x g, 15 min, 4 ° C).
- Överför vattenfasen till en annan 1,5 mL tub. Fällningen RNA genom att lägga till 500 μl isopropanol följt av en 10 min inkubation vid RT och sedan centrifugering (11 600 x g, 4 ° C).
- Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med 75% etanol av vortex agitation och sedan centrifugering (7 500 x g, 4 ° C).
- Lufttorka pelleten och solubilize RNA i 25 µL ren H 2 O genom inkubation under 10 minuter vid 55 ° C. Håll RNA vid-80 ° C tills provet bearbetning.
- Kvantitet och renhet av RNA
- kvantifiera den RNA-koncentrationen genom att mäta absorbansen av provet vid 260 nm i en spektrofotometer (se Tabell för material).
- Mått på 230 nm och 280 nm till bestämma RNA renheten.
Obs: Förhållandet på 260/280 indikerar protein eller fenol kontaminering. En kvot nära 2 är acceptabelt. Nyckeltalet på 260/230 visar EDTA, kolhydrater eller fenol föroreningar. Värden mellan 2.0-2.2 är godtagbara.
- Kontrollera RNA integritet
- Run 2 µg av total-RNA och en RNA stege på en 1,5% denatureringen agarosgel; visualisera på en geldokumentationssystem (se Tabell för material).
Obs: Förhållandet 2:1 av klar och skarp 28S och 18S rRNA band indikerar en intakt RNA. Delvis förstörd RNA löser som en kladdig utseende.
- Run 2 µg av total-RNA och en RNA stege på en 1,5% denatureringen agarosgel; visualisera på en geldokumentationssystem (se Tabell för material).
- RT-qPCR
- syntetisera kompletterande DNA (cDNA) från en enda dubbelsträngat RNA efter standard protokoll (se Tabell för material) 11.
- Utvärdera genuttryck av RT-qPCR
- förbereda reaktionsblandningen för varje prov: blanda 2 µL cDNA, 7 µL fluorescerande förening, 300 nM framåt primer och 300 nM reverse primer (tabell 1) i en slutvolymen av 13 µL, och lägga till plattan med 96 brunnar i reaktion (se Tabell för material).
- Tätning plattan med en optisk självhäftande täcker, centrifug (300 x g, 1 min) och köra reaktionen på en Real-Time PCR System (varmstart 95 ° C under 20 s följt av 40 cykler: 95 ° C för 3 s och 60 ° C under 30 s) (se Tabell för material).
- Analysera resultaten av relativ kvantifiering med den komparativa metoden 2 -ΔΔCt med städning gener glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) eller sura ribosomal phosphoprotein P0 (36B4) 12 .
4. Bedöma Endothelial aktivering av flödescytometri
- behandla MLEC-04 cellerna efter de förhållanden som beskrivs i avsnitt 2 och utvärdera förändringarna i de endothelial ytbehandlaproteinerna av flödescytometri.
- Koppla cellerna efter 6 h av LPS stimulering med trypsin-EDTA metoden som beskrivs i steg 1.2.3 och tvätta med ofullständig media vid 4 ° C.
- Räkna cellerna med metoden Neubauer kammare och placera 10 x 10 4 celler i u-bottenplåtar med 96 brunnar. Centrifugera (300 x g, 5 min) och Kassera supernatanten av en 180° knäppa av handleden från topp till botten och snabb återhämtning till ursprungspositionen.
- Tillsätt 50 µL av den valda antikroppen utspätt i ofullständig media (10 µg/mL, slutlig koncentration) till cellerna och inkubera (30 min, 4 ° C).
- Tvätta cellerna dubbelt wITH ofullständig media enligt anvisningarna i steg 4,3 och inkubera med 50 µL 10 µg/ml av motsvarande sekundär antikropp kopplat till FITC eller ett liknande konjugat (30 min, 4 ° C i ett mörkt utrymme).
- Tvätta cellerna en gång med ofullständig media följt av en PBS-tvätt. Återvinna cellerna med 300 µL PBS med 1 mL pipettspetsar och placera i flödescytometri rör.
- Utvärdera proverna i systemets flöde flödescytometri (se Tabell för material). Justera cell befolkningen av framåt och sida scattering parametrar. Utfärda utegångsförbud för befolkningen av intresse. Justera gates baserat på den negativa kontrollen från cellerna inkuberas med isotypen kontroll. Analysera resultatet som procentuella andelen positiva celler eller menar fluorescens intensitet 8.
5. Utvärdera Endothelial aktivering genom Western Blot
- frö endotelet på sub confluence i 6-väl kultur plattor (7 x 10 5 celler per brunn) och behandla med LPS som beskrivs i avsnitt 2. Analysera inflammatoriska proteinet uttrycket genom följande western blot protokoll.
- Stoppa LPS stimulering vid olika tidpunkter att belysa olika aspekter av endothelial svar:
- fastställa den inflammatoriska proteiner profilen efter 6 h av LPS stimulering.
- Bestämma den cell signalering varje 15 min genom en 60 min period.
- i båda fallen stoppa reaktionen genom att tvätta två gånger med kallt PBS och lagra proverna vid-80 ° C tills provet bearbetning.
- Lyse celler och protein utvinning
- tillsätt 200 µL lysis buffert till varje brunn (1% icke-jonisk tensid, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM natriumklorid, 30 mM natrium pyrofosfat, 50 mM natriumfluorid, 2,1 mM natrium orthovanadate på pH 7,6, kompletterat med proteashämmare cocktail) (se tabell material).
- Inkubera 15 minuter vid 4 ° C under agitation, skrapa brunnar med en pipettspetsen och samla Homogenatet i 1,5 mL tuber.
- Centrifugera rören vid 11 600 x g vid 4 ° C.
- Lagra supernatanten i ren 1,5 mL rör vid-80 ° C tills bearbetning.
- Åtgärd protein koncentrationen av bicinchoninic syra analysen efter standard protokoll (se tabell material) 13.
- Lösa den 30 µg totalt protein lysate för varje prov genom standard tekniken med 0,1% sodium dodecyl sulfate, 10% polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) 14. Köra prover med 10 mM β-merkaptoetanol (reducerande förhållanden) eller utan (icke-reducerande förhållanden) beroende på den antikropp som används för att detektera proteinet av intresse.
- Överföra de separerade proteinerna från Polyakrylamidgelen till ett polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) överföring membran med 0,45 µm porstorlek använda standardproceduren.
- Efter överföring, tvätta membranet två gånger med PBS, 0,1% polysorbat-20 (PBS-T) och blockera ospecifik bindning webbplatser genom att lägga till 20 mL 2% BSA utspätt i PBS-T för upptäckta phosphoproteins eller 5% fettfri torr mjölk i PBS-T för totala proteiner, under agitation (90 min, RT).
- Späd valda antikroppen i 10 mL av det lämpliga blockerande buffert vid den rekommendera koncentrationen och inkubera membranet under agitation (ON, 4 ° C). Alternativt placera membranet i förslutna plastpåsar och används 5 mL av den utspädda antikroppen.
- Nästa dag, tvätta membranet tre gånger (överskott PBS-T, 15 min, RT).
- Inkubera membranet under agitation (30 min, RT) med 10 mL av korrespondent sekundär antikropp bunden till pepparrotsperoxidas (HRP) utspätt till 1:10,000 i den lämpliga blockeringsbuffert.
- Tvätta membranet tre gånger under agitation (överskott PBS-T, 15 min, RT).
- Inkubera membranet för 1 min med 0,1 mL/cm 2 av peroxidas substrat enhanced chemiluminescence (ECL). Placera den avrunna membranen mellan två transparenta plastskivor, och infoga det i upptäckande av chemiluminescence som inkluderar en Charged-Coupled enhetens kamera (CCD).
- Använda CCD kameran för att detektera signalen och dess programvara för att spela in bilder med ackumulerande program (bilder Visa ackumulerade signal vid varje 30 s exponering under totalt 15 min).
- Kvantifiera bandet intensiteten av densitometry med programmet ImageJ efter protokollet beskrivs i användar guide 15.
- Öppna provet i ImageJ programvaran och välj bandet av intresse med rektangulära markeringsverktyget.
- Välj som den första lane och tryck på Rita körfält för att få profilen tomterna.
- Avgränsa området i topparna med linjär markeringen.
- Mäta storleken på varje band genom att klicka på insidan av varje topp.
- Representerar resultaten när det gäller lastning protein kontroll (β-aktin, tubulin, etc.).
6. Utvärdera Endothelial-faktor som släppt från leukocyt aktivering genom vidhäftning analyser
- få endothelial luftkonditionerade media.
- Behandla MLEC-04 cellerna som anges i avsnitt 2 och samla kulturen supernatanten efter 24 h stimulering med LPS (100 ng/mL).
- Samla luftkonditionerade media från behandlade MLEC-04 cellerna och centrifugera (600 x g). Hålla supernatanten i 0,5 mL alikvoter vid-80 ° C fram till användning.
- Leukocyt vidhäftning assay
- Coat 96 brunnar plattorna med 50 µL per brunn av valda extracellulära matrix proteiner utspätt i PBS (med undantag av kollagen, vilket är utspätt i 0,1 M ättiksyra): Fibronektin (1-10 µg/mL ), laminin (1-10 µg/mL) och kollagen typ I (10-40 µg/mL). Lämna på vid 4 ° C.
- Kassera belagda media och blockera ospecifikt bindningsställen på brunnar med 150 µL PBS, 1% BSA Värmeinaktiverade (1 min, 100 ° C) för 90 min på RT.
- Tvätta brunnarna två gånger med PBS och tillsätt 100 µL av tidigare insamlade endothelial luftkonditionerade medier (avsnitt 6.1) till brunnarna.
Obs: Plattorna är redo för att utföra vidhäftning analysens. - Kultur mus monocyt-makrofag cell raden J774 i en biologisk inkubator (37 ° C, 95% luftfuktighet, 5% CO 2) med Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
Obs: De J774 cellerna växa i suspension. - Samla in de J774 cellerna i en 15 mL rör och centrifugera (300 x g, 5 min). Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellulära pelleten med 10 mL serum-fria medier. Räkna cellerna i en Neubauer kammare. Centrifugera cellerna (300 x g, 5 min), avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i serumfritt media på 15 x 10 4 J774 celler per 50 µL media.
- Lägg till 15 x 10 4 J774 celler till var väl i 50 µL serum-fria medier och inkubera i 15 minuter vid 4 ° C följt av 1 h vid 37 ° C i CO 2 cell inkubatorn.
- Tvätta brunnarna två gånger, försiktigt genom att lägga till varma PBS; Centrifugera (300 x g, 5 min) och Kassera supernatanten genom ett 180° kick av handleden från topp till botten och snabb återhämtning till ursprungsläget. Fixa den bifoga cellens genom att tillsätta 100 μl/brunn av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS och inkubera (10 min, RT).
- Kasta media försiktigt och permeabilize cellerna med 2% metanol i PBS för 2 min på RT. Ignorera media försiktigt och färga cellerna genom att lägga till 50 µL per brunn av 0,5% kristallviolett i 20% metanol för 90 s vid RT.
- Tvätta plattan med rikligt med rinnande vatten, kasta den överflödig vätskan och låt den lufttorka. Anmäl bifogade cellerna av digital kamera kopplad till ett ljusmikroskop.
- Späd cellen färgning genom att tillsätta 100 μl/brunn av 0,1 M natriumcitrat, 50% etanol. Mäta absorbansen vid 545 nm och representerar resultaten som godtyckliga enheter av absorbansen eller andelen vidhäftning genom att betrakta 100% som celladhesion nådde till brunnar belagda med högre ligand koncentration
7. Testa Endothelial aktivering av leukocyt-endotel samtidig vidhäftning Assay
- behandla MLEC-04 celler med 96 brunnar som beskrivs i avsnitt 2 och inkubera med LPS (6 h, 37 ° C).
- Fluorescently etikett J774 celler med Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE).
- Tvätta J774 cellerna i PBS följa proceduren i 6.2.5. Räkna cellerna av Neubauer kammare metod och resuspendera på 1 x 10 6 celler/mL i PBS, 0,1% BSA.
- Inkubera cellerna med CFSE (5 µM, slutlig koncentration) under 20 minuter vid 37 ° C. Tillsätt 5 mL ofullständigt media och inkubera (5 min, 4 ° C).
- Tvätta en gång med ofullständig media som förklaras i 6.2.5. Omsuspendera på 15 x 10 4 celler/100 µL och vidare till samtidig vidhäftning analysen.
- Efter endotel behandlingen, Tvätta brunnarna tre gånger med ofullständig media. Lägga till CFSE-J774 celler (15 x 10 4 celler/100 µL) i varje endothelial-belagd väl. Inkubera plattan för 10 minuter vid 4 ° C följt av 60 minuter vid 37 ° C.
- Tvätta brunnarna försiktigt, som beskrivs i 6.2.7., använda värmde PBS och rapportera J774 vidhäftning till endothelial lagret av följande två metoder:
- Lyse celler i 0.1 M Tris-HCl pH 8,8, 1% SDS (100 µL per brunn) och mät den CFSE-J774 signal av fluorometry (excitation/utsläpp = 492 nm/517 nm). Representerar resultaten som godtyckliga enheter av fluorescensintensiteten eller andelen vidhäftning med avseende på positiv kontroll (signal från totala celler lagt till varje brunn).
- Fixa cellerna i 4% PFA och rapport fastsättning av CFSE-J774 cellerna till endotelet genom att visualisera i fluorescens Mikroskop (excitation/utsläpp = 492 nm/517 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvärdering av LPS-inducerad endotelceller aktivering av RT-qPCR
Serum som svalt MLEC-04 cellerna stimuleras av 100 ng/mL av LPS för 6 h och endotel genuttrycket bedömdes med hjälp av RT-qPCR genom att jämföra uttrycket av aktiveringen markörer i villkoret vilande. Som visas i figur 1A, inducerad LPS ruvade MLEC-04 cellerna mRNA uttryck för valda adhesionsmolekyler som är inblandade i leukocyt rekrytering under den inflammatoriska responsen (E-selektin, VCAM-1 och ICAM-1). PECAM-1 användes som intern kontroll eftersom uttrycket är oförändrad under denna experimentell behandling. Figur 1B representerar endothelial aktiveringen av LPS mätt det ökat mRNA-uttrycket av cytokiner Ccl5, Cxcl10 och Cxcl1. Dessa molekyler är inblandade i aktiveringen av cirkulerande leukocyter, inbegripet deras handel till endothelial lagret och senare extravasering till webbplatsen inflammation. Cytokin, IL4, användes som intern kontroll under denna experimentell behandling.
Figur 1: utvärdering av LPS-inducerad endothelial cells aktivering av RT-qPCR. Den MLEC-04 celler stimuleras med 100 ng/mL av LPS för 6 h (röda staplar) jämfört med villkoret kontroll (blå staplar) och genuttrycket analyserades av RT-qPCR. Diagrammen visar vik induktion av mRNA med avseende på villkoret kontroll av valda endothelial adhesionsmolekyler (A) och cytokiner (B) involverade i leukocyt aktivering och rekrytering under den inflammatoriska reaktionen. PECAM-1 och IL4 användes som negativa kontroller enligt detta villkor. Resultaten uttrycks som menar ± SEM från ett experiment, av tre utförs, utförs i tre exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Proteinuttryck av adhesionsmolekyler på LPS-behandlade endotelceller
Inflammatorisk stimulering utfördes på MLEC-04 cellerna som beskrivs i föregående avsnitt och proteinuttryck undersöktes med western blot teknik. Vilande endotelet presenterar nästan omätbara nivåer av adhesionsmolekyler VCAM-1 och ICAM-1 (märkt som-). I närvaro av LPS (+) är endotel aktiveras fenotypen uppenbart av uppreglering av uttrycket av de beskrivna markörerna (figur 2). Membranen var normaliserade av β-aktin identifiering, som användes som lastning kontroll för att beräkna den relativa band täthet efter densitometry analys.
Figur 2: proteinuttryck av adhesionsmolekyler på LPS-behandlade endotelceller. Representativa western blot utvärderande VCAM-1 och ICAM-1 proteinuttryck i vila (-) jämfört med LPS-behandlade (+) MLEC-04 celler. Β-actin användes som en lastning kontroll. Molekylvikten för varje protein är inom parentes. Värdena representerar semi kvantifiering av relativa bandet tätheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Endothelial yta markörer i LPS-medierad inflammation
Endothelial aktiveringen i samband med inflammatoriska utvärderades av flödescytometri efter 6 timmars-stimulering av LPS (100 ng/mL). I detta tillstånd utvärderades detektion av lim-relaterade molekyler som är inblandade i leukocyt interaktion. Den vänstra panelen i figur 3A representerar basala uttryck av de angivna markörerna i vilande MLEC-04 cellerna (röd-solid histogram) jämfört med den isotyp negativa kontrollen (svart-prickig histogram). Den högra panelen av figur 3A visar resultaten härrör från stimulerad MLEC-04. LPS behandling betydligt uppreglerad uttrycket av adhesionsmolekyler E-selektin, VCAM-1 och ICAM-1 i plasmamembranet (röd-solid histogram) jämfört med de vilande tillståndet (svart-prickig histogram). Som visas i flödescytometri profiler och citerade tidigare, ett uttryck för PECAM-1 är oförändrat i detta experimentella villkor. Figur 3B visar kvantifiering värdena används som referenser för att utvärdera möjliga mediatorer av endothelial inflammatoriska reaktionen. procent: andelen positiva celler; MFI: menar fluorescensintensiteten.
Figur 3: Endothelial yta markörer i LPS-medierad inflammation. Flow flödescytometri profiler av Celladhesionmolekylar på vila och LPS-stimulerad MLEC-04 celler. Den vänstra panelen visar proteinuttryck i vilande celler (Antigen märkt-röd histogram) med avseende på kontrollen isotypen matchas (Ctrl-svart histogram). Den högra panelen jämför kontroll cellytan protein uttrycket (svart histogram) med LPS-behandlade endotelceller (röda histogram). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Signalvägar som utlöses av LPS stimulering i endotelceller
Mekanismerna som är involverade i vaskulära facket aktivering vid inflammation undersöks genom att utvärdera viktiga signalmolekyler. MLEC-04 cellerna stimuleras med LP-skivor under olika perioder har bearbetats för protein utvinning och graden av aktiveringen analyserades med western blot teknik. Figur 4 visar att den IκB-α repressor av NF-κB signalering är fosforyleras efter 15 min LPS-inkubation, och återgår till basala nivåer efter 1 timme. Däremot, LPS aktiverar ERK 1/2 signalering efter 15 min, som fastställer en viktig väg inblandade i endotel aktivering under den inflammatoriska reaktionen. Membranen var av β-aktin eller ERK normaliserade 1/2 upptäckt, som användes som lastning kontroller för att beräkna den relativa band täthet efter densitometry analys.
Figur 4: signalering vägar utlöses av LPS på endotelceller. MLEC-04 cellerna stimuleras med 100 ng/mL av LPS för tider anges i figuren och signalvägar som ERK 1/2 (P-ERK 1/2) och NF-kB (genom P-IκBα) utvärderades genom western blot. ERK 1/2 totalt och β-aktin användes som laddar kontroller i varje skick. Molekylvikten för varje protein är inom parentes. Värdena representerar semi kvantifiering av relativa bandet tätheter. Vänligen klicka här för att visa en större version avDenna siffra.
Förordning av leukocyt uppförandet av endotel stimuleras med LPS
Den biologiska relevansen av regleringen av endothelial aktivering på utvecklingen av den inflammatoriska reaktionen bestäms av funktionella analyser av leukocyt prestanda. Som beskrivs i avsnittet protokollet, ingår två olika metoder för att testa leukocyt funktion regleras av endotelceller. Även om analyserna förhöra olika aspekter av den inflammatoriska reaktionen (RT-qPCR för endothelial cytokiner släppt av leukocyt aktivering och western blot för endothelial adhesionsmolekyler interaktionsytan leukocyt), är uppgifterna båda utvärdera mikroskopiska Detaljer leukocyt fastsättning. Leukocyt aktiveringen av endothelial lösliga faktorer är avgörande för utvecklingen av en effektiv inflammatorisk reaktion, eftersom det gynnar celladhesion till flera substrat. Figur 5A visar J774 celladhesion till 0,5 µg/mL Fibronektin belagda brunnar som svar på tidigare insamlade luftkonditionerade medier från kontrollen eller LPS behandlas endotelceller. Ljusa fält bilder och spektrofotometrisk mätningar visar att de faktorer som släppt i konditionerat media från LPS-behandlade endotelet är tillräckligt effektivt inducera J774 aktivering, vilket framgår av induktion av cell fastsättning Fibronektin. Figur 5B representerar en samtidig vidhäftning test att utvärdera möjligheten av vaskulär lager att stödja leukocyt fast vidhäftning av romanen uttrycket av endothelial adhesionsmolekyler. Kort, MLEC-04 cellerna stimuleras med LPS för 6 h serum svultit subconfluent kulturer var tvättas flera gånger och co inkuberas med leukocyt linjen J774 tidigare märkt med fluorescerande sond, CFSE. Som visas i micrographs och spectrofluorometric mätningar, gynnar LPS-vaskulär stimulering samverkan mellan CFSE-J774 celler till den endothelial enskiktslager.
Figur 5: leukocyt interaktion till LPS-inkuberas endothelial enskiktslager av samtidig vidhäftning assay. (A) ljusmikroskopi bilder visar kristallviolett färgning av J774 celler bifogas 0,5 µg/mL Fibronektin belagda brunnar i svar till luftkonditionerade medier från kontrollen eller LPS-behandlade endotelceller. Skalstapeln, 50 µm. Spektrofotometrisk analysen nedan visar absorbansen mätningen uttryckt som godtyckliga enheter (a.u.) ± SEM för en representativ experiment som körs i tre exemplar. (B) fluorescens micrographs Visa bifogas den kontroll eller de LPS-behandlade MLEC-04 celler utvärderas av samtidig vidhäftning test CFSE-J774 celler. Skalstapeln = 50 µm. Fluorometric analysen nedan visar fluorescensintensiteten uttryckt som godtyckliga enheter (a.u.) ± SEM för en representativ experiment som körs i tre exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mål | NCBI RefSeq ID | Vidarebefordra sekvens (5´-3´) | Omvänd sekvens (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | ACT GTG GAT GGC CCC TCT GG3 | TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG |
| 36B4 | NM_007475.5 | AGA TGC AGC AGA TCC GCA T | GTT CTT GCC KATT CAG CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | CAA AGC ATC CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT GAG GAA TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG CAG CTG CCC TCA CC | TCT TGA ACC CAC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA TGC AAG CTG AA | CTG TAC AGC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | AGT GCA GCA AGA CTC TGG TAC CTA | AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G | GGG KATT CAC TTC TAC CAG GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC CAG |
| E-selektin | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ATG ACG AGA GA | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA GA | CCG ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | CCG CTA CCA TCA CCG TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
Tabell 1: Lista över primers som används i denna studie.
| Vila | LPS | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| CTRL | 1,79 | 3.5 | 0,55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12.09 | 37,82 | 12,24 |
| E-selektin | 17.12 | 8,06 | 88.13 | 49.84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20.51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM-1 | 99,76 | 114.81 | 99,82 | 363.89 |
Tabell 2: Endothelial yta markörer i LPS-medierad inflammation. Kvantifiering av cell adhesion molekyler uttryck i vila och LPS-stimulerad MLEC-04-celler av flödescytometri Flödesanalys. Representativa värden för varje markör som motsvarar andelen positiva celler (%) och medelvärdet fluorescensintensiteten (MFI) i vila och LPS-stimulerad endotelceller. PECAM-1 användes som en negativ kontroll under dessa försöksbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta endothelial protokollet beskriver en stegvis teknik som skapar grunden för att utforska nya mekanismer som är involverade i regleringen av den inflammatoriska reaktionen. Dessa metoder är baserade på studien av aktiviteten endotelceller stimuleras av LPS och utvärdera de kritiska steg involverade i leukocyt rekrytering under den inflammatoriska reaktionen, specifikt: endothelial cytokiner release, endothelial vidhäftning molekyler uttryck och leukocyt vidhäftning till vaskulär lager. När parametrarna endotelceller är etablerade, systemet kan söka efter nya föreningar deltar i regleringen av endotelfunktion och följaktligen inflammatoriska förlopp. De reglerande läkemedel kan vara av intresse för den farmaceutiska marknaden. Stora projektionen av detta sekventiella protokoll är att upprätta en stiftelse för att utvidga dessa studier till olika endothelial och stimulerande villkor genom att anpassa till deras relativa vaskulär aktivitetsparametrar.
Droger som valts av denna screening utgör intressanta kandidater för att utforma nya terapeutiska strategier mot inflammatoriska sjukdomar. Dels, kommer de föreningar som gynnar den endothelial svaren och bidra till leukocyt rekrytering vara lovande för immunbrist villkorar16,17. Däremot, skulle de endothelial hämmare utgöra utmärkta behandlingar för kroniskt inflammatoriska sjukdomar10.
Karakterisering av de cytokiner som uttryckts av stimuleras endotel förutsäger utvecklingen av inflammationen. Cytokiner är små proteiner som släpptes av endothelial lagret i samband med inflammatorisk och reglera starkt leukocyt beteende. Pro-inflammatoriska medlemmar, såsom Ccl5, Cxcl10 och Cxcl1, binda till deras specifika receptorer på leukocyt ytan och signalerar inducera leukocyt interaktion med de nyligen uttryckt adhesionsmolekyler på vaskulär lager (E-selektin, VCAM-1 och ICAM-1), och leukocytmigration till de patologiska område (figur 1, figur 2, figur 3)8,10,18. Andra medlemmar av samma familj av proteiner är involverade i resolutionen av inflammation och följaktligen vävnad reparera. Uttrycket av dessa anti-inflammatoriska cytokiner är relevant för kroniska inflammatoriska sjukdomar eftersom de förhindrar leukocyt rekrytering och gynna immunitet clearance10,19,20. Markera möjligt endothelial inflammatoriska tillsynsmyndigheter, rekommenderas det att utföra denna cytokin uttryck analys och utvärdera den endothelial vidhäftning molekyler intresseanmälan i närvaro av föreningarna. I själva verket analysera nivåerna mellan antiinflammatoriska kontra pro-inflammatoriska cytokiner kan användas som ett prediktivt värde för sjukdomsförloppet och avslöjar drogen av terapeutiskt intresse21.
LPS bindande till dess cell surface receptor utlösare komplexa Intracellulär signalering cascades leds av karta kinaser ERK 1/2, JNK, och p38 och de NF-kB signalosome för att inducera inflammatoriska transkriptionell programmet. Många av dessa vägar är gemensamma för andra inflammatoriska stimuli såsom TNF-α eller IL-110,22. Endothelial aktiveringen bestäms genom att upptäcka fosforylerad form av karta kinase medlemmarna som visas för ERK 1/2 i figur 4. Dessutom endothelial aktiveringen av LPS inducerar enzymatisk aktivitet av IKKβ komplex, som phosphorylates och försämrar den NF-kB-hämmaren komplexa IκB, vilket möjliggör NF-kB effektor medlemmar av translokationen i cellkärnan att utföra korrespondent transkriptionell aktivitet (figur 4). Karakterisera de mekanismer som påverkar drog föreningen den endothelial inflammatoriska reaktionen är mycket användbart, inte bara beskriva drogen, men också i utforma nya inflammatoriska behandlingar i kombination med kompatibla konventionella behandlingar 23.
Föreningar valt från de endothelial inflammatoriska screening analyserna, måste studeras vidare för att bekräfta deras funktionella relevans i de kritiska steg av leukocyt beteende analyser, som i slutändan cellerna är ansvarig för de inflammatoriska sjukdomar. Dessa analyser analysera aktiviteten leukocyt i två olika experimentella inställningar. Först är att utvärdera rollen av endothelial-släppt cytokiner på leukocyt aktivering av integrin-medierad vidhäftning analyser. De leukocyt integriner är aktiveras av den endothelial släppt cytokiner. Således, leukocyt självhäftande förmåga att integrin ligander är en representativ mätning för leukocyt funktion8,10,18. Andra är i studerar roll för de nyligen uttryckt endothelial adhesionsmolekyler på leukocyt interaktionen till vaskulär lager av samtidig vidhäftning analyser. De endothelial adhesionsmolekyler uttryckt i samband med inflammatoriska är viktigt för leukocyt rekrytering till omgivande vävnad. Analysera de leukocyter som interagerar med den endothelial-behandlade enskiktslager av celler utgör således, ett prognostiska värde för inflammatoriska progression (figur 5)8,10,18. De resultat som härrör från dessa synsätt skulle föreslå att de utvalda föreningarna är allvarliga kandidater i utformningen av framtida strategier för behandling av inflammatoriska sjukdomar
Den experimentella förslag som definieras här är ett mångsidigt verktyg för framtida tillämpningar på grund av dess förmåga att extrapolera till olika cellulära eller stimulerande system. Förfarandet kan ändras till endotelet från olika ursprung eller arter och för att testa dess funktionalitet på flera immunceller, liksom olika inflammatoriska ämnen såsom TNF-α, virus, bakterier, LPS, etc. Som beskrivs i texten, måste forskarna först präglar endothelial aktiveringen i sina egna system för att senare karaktärisera rollen av en vald förening på den inflammatoriska responsen. Begränsningar i protokollet är valet av ett lämpligt negativ kontroll och definiera exakt endothelial aktivitetsparametrar att urskilja de vila från tillståndet stimuleras. Ifall de förhållanden som beskrivs i detta dokument inte fungerar för ett annat system, måste forskare felsöka de experimentella parametrarna genom att utföra ytterligare tidsberoende analyser och använder en koncentrationsgradient av inflammatoriska stimulans att definiera en stimulerande fönster som tillåter för att testa nya läkemedel för reglering av den inflammatoriska reaktionen.
Avslutningsvis rekommenderas detta endothelial inflammatoriska protokoll för sökning av nEW endothelial regulatorer inriktning den inflammatoriska reaktionen. Utför den här processen kommer att ge roman, intressanta föreningar som kan tillämpas på studera dess framtida tillämpningar och utforma innovativa vaskulär-specifika behandlingar mot inflammatoriska sjukdomar, och som potentiellt skulle kunna vara av intresse för den farmaceutiska marknaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) och Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (licensnummer IERPY 1149/16 att A.L.; MPY 1410/09 till S. Hortelano); av MINECO genom de Fondo de Investigación en Salud (FIS) (bidrag nummer PI11.0036 och PI14.0055 till S. Hortelano). S. Herranz stöddes av IERPY 1149/16 från ISCIII.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
